Knockdown ESCRT-III (Chmp4A/Chmp4B/Chmp4C/Chmp6/Chmp7) 對促進 EBV 病毒

促進 EBV 病毒的釋出

已知主要扮演膜剪切功能的 ESCRT component 是 ESCRT-III 這群蛋 白 (Guizetti, et al. 2011)，於是首先將以 ESCRT-III 蛋白作為 screening test 的候選者，篩選對於EB病毒複製或釋出影響的 component 。同時亦 可分別 knockdown Chmp4 (A、B、C) 蛋白，以觀察是否有代償性表現上 升而促進病毒釋出量的情形。將 NA 細胞用 shRNA 病毒感染兩天後，以 puromycine 篩選五天，利用 Rta 質體轉染使EB病毒進入融裂期，在細胞 核內複製並表現病毒蛋白，於西方墨點法分析(圖七A)，當 knockdown Chmp4A、Chmp4B、Chmp4C、Chmp6 或 Chmp7 時，並不影響誘導後病 毒蛋白的表現量。以 real-time PCR 偵測細胞內 EBV DNA copy number，

和 shLuc control 相比較，當 Chmp4B、Chmp4C 被 knockdown 時，細胞 內的 copy number 無明顯差異(圖七B)，至於 knockdown Chmp4A、

Chmp6 或 Chmp7 時，會使細胞內的 copy number 略為上升。至於細胞 外以培養液純化的核酸，利用 real-time PCR 偵測並且和 shLuc control 相 比較(圖七C)，當Chmp6、Chmp7 被 knockdown 時，以 Rta 誘導會使細 胞外的 EBV copy number 和 shLuc 無明顯差異，而當 Chmp4A、

Chmp4B、Chmp4C knockdown 時，誘導後細胞外的 copy number 比 shLuc 分別高出約2.5倍、1.5倍、2.5倍。由此可以說明 Chmp4 會影響EB 病毒的釋出，當分別 knockdown Chmp4 (A、B、C) 蛋白，可能會使其他 兩種蛋白代償性表現上升而促進病毒釋出量，需再測試 Chmp4 的

knockdown 效率如何並且是否會使其他兩種蛋白表現量上升，以說明此推 論。

3.8

Vps4A、Chmp1B、Chmp2B 或 Chmp3 的 NA 細胞以 puromycine 篩選 五天後，利用 Rta 質體轉染使EB病毒進入融裂期，利用西方墨點法分析 病毒蛋白表現量 (圖八A)，當 Vps4A、Chmp1B、Chmp2B 與 Chmp3 knockdown 時，並不影響誘導後病毒蛋白的表現量。以 real-time PCR 偵 測細胞內 EBV DNA copy number，和 shLuc control 相比較，當 Chmp1B 與 Chmp2B knockdown 時，細胞內的 copy number 類似(圖八B)，至於 knockdown Vps4A 與 Chmp3 時，會使細胞內的 copy number 略為上升。

另外，也去純化細胞外培養液病毒核酸，利用 real-time PCR 偵測並且和 shLuc control 相比較，當 Vps4A、shChmp2B、Chmp3 knockdown時，誘 導後細胞外的 copy number 比 shLuc 分別高出約6倍、11倍、2倍，但當 Chmp1B knockdown時，以 Rta 誘導會使細胞外的 EBV copy number 比 shLuc 反而下降2倍多(圖八C)。NA細胞 knockdown Chmp1B 時，對於 Rta 誘導後仍能完成細胞核內複製並表現病毒蛋白，但成熟殼體系出細胞 的的數量極低， knockdown Chmp1B 後對EB病毒的影響如同預期，

Chmp1B 蛋白不會影響EB病毒的複製，僅會影響EB病毒於細胞內外的運 輸，使EB病毒釋出量下降 。

綜合圖六、圖七、圖八的一次性實驗結果顯示，ESCRT-III蛋白雖不影 響EB病毒的複製，一旦 knockdown Chmp2B、Chmp4A、Chmp4B、

Chmp4C、及 Vps4A，會促進成熟EB病毒殼體釋出細胞，反觀 Chmp1B 則會使EB病毒釋出量下降，為了更確定本實驗的現象是否確切，後續實驗 需再以 RT-PCR 確定 ESCRT 的 mRNA 表現量。

3.9 建立細菌表現重組蛋白His-BFRF1及以變性環境的純化系統

為了後續實驗可能需要探討到 BFRF1 蛋白質晶體結構，或者利用純 化蛋白生成特異性高、親和性高的抗體。在研究過程同時亦利用細菌表現 重組蛋白的方法，分別將質體 pRSET-6x His-BFRF1/pRSET-6x

His-BFRF1-dTM 轉形 (transform) 至 E.coli BL21 表現，分別測試在加入 IPTG 後以 30℃ 及 37℃ 不同誘導溫度下，蛋白質的表現量(圖九A)，pRSET-6x His-BFRF1-dTM 在誘導溫度 37℃ 下，表現量較高且比較不會有雜蛋白，故 後續純化實驗皆以表現 BFRF1-dTM 蛋白的細菌執行實驗。利用 TB 培 養液大量表現的 BFRF1-dTM 蛋白主要表現於細菌內涵體，因此以 Lysis Buffer 與超音破震盪儀打破細菌細胞壁及染色體，配合 membrane protein wash buffer 及 DNA wash buffer 潤洗內涵體並去除細菌內的大部分蛋白 質。再將內涵體融入含有 8M urea buffer 中，使蛋白質變性融出內涵體，

以 nickel beads 進行親和性結合純化。利用 buffer pH 改變，當 pH 低於 蛋白質等電點時會使蛋白質帶正電，而使蛋白與鎳離子(帶正電)分開而流 出，得以用此原理純化蛋白。在這過程 His-BFRF1 需要pH值=3時，方能 得到較為純淨的蛋白質(圖九C)。另外，亦以西方墨點法分析，配合 anti-BFRF1 抗體偵測，能在 urea buffer 中偵測為純化前的 anti-BFRF1 蛋白訊 號，接上 nickel beads以buffer 潤洗過程中都沒有 BFRF1 流出，直至 buffer pH 低於蛋白質等電點，Elution buffer 3 (pH=4)、Elution buffer 4 (pH=3) 中偵測到 BFRF1 蛋白訊號，因此得到純化後的 BFRF1 蛋白。利 用此純化 BFRF1 病毒蛋白系統，未來可進一步純化大量的病毒蛋白。