探討 BFRF1 與ESCRT 模組在EB 病毒出核時所扮演的角色與機制

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國立台灣大學醫學院微生物學所微生物及免疫學組碩士論文

Graduate institute of Microbiology College of Medicine

National Taiwan University Master Thesis

探討 BFRF1 與 ESCRT 模組在 EB 病毒出核時所扮演的角色與機制

The role of BFRF1 and cellular ESCRT components in regulating the nuclear egress of Epstein-Barr virus

莊詒捷 Yi-Jie Juang

指導教授：陳美如博士 Advisor: Mei-Ru Chen, Ph.D.

中華民國 105 年 7 月 July, 2016

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致謝

還記得兩年前初次踏入台北這個陌生城市時，帶著行李箱，俗裡俗氣的進

到 EBV 這個大家庭。很感謝美如老師願意包容我的實驗精神，屢次嘗試錯誤享受實驗結果的酸甜苦辣，讓我自己嘗試做出最好的魚桿，而不是讓我平白無故地得到美味可口的魚，也像媽媽一樣叮囑我們要多出外踏青，享受生活保持健康。亦感謝我的口試委員：林素芳老師、劉雅雯老師、李重霈老師，給予我許多寶貴建議，當我實驗滯礙難前時，一路替我披荊斬棘，因為有各位老師的協助與愛護，才能使我的碩班研究多采多姿。

感謝美慈學姊，擁有溫柔的外表、強悍的心臟，總是能很有耐心的教導實驗室的每個大朋友小朋友，替我們處理各種雜事、心事，忍受詒捷偶爾的人來瘋，大呼小叫地耍猴戲，還要幫我們發聲出氣抵擋討人厭的壞朋友。感謝櫂杬學長，一直對我發出甜食攻擊，彌補小小脆弱心靈，也謝謝你常在我們得意忘形之際，給一記當頭棒喝讓我能迅速振作。美慈姐和櫂杬兄如同 R720 的慈母嚴父，照顧我們一家子平安順利的長大。

感謝薺萱和亭瑋美女陪伴我的實驗室生活，兩年內有你們的陪伴，一起哭一起笑一起追韓劇，跟著我一起當肖婆，一起和 105 屆同學製造許多美好回憶，走過宜蘭、花蓮、台東、東北角、林口、基隆，一起認真玩認真做實驗。

感謝唯逸、晏慈、宜君，雖然你們很雷一直挨我罵，不過貼心如你們，總是在我準備報告煩躁之際，偷偷塞小紙條給我加油打氣，幫我們團購許多美食，也製造了很多笑話，期待三位小女警，有機會透過繪本的方式記錄研究生的生活，再分我一點版稅。

到 24 歲的這年，一路成長有許多人的幫助，亦有許多無名人士默默地在照顧著我們，如無名男子提供我恰好缺少的一塊錢，每天溫暖道早安的公車司機，幫助微生物所環境整潔的秀娟阿姨，解決疑難雜症的助教們，半夜跟我講醫學院電梯鬼故事的警衛，各家廠商銷售專員，還有我記不得名字但曾經幫助過我的各家實驗室學長姊，謝謝各位溫暖的台灣人，有你們世界變得更美好。

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摘要

當 EB 病毒進入宿主細胞後，其線型 DNA 會進到細胞核內成為環型結構，當病毒於細胞內呈潛伏期時，其 DNA 會隨著細胞週期進行複製。當病毒進入溶裂期複製，病毒 DNA 在核內完成複製與殼體組裝後成為核殼體，會藉由出核複合體 BFRF1/BFLF2 促進核殼體由細胞核穿越核膜並釋出至細胞質。

實驗室先前證明 BFRF1 會透過 Alix 吸引 ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) 膜剪切模組幫助 BFRF1 產生核模衍生液泡 (nuclear envelope-derived vesicle) 以加速核殼體出核。由於 ESCRT 系統是由三十多個成員串連而執行功能，已知參與細胞內膜的剪接運輸及多種病毒的成熟過程。

對於 ESCRT 如何參與核膜結構的改變仍只有少數研究報導，因此在本論文中首先探討 BFRF1 如何利用其不同功能區域吸引 Alix 並將核膜塑形產生核膜衍生液泡。同時利用不同 ESCRT 成員的 shRNA 使其表現量下降，以探討那些 ESCRT 膜剪切蛋白成員會參與在 EB 病毒核殼體出核的過程。為了之後得到大量的 BFRF1 蛋白質以建構抗體，本論文也嘗試建立大腸菌產生的重組 BFRF1 蛋白質表現系統。本論文之結果發現 (I)在共免疫沉澱試驗中發現 BFRF1 會分別利用 LD1 (8-65 a.a) 與 ESR (180-313 a.a) 和 Alix 的 Bro (1-358 a.a)及 PRR (703–868 a.a) 功能區域結合。當 BFRF1 這兩個區域的刪除或是點突變會影響到細胞內 Alix 的分布及 BFRF1 產生核膜衍生液泡的能力。(II)同時也利用含有 EB 病毒的鼻咽癌上皮細胞 NA 觀察，以 shRNA 病毒使

ESCRT 表現量下降時，會影響釋出細胞的病毒數量。(III)利用大腸桿菌表現大量重組 BFRF1 蛋白，可用於生產高專一性的抗體，以探討 BFRF1 在 EB 病毒核殼體出核過程的路徑與機制。這些發現將有助於了解 BFRF1 在調控核膜塑形上的分子機制。

關鍵字：

EB 病毒、BFRF1、核膜衍生液泡、出核過程、Alix、ESCRT

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Abstract

Upon its entrance into the cell, the linear EBV genome is injected into the nucleus and becomes circular episomes, which can be maintained in these cells during latent infection. When virus is induced into lytic replication, the replicated viral genomes are packaged into procapsids to form nucleocapsids in the nucleus before translocated into the cytoplasm for subsequent maturation process. The nuclear egress complex (NEC) composed of BFRF1 and BFLF2 can facilitate the budding of nucleocapsids across the nuclear envelope (NE). Previously, our laboratory demonstrated that BFRF1 interacts with Alix to recruit ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) machinery to induce nuclear envelope-derived vesicles for promoting nuclear egress. ESCRT machinery is composed of at least 30 proteins to mediate membrane scission and cytoplasmic budding of various virus. How the ESCRT system is involved in modulating nuclear envelope structure is just immerging.

Therefore, in the first part of this study, we intend to define how the viral membrane protein BFRF1 recruits Alix and the functional domains required for nuclear

envelope-derived vesicle formation. Secondly, a shRNA approach is used to

knockdown individual ESCRT components to examine the participation of different ESCRT components in EBV nuclear egress or mature virion secretion. Bacterially expressed recombinant BFRF1 protein expression system was used to obtain purified BFRF1 for generating antibody. Three different aspects of BFRF1 is achieved in this study. (I) Co-immunoprecipitation results showed that LD1 (8-65 a.a ) and ESR (180- 313 a.a) domains of BFRF1 interacted with Alix Bro (1-358 a.a) and PRR (703-868 a.a), respectively. Site-directed mutagenesis of LD1 or ESR in BFRF1 reduced BFRF1 induced vesicle formation and affected cellular Alix subcellular distribution.

(II) shRNA targeting various ESCRT components were used in EBV positive epithelial cells NA, the preliminary data indicate that knockdown of ESCRT components does affect virion release but not viral DNA replication. (III) A bacterially recombinant BFRF1 protein was expressed and purified for generating highly specific antibody to study the intracellular trafficking of BFRF1 during EBV nuclear egress process. Overall, this study will help to reveal the molecular

mechanisms of BFRF1-mediated budding and scission of EBV nuclear egress vesicles.

Keywords:

Epstein-Barr virus (EBV)、BFRF1、nuclear envelope-derived vesicles、nuclear egress、Alix、ESCRT machinery

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1. 序論

1.1 EB病毒(Epstein-Barr virus)

1.1.1 EB病毒與疾病

EB病毒屬於 Herpesviridae 疱疹病毒科中 Gamma-herpesvirinae 次病毒科，lymphocryptovirus 病毒屬，又稱人類疱疹病毒第四型 (HHV-4) (for a review, (McGeoch, et al. 2006))。1958年英國外科醫師 Denis Burkitt 在非洲發現一種好發於小孩頭頸部的淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma)

(Burkitt 1958)。在1964年由Epstein、Achong、Barr等人在Burkitt’s淋巴瘤培養分離的細胞中以電子顯微鏡發現EB病毒顆粒 (Epstein, et al. 1964)，

故以該等人命名為 Epstein-Barr virus，同時也是第一個被發現與人類腫瘤相關的病毒。人類是這種病毒的主要天然宿主，盛行率高，全世界有高達百分之九十以上的人類被感染，大部分無明顯症狀。因為病毒可以透過唾液傳染，特稱為親吻病 (kissing disease)。大部分的人類早在幼兒時期即被感染，在幼兒期被感染者無症狀者居多(Biggar, et al. 1978)，倘若是在青少年時期感染患者易引發傳染性單核球增多症 (infectious mononucleosis) (Henle, et al. 1968)，被感染後終其一生EB病毒都會潛伏於體內 (W. S. Tsai, et al. 1989)。此外，EB病毒也被認為與許多人類惡性腫瘤形成具有高度相關性，包含鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma) (Old, et al. 1966)、巴氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤 (Hodgkin’s lymphoma) (Weiss, et al. 1989)、T細胞淋巴瘤 (T cell lymphoma) (Jones, et al. 1988)以及胃癌 (gastric carcinoma) (Burke, et al. 1990)。

1.1.2 EB病毒基因體與結構

EB病毒顆粒直徑約為130-150 nm，由外而內的結構為外套膜-披膜蛋白質-病毒殼體-病毒核酸。外套膜 (envelope) 來自宿主細胞核膜的磷脂質雙層外套膜，帶有醣蛋白突起 (glycoprotein spike)。介於套膜與殼體之

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間存在許多披膜蛋白質 (tegument protein)，病毒殼體則由162個次蛋白衣 (capsomer) 所組成，包裹著病毒核酸 (for a review, (Longnecker 2013))。

EB病毒基因體約為172 kbp雙股 DNA，GC含量比高達60%，在病毒殼體內呈現線狀結構。感染宿主後潛伏於宿主細胞中則呈現環狀的游離質體狀態 (episomal form)，是透過基因組中特殊的兩端的尾端重複序列 terminal repeats，TR) 連接形成環狀 (Kuppers 2003)，會表現出大約100 多種病毒蛋白質。

於1984年，Baer 等人利用 B95-8 細胞所產生的病毒株揭示限制酶圖譜，他們利用 BamHI 限制酶將 DNA 片段大小按英文字母大寫 A-Z 排列，更小的片段則英文字母小寫 a-f 命名(Baer, et al. 1984)，在利用開放閱讀架的轉錄方向和順序編列數字，以此標準制訂出EB病毒基因名，

以BFRF1 為例，即表示病毒基因體經 BamHI 限制酶切割後(B)，

片段大小為第六片段(F)，右向(R)第一段(1)開放閱讀架，已知EB病毒約有85開放閱讀架 (open reading frame，ORF)。

1.1.3 EB病毒生活史

目前已知人類為EB病毒唯一宿主，主要感染人類的 B 細胞、

T 細胞以及上皮細胞 (Sixbey, et al. 1983)，其生活史可分潛伏期 (latent stage)與溶裂期 (lytic stage) (for a review, (Longnecker 2013))。EB病毒於B 細胞中多以潛伏期的狀態存在，有理論提出說病毒會視宿主免疫能力而定伺機轉為溶裂期，使咽部上皮細胞與唾液中的病毒量上升，再次感染新宿主。

EB病毒可藉由唾液傳播感染咽部上皮細胞，在由咽部淋巴結或韋氏環淋巴組織 (Waldeyer's ring) 轉而感染淋巴附近的 B 細胞 (Tugizov, et al. 2013)，EB病毒感染上皮細胞需要至少三個病毒蛋白協助

(Chesnokova and Hutt-Fletcher 2014)，以膜融合 (membrane fusion) (Sorem

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and Longnecker 2009)或胞移作用 (Transcytosis) 的方式侵入細胞 (Tugizov, et al. 2013)。然而，EB病毒感染 B 細胞時需要五個病毒蛋白、兩個宿主細胞蛋白 (Chesnokova and Hutt-Fletcher 2014)，外套膜具有醣蛋白 gp350/220 會與 B 細胞的 CD21，並配合醣蛋白 gH、gL、

gB，以及 gp42 結合宿主 HLA-II，將 HLA-II 作為輔因子以內吞作用感染 B 細胞 (Miller and Hutt-Fletcher 1992; Q. Li, et al. 1997)。當病毒成功感染細胞後，上皮細胞可透過細胞微管

(microtubules)、細胞骨架 (actin cytoskeleton)；B 細胞僅需要細胞微管 (microtubules) 的協助，將病毒移動到宿主細胞核 (Shannon-Lowe, et al.

2009; Valencia and Hutt-Fletcher 2012)。

病毒移至宿主細胞核時，由核孔將病毒核酸注入細胞核內 (Johnson and Baines 2011)，隨著宿主細胞 DNA 同步複製 (Yates, et al. 1985)。可分為潛伏期 (latent stage) 和溶裂期 ( lytic stage)。當病毒以潛伏 (latent stage) 狀態存在，過程中最多僅表現11個基因產物以維持EB病毒於細胞內 (Young and Rickinson 2004)。可透過化學藥物 12-0-

tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)、sodium butyrate (SB) (zur Hausen, et al. 1978)，物理性 UV 照射，或是利用抗免疫球蛋白抗體 (anti-human Ig) 刺激 B 細胞 (Tovey, et al. 1978)，以及於細胞內表現病毒蛋白轉活化子 (transactivator) Zta 及 Rta (Mauser, et al. 2002)，皆可促使EB病毒再活化並進入溶裂期，依照病毒蛋白表現先後順序可分為三個時期：

(1) 特早期 (immediate early, IE)：此時期會表現病毒轉活化子

(transactivator) Zta (BZLF1) 以及 Rta (BRLF1) 是主要調控溶裂期的關鍵角色 (Miller, et al. 2007)，可單獨或協同活化許多早期基因的表現 (for a review, (Longnecker 2013))。

(2) 早期 (early, E)：早期所表現出的蛋白，多為幫助EB病毒複製的蛋

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白，例如：BALF2 單股 DNA 結合蛋白 (single strand DNA binding protein, SSB)、BALF5 DNA 聚合酶 (DNA polymerase)、BBLF4 解旋酶(helicase)、BSLF1 導引酶 (primase)、BMRF1 DNA 聚合酶輔助因子 (DNA polymerase processivity factor, PPF) (for a review, (Münz 2015))。

(3) 晚期 (late, L)：EB病毒晚期時表現約36種晚期蛋白質 (Yuan, et al.

2006)，由晚期基因調控子 (late gene regulator) BcRF1 (TATA box binding protein like protein, TBP like protein) 及 BGLF4 (EBV-encoded serine/threonine kinase) 調控表現 (Aubry, et al. 2014; El-Guindy, et al.

2014)。在此時期主要表現病毒結構蛋白質 (structure protein)、醣蛋白以及披膜蛋白，例如：病毒外殼抗原 (viral capsid antigen, VCA)、膜抗原 (membrane antigen, MA) 以及套膜上的醣蛋白 gp350、gp42等等晚期病毒蛋白質 (Dolyniuk, et al. 1976)，會影響著病毒殼體的成熟與組裝，甚至是新病毒感染進程與貼附 ( for a review, (Münz 2015))。

病毒釋放核酸物質進入核內複製，表現出病毒早期及晚期蛋白質，此時會在細胞核內先組裝成未成熟的病毒核殼體(nucleocapsid)，在金染色電子顯微鏡實驗分析中發現，BORF1 和BDLF1 蛋白質位在EB病毒核殼體上，證實了EB病毒殼體是由 BORF1 和 BDLF1 等病毒殼體蛋白質組成。

另外，BORF1 和 BDLF1 會形成類似於人類單純疱疹病毒 ( Human simplex virus-1, HSV-1)中 VP19C 和 VP23 蛋白質所組成的 triplex 結構，並且 triplex 可以幫助連繫殼體上的次蛋白衣 (capsomer)，促進病毒二十面殼體的形成 (Wang, et al. 2011)。核殼體具有液晶密度壓力 (liquid crystalline density) 能讓病毒核酸進入核殼體內 (Johnson and Baines 2011)。

再透過病毒出核複合體 (nuclear egress complex) BFRF1/BFLF2 的協助 (Blossom Damania 2009)，將病毒核殼體送至細胞質，推測在此以類似

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HSV-1方式獲得披膜蛋白，藉由反式高基氏網 (trans-Golgi network, TGN) 或細胞膜 (plasma membrane) 做最後的套膜化 (envelopment) (Granzow, et al. 2001)。

1.2 疱疹病毒顆粒出核過程(nuclear egress)

1.2.1 核膜結構

細胞核膜由內外雙層磷脂質組成，分別稱為內核膜及外核膜 (inner and outer nuclear membrane)，內外核膜間具有空隙稱膜核周腔

(perinuclear space) (Mettenleiter, et al. 2013)，核膜上鑲嵌著核孔複合體 (nuclear pore complex, NPC)，核孔複合體由30幾種核孔蛋白

(nucleoporin, Nup) 組成，可以做為細胞核質間的運輸屏障，控制大分子物質的進出 (Hoelz, et al. 2011; Suntharalingam and Wente 2003)。細胞內核膜的內層還有 nuclear lamina (V型中間絲, type V intermediate filament) 作為膜內網狀支撐結構(C. P. Lee, et al. 2007; C. P. Lee and M. R. Chen 2010)。因為EB病毒 DNA 完成複製，組裝好核殼體後，會將核殼體(約 115-130 nm)運至細胞質，首先穿過微小的 nuclear lamina 間隙 (約15 nm) (C. P. Lee and M. R. Chen 2010)，以及細胞核核孔，核孔直徑僅約40 nm，因此核殼體 (nucleocapsid) 無法直接由核孔運出，對病毒來說直接出核是一大挑戰。

在先前研究利用電子顯微鏡發現，EB病毒的成熟核殼體會以兩種形式出核，一是由內質網 (endoplasmic reticulum) 出核，內質網獲得套膜，特點是具有較平滑的套膜。另一方式則是藉由細胞分裂時核膜較為鬆散，EB病毒顆粒藉機出核，伺機脫逃的EB病毒顆粒未套膜化，因此再由細胞質空泡膜(cytoplasmic membranes of vacuoles)或高基氏體(Golgi network)套膜化，特點則是具有較厚且粗糙的套膜(Seigneurin, et al.

1977)。之後也有其他研究團隊近一步研究指出，疱疹病毒的出核機制可

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能具有高度相似性，在這部分 Alphaherpesviruses 較具完善的研究，

Betaherpesviruses 和 Gammaherpesviruses 則與 Alphaherpesviruses 相比的話僅有些微不同 (Johnson and Baines 2011)。Alphaherpesviruses 主要是以連續性的初次套膜化-去套膜化-二次套膜化 (primary envelopment – de-envelopment – re-envelopment ) 使核殼體穿越核膜(附圖一)，進而完成出核過程 (nuclear egress) (Johnson and Baines 2011; Mettenleiter 2002;

Mettenleiter, et al. 2009)。

1.2.2 疱疹病毒利用蛋白質激酶促使 nuclear lamina結構鬆散，促使核殼體出核 Alphaherpesviruses 表現病毒激酶 Us3 和 UL13 (Mettenleiter, et al.

2009)，其他疱疹病毒亦具有同源蛋白激酶，如人類巨細胞病毒 (human cytomegalovirus, HCMV) 的 UL97 (Hamirally, et al. 2009)、EB病毒的 BGLF4 (Lee, et al. 2008)以及卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒 (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV) 的 ORF36 (Park, et al. 2000; Park, et al. 2007)，這幾個病毒激酶皆可藉由激酶活性磷酸化 nuclear lamina ，使 nuclear lamina 結構重新分布並更加鬆散、薄化，有助於核殼體出核 (Hertel 2011)。

1.2.3 初次套膜化(primary envelopment)

在 Alphaherpesviruses - HSV會表現病毒出核複合體 (nuclear egress complex) 蛋白 UL34/UL31，這兩個蛋白會在病毒溶裂期早期表現 (Blossom Damania 2009)。UL34 蛋白會聚集形成六聚體 (hexamer) 晶體結構，再由 UL31 蛋白質 N 端二級結構形成的鉤子 (hook)，與 UL34 重複的兩段β螺旋結構交互作用，而共同聚集於核膜邊緣(nuclear rim) (Bigalke and Heldwein 2015; Y. E. Chang and Roizman 1993)。當

UL34/UL31 與 lamin A/C 結合時，可以競爭掉 lamin 蛋白間的交互作用，對 nuclear lamin 產生局部性穿孔效果 (Reynolds, et al. 2002)，使結

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構更加鬆散，有助於核殼體接觸內核膜 (INM) (Muranyi, et al. 2002)。此外，出核複合體可以辨認成熟的病毒核殼體，利用 UL31 將病毒殼體帶到內核膜 (INM)，以出芽 (budding) 的方式進到核周腔。在EB病毒的部分亦有同源出核複合體 BFRF1/BFLF2，會促使核膜結構改變，並和 Lamin B 結合，以促進 EB病毒的出核(Blossom Damania 2009; Farina, et al. 2005; Gonnella, et al. 2005)。

1.2.4 去套膜化 (de-envelopment)

病毒核殼體進入核周腔後要再穿越外核膜(ONM)，穿越外核膜時病毒核殼體會將套膜去除，前面有提到 HSV 出核複合體 UL34/UL31 會和殼體結合，並一起運行至核周腔，但另有研究指出以免疫螢光顯微鏡觀察，細胞質內的殼體並沒有偵測到出核複合體的訊號，表示出核複合體會被滯留於外核膜(Fuchs, et al. 2002)。

1.2.5 二次套膜化 (secondary envelopment or re-envelopment)

順利移至細胞質的病毒核殼體，會在細胞質可以得到披膜蛋白，例如：EB病毒披膜蛋白 BPLF1 (具有deubiquitinases的活性) (van Gent, et al.

2014)。被披膜蛋白完整包覆的核殼體，會與細胞質內的網狀胞器結合，

例如內質網 (endoplasmic reticulum)、高基氏體 (Golgi apparatus)、反式高基氏網 (trans-Golgi network) (Harley, et al. 2001; Wisner and Johnson 2004)。二次套膜化的 HSV病毒，套膜上就具有各式醣蛋白 gE–gI、

gD、gB、gH–gL (Johnson and Baines 2011)，細胞內的液泡會將套膜化殼體運送至細胞膜，與細胞膜融合後病毒顆粒即被釋出細胞外 (Johnson and Baines 2011; Mettenleiter 2002; Mettenleiter, et al. 2009)。前人曾以電子顯微鏡觀察 B95-8 B細胞，EBV 病毒醣蛋白 gp110 會表現在細胞核膜上及細胞內質網，也是少數一個醣蛋白可以進到內核膜的蛋白，但不會與核內未成熟的核殼體結合，gp110 在核膜及內質網上扮演的功能為

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協助EB病毒核殼體出核，推論當缺乏 gp110 會影響病毒殼體出核的效率，以及會影響核殼體的組裝與成熟(Gong and Kieff 1990; Lee and Longnecker 1997)，因此gp110這醣蛋白不但扮演著幫助EB病毒感染細胞的功能，還可以調控EB病毒核殼體的組裝與成熟。

1.3 BFRF1 及其同源蛋白質

1.3.1 BFRF1 在α型疱疹病毒的同源蛋白質 (UL34)

在細胞內轉染 UL34/UL31 質體，可同時表現 UL34/UL31 使細胞內核膜結構衍生出液泡，須兩個病毒蛋白同時存在才能有液泡的產生 (Klupp, et al. 2007)。在EB病毒的部分，雖然 BFRF1/BFLF2 與

UL34/UL31 是同源蛋白質扮演相似的功能，但在EBV僅需要單獨表現 BFRF1 即可觀察到產生衍生液泡的功能。在哺乳類細胞中，以轉染方式表現 BFRF1 會有細胞膜增生的情形 (Luitweiler, et al. 2013)。此外，我們實驗室先前研究證明了， BFRF1 能透過 ESCRT 膜剪切機制調整核膜結構(C. P. Lee, et al. 2012)。

1.3.2 BFRF1 蛋白質在EB病毒中的發現與功能

Faggioni 研究團隊觀察到在含有 EB 病毒的細胞株 Akata、Raji、

B95-8 B 細胞或是口腔毛狀白斑上皮細胞 (oral hairy leukoplakia)，利用化學藥物 TPA/SB 等方法促進 EB 病毒進入溶裂期，BFRF1 病毒蛋白都主要表現在核膜上 (Farina, et al. 2004)。當 BFRF1 C 端的穿膜功能區被刪除時，

會減少病毒產量，表示 BFRF1 的穿膜功能及正確坐落 (locate) 於內核膜上的能力對病毒釋出很重要 (Farina, et al. 2004)。此外， Delecluse 研究團隊建構一個 BFRF1 缺失的病毒細胞株，以電子顯微鏡觀察，發現當缺乏 BFRF1 病毒蛋白表現，會使病毒核殼體累積於細胞核內，影響病毒釋出感染新細胞，使得感染效率下降 (Farina, et al. 2005)，表示 BFRF1 對病毒殼體的運送及成熟組裝很重要，進而影響病毒釋出及感染效率。

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1.4 BFRF1 衍生液泡結構可能與 ESCRT 膜剪切機制相關

1.4.1 ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport)

ESCRT膜剪切模組約30種蛋白組成，蛋白間可連續性的結合與作用，

主要分為五大群，ESCRT-0、-I、-II、-III 和 associated proteins，可以調整及剪接膜狀結構。目前顯著的研究多與內吞體 (endosome)形成許多腔內液泡 (intraluminal vesicles, ILVs)的多液泡囊體 (multivesicular bodies, MVB)相關 (Hanson and Cashikar 2012)。ESCRT 膜剪切機制最早的起源是在古生菌的細胞分裂期中發現。隨著目前的研究資料顯示，酵母菌、哺乳類動物到人類皆具有 ESCRT，因此，ESCRT 在演化上具高度保留性，證明了其對生物的重要性 (Samson and Bell 2009)。ESCRT 模組在人類細胞中發現可以維持穩定細胞核完的完整性，在核纖層蛋白綜合症(laminopathies)的情況下，會使 ESCRT 作用不正常，導致肌肉營養不良和早老症狀(Hatch and Hetzer 2014; Munoz-Alarcon, et al. 2007; Sundquist and Ullman 2015)。

在細胞中多液泡囊體 (MVB) 形成為例，可以說明 ESCRT 系統的作用方式。為了將細胞內的廢物清除，會將受損的蛋白質回收分解以做為製造新產物的原料，以減少細胞的能量耗損。細胞內的 ESCRT-0 蛋白會與泛素化的胞膜蛋白 (ubiquitinated membrane proteins) 連接形成一個作用平面 (Katzmann, et al. 2001; Raiborg, et al. 2001; Sachse, et al. 2002; Samson and Bell 2009; Wideman, et al. 2014)，吸引 ESCRT-I 和ESCRT-II 幫該處的胞膜做折疊與塑形，關鍵的 ESCRT-III 會形成彈簧樣纖維使細胞膜彎曲，由將芽胞連結 (budding site) 掐斷 (pinch off)。接著 ESCRT associated 蛋白

─ VPS4 (vacuolar protein sorting 4) 則具有 AAATPase 的活性，可使全部的ESCRT 蛋白在膜剪切活動結束之後，蛋白間的聯結被打斷，ESCRT 蛋白離開作用平面，因而生成了囊泡 (Guizetti, et al. 2011; Raiborg and Stenmark 2011)。

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到目前為止被認為與 ESCRT 膜剪切模組相關的有：(1)多液泡囊體 (MVB) 形成、(2)人類免疫缺陷病毒的釋出 (human immunodeficiency virus, HIV budding) (Demirov, et al. 2002; Garrus, et al. 2001; Guizetti, et al. 2011;

Martin-Serrano, et al. 2001)、(3)哺乳類細胞分裂 (mammalian cytokinesis) (Carlton and Martin-Serrano 2007; H. H. Lee, et al. 2008; Morita, et al. 2007)、

(4)EB病毒的出核 (EBV nuclear egress) (Lee, et al. 2012) (5)在細胞分裂後的細胞核膜修復 (nuclear envelope sealing) (Olmos, et al. 2015; Vietri, et al.

2015) ，在不同的情況下，所需要的 ESCRT 蛋白種類不同，並不需要全部的 ESCRT 蛋白都參與。以 HIV 為例，僅需要 ESCRT-I、ESCRT-III 和 VPS4等associated 蛋白 (Prescher, et al. 2015)。

1.4.2 BFRF1 和 Alix 的結合並與核膜產生衍生液泡

2012 年本實驗室研究團隊，在對於 ESCRT 膜剪切機制與 EB 病毒的研究中，發現 ESCRT 連結蛋白 Alix (apoptosis-linked gene-2 interacting protein X )會與病毒蛋白 BFRF1 結合。當以 siRNA 使 Alix 表現量下降時，會使 BFRF1 衍生液泡減少。亦利用 GFP-Chmp4B dominant negative plasmid 送入 NA 細胞(含 EB 病毒的鼻咽癌上皮細胞)，會使釋出的 EB 病毒 copy number 下降，因而發現另一個 ESCRT 蛋白 Chmp4B (Chromatin modifying protein 4B) 可以幫助 EB 病毒釋出。因此，我們研究團隊認為 BFRF1 產生衍生液泡與 ESCRT 相關 (Lee, et al. 2012)。

1.5

研究目的

在 HIV 的研究中發現， Gag 蛋白會利用 Late domain 功能區含特定胺基酸序列組合白胺酸-任意兩種胺基酸-白胺酸-苯基丙胺酸(LXXLF) (Jouvenet, et al. 2011)。本實驗室的成員將預測區段的作刪除及突變，將改造後的基因送入細胞表現，發現特別是將 ⁶¹VYKFLAFKL⁶⁹ 突變為

61AAKFAAFKA⁶⁹時 (以下簡稱為BFRF1 LD1_2LA)，對於 BFRF1 和 Alix

(20)

的結合力影響最大。另外，劉冠婷於研究中發現 BFRF1 會和 Alix 的三段功能基其中的兩段結合。Alix 分別有 Bro (1–358 a.a)、 V (362–702 a.a)、

PRR (703–868 a.a)，會和 BFRF1 結合的功能區是 Bro 和 PRR (Liu 2014)。因此，我們想更詳細的去探討 BFRF1 和 Alix 結合方式和機制為何。

所以我的研究目標有二，第一是探討 BFRF1 和 Alix 結合時，所需要有哪些功能區段與詳細機制為何，另外，BFRF1 如何利用 Alix 幫助產生衍生液泡。第二個目標則是找出還會有那些 ESCRT-III 蛋白參與，以幫助 BFRF1 產生衍生液泡，帶著 EB 病毒出核，促進病毒殼體成熟與釋出。第三是表現與純化 BFRF1 重組蛋白，以製作一高專一性的抗體用來觀察 BFRF1 在EB病毒核殼體出核過程中的路徑與機制。

(21)

2. 實驗材料與方法

2.1 建構質體

2.1.1 本論文建構之質體 pEGFP-BFRF1 (pYJJ-1)

BFRF1序列來自 pCDNA3.0-HA-BFRF1 (中研院施修明老師提供)，

以引子 LMRC751、LMRC752 進行聚合酶鏈鎖反應，得到 BFRF1 序列片段，以限制酶 BamHI 及 XhoI 切割後接合至 pEGFP-c1 中。

pLenti4-GFP-BFRF1 (pYJJ-2)

將pEGFP-BFRF1，以引子 LMRC915、LMRC916進行聚合酶鏈鎖反應，得到 GFP-BFRF1 序列片段，再以限制酶 RsrII(CPO) 切位鑲嵌至 pLenti4-CPO-V5-His-V2 (來自國衛院林素芳老師)。之後送入T-Rex誘導細胞株中，以 Blasticidine、Zeocin 挑選穩定細胞株，以四環黴素 (Doxycycline) 誘導細胞表現病毒蛋白 BFRF1 。

pCDNA3.0-HA-BFRF1-PCM (pYJJ3)

以施修明老師所提供的 HA-BFRF1 作為模板，透過定點誘變法 (mutagenesis strategy) (Makarova, et al. 2000)，利用LMRC864、997引子，

將BFRF1 ²⁷³RRHRTRETRRMR²⁸⁵正電核苷酸 (精胺酸 Arginine) 置換為丙氨酸 Alanine，突變後為²⁷³AAHATAETAAMA²⁸⁵。

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pRSET-6xHis-BFRF1 (pYJJ4)

BFRF1(1-336 a.a) 序列來自 pCDNA3.0-HA-BFRF1，以引子

LMRC759、LMRC874 做聚合酶鏈鎖反應，得到 BFRF1 序列片段，以限制酶 EcoRI 及 BglII 切割後鑲嵌至 pRSET-6xHis中。

pRSET-6xHis-BFRF1 △TM (pYJJ5)

BFRF1 △TM (1-313 a.a) 序列來自 pCDNA3.0-HA-BFRF1 ，以引子 LMRC759、LMRC995 做聚合酶鏈鎖反應得到序列片段，但不含 BFRF1原有的穿膜功能片段 (transmembrane domain)，以限制酶 EcoRI 及 BglII 切割後鑲嵌至 pRSET-6xHis中。

2.1.2 其他質體 pCDNA3.0 (Invitrogen)

真核細胞的表現載體，大小約5446個含氮鹼基，帶有 CMV 啟動子，在細菌中的抗藥基因為 Ampicillin，在細胞中的篩選抗藥基因為 Neomycin。

pCDNA3.0-HA-BFRF1 (中研院施修明實驗室提供)

將帶有 HA 標籤的 BFRF1 序列以限制酶 XhoI-HA-BFRF1-Not 切位鑲嵌至 pcDNA3.0 載體(Invitrogen)上。

pCDNA3.0-HA-BFRF1 LD1_2LA (劉冠婷所建構)

以 pCDNA3.0-HA-BFRF1 為模板，利用 LMRC928以mutagenesis 方式將 ⁶¹VYKFLAFKL⁶⁹突變為⁶¹AAKFAAFKA⁶⁹。

pCDNA3.0-HA-BFRF1 2LA-PCM (陳忠寬建構)

pCDNA3.0-HA-BFRF1 LD1_2LA 和 pCDNA3.0-HA-BFRF1-PCM 以限制酶 XhoI-HA-BFRF1(245)-EcoRV，作direct cloning，將兩個質體嫁接在一起。

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pEGFP-c1 (Clontech)

真核細胞的表現載體，大小約4731個含氮鹼基，帶有 CMV 啟動子，細菌中的抗藥基因為 Kanamycin，在細胞中的篩選抗藥基因為 Neomycin。

pLenti4-CPO-V5-His-V2(國衛院林素芳實驗室提供)

由國衛院林素芳老師實驗室重新修飾過的 pLenti4/V5-DEST，將多克隆位點 (multiple cloning site) 置換為限制酶 RsrII (CPO)切割位點，在這質體中含有，CMV 啟動子、V5、His 標籤，在細胞中的篩選抗藥基因為 Zeocine (Chen, et al. 2011)。

FLAG-Alix , FLAG-Alix-Bro, FLAG- Alix -V, and pC-FLAG- Alix-PRR 以聚合酶鏈鎖反應得到 Alix 功能片段序列，並建構於

pCAGGS/MCS 載體上表現，由威斯康辛大學 Yoshihiro Kawaoka 實驗室提供 (Shtanko, et al. 2011)。

pCR3.1 (Invitrogen)

大小約5060個含氮鹼基，帶有 CMV 啟動子，在細菌中的抗藥基因為 Ampicillin。

pSG5 (Stratagene)

大小約4076個含氮鹼基，帶有 SV40 啟動子，在細菌中的抗藥基因為 Ampicillin。

pRTS15

pRTS15 是將 EBV 的 BRLF1 基因片段接至 pRTS2 (修飾過的 pSG5) 載體上，在細胞可驅動 Rta 病毒蛋白表現，是由美國霍普金斯大學 Dr. S. Diane Hayward 教授提供 (Sarisky and Hayward 1996)。

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2.3 引子序列

引子序號序列

LMRC751 5’-CCGCTCGAGCTATGGCAGCCCGGAA-3’

LMRC752 5’-CGGGATCCTCAGGTCCACCTCAGAA-3’

LMRC759 5’-GAAGATCTATGGCGAGCCCGGAA-3’

LMRC864 5’-GTTACGCTCCTTGGAGGGACAGGGACTCGTGGTCGGAATCCGA-3’

LMRC874 5’-GGAATTCTCAGGTCCACCTCAGAAACA-3’

LMRC915 5’-CACGGTCCGACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’

LMRC916 5’-CACGGACCGTCAGGTCCACCTCAGAAACAT-3’

LMRC928 5’-TGGAGTTTGCCGCCAAGTTCGCGGCCTTTAAGGCGAAGAACTGCAACTACCCCT-3’

LMRC995 5’-GGAATTCCTAGGCGCGCCAAGAATAACGC-3’

LMRC997 5’-TCGTGAGGCACCCCATCGCCGCGCACGCGA-3’

2.4 細胞培養

HeLa 細胞是由人類子宮頸上皮細胞分離的細胞株 (ATCC#CCL-2)，

NA細胞是由本實驗室利用重組 Akata EB 病毒株感染鼻咽癌上皮細胞株 TW01 而來(Chang, et al. 1999)，上述的三種細胞都是以 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Hyclone) 含 10% fetal bovine serum、1% L- glutamine、penicillin (100 U/ml) / streptomycin (100 μg/ml) 培養，培養條件為37℃、5% CO2。T-Rex HeLa 細胞株內帶有可以穩定表現 Tet-repressor 基因，利用 tetracycline 作為誘導物可以調控目標基因的表現，將 GFP- BFRF1 接入改造過的 pLenti4-CPO-V5-His-V2 載體，轉染至T-Rex HeLa 誘導細胞 (ThermoFisher)，以 300 μg/ml Zeocin, 5 μg/ml Blasticidine 進行抗生素篩選，挑出穩定細胞株，在培養誘導細胞需要使用 10%

tetracycline- free 的胎牛血清，加入其餘成分皆相同的 DMEM 培養液。

2.5 細胞轉染

以 Lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen) 試劑做細胞轉染，進行轉染前先更換成新鮮培養液。取適量 Opti-MEM (GIBCO-BRL) 培養液稀釋欲轉染的質體 DNA或 si-RNA，以及 Lipofectamine (核酸濃度(μg): Lipofectamine (μl) = 1: 1.5) 各自混勻後靜置5分鐘，兩者混合後再室溫靜置20分鐘，將混

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和試劑隨機分布地滴入培養細胞內，待37 ℃培養 4-6小時，細胞攝入核酸後，再更換為新鮮培養液，後續待指定時間點收取細胞。

2.6 正二十丙烷硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 及西方墨點法(Western Blot) 使用 Bio-Rad 直立式電泳裝置，依據欲分析的蛋白分子量大小配置 10-15% Resolving Gel，上層則固定為 5% stacking gel 。蛋白質樣品與 4 倍 sample buffer (200mM Tris, 8% SDS, 4% glycerol, 0.4% bromophenol blue, 400 mM DTT) 混合，95 ℃加熱 10 分鐘使蛋白質變性，將處理完畢的蛋白樣品注入 SDS-PAGE 樣品槽內，於 running buffer (25 mM Tris, 250 mM Glycine, 0.1% SDS) 中以 80-120 伏特進行膠體分析。電泳結束後，以 300 mA、90 分鐘，以 transfer buffer (25 mM Tris, 250 mM Glycine, 10%

methanol) 轉漬至硝化纖維膜 (Nitrocellulose)。將樣品膜以 Blocking Buffer

─ 5%脫脂奶粉溶於 TBST (10 mM Tris-HCl pH=7.4, 24 mM NaCl, 0.2%

Tween-20 ) 室溫均勻覆蓋反應 30 分鐘至 60 分鐘，以適當一級抗體濃度的 Blocking Buffer 浸潤樣品膜室溫兩小時或 4℃ 16 小時，以 TBST 清洗三次，每次 5 分鐘，再以適當二級抗體濃度的 TBST 浸潤樣品膜室溫一小時，TBST 清洗三次，每次五分鐘，以 Western Lighterning^TMWestern Blot Chemiluminescence Reagent plus (Perkin Elmer) 及 X 光片偵測蛋白質表現情形。偵測病毒蛋白使用實驗室製作的抗體 anti-Rta 467、anti-BMRF1 88A9、anti-BGLF4 2616、anti-Zta 1B4。Anti-BFRF1 R319 由義大利

Faggioni 研究團隊提供。其他蛋白抗體有 anti-GFP(GenTex, GTX113617)、

anti-HA.11(Covance)、anti-Flag M2(Sigma)、anti-β-actin(Sigma)。

2.7 共同免疫沉澱(co-immunoprecipitation)

先將該實驗時所需要的磁珠 (Protein A Mag sepharose^TMXtra)，每樣本約須用到30 μl，以 1x PBS (145 mM NaCl, 4 mM Na2HPO4, 1mM KH2PO4,

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pH=7.5) 潤洗數次取出偵測蛋白質樣本濃度後，以 cell lysis RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% sodium deoxy cholate, 0.1% SDS) 溶回取出體積 30μl /每樣本。

蛋白樣品萃取方法為將細胞於培養皿上刮落收集於 15 ml 離心管，以 4℃、1200 rpm 離心 5 分鐘去除上清液，加入預冷的 PBS 洗掉殘留的細胞培養液，同時將樣品移入 1.5 ml Eppendorf tube，以 4℃、13000 rpm 離心去除上清液，加入 1000 μl cell lysis RIPA buffer 約略混合後置於 4 ℃ vertical rotator 上，以 3 rpm 轉動兩小時，4℃、13500 rpm 、10 分鐘離心。保留上清樣品蛋白液，偵測其確切濃度後，取出適量蛋白濃度 (建議濃度 300-500 μg)，加入 10 μl 前處理過的磁珠，於 4 ℃ vertical rotator 上 3 rpm 轉動 40 分鐘，去除非專一性結合。取出上清液 (pre- cleared 細胞萃取液)並加入 1 μg anti-HA.11 (Covance)，於 4 ℃ vertical rotator 上 3 rpm 轉動 16 小時後，加入 20 μl 前處理過的磁珠，於 4 ℃ vertical rotator 上 3 rpm 轉動 2 小時。接著以 NP-40 lysis buffer (50 mM Tris pH=8, 150 mM NaCl, 1% NP-40) 清洗磁珠兩次，再以 1X PBS 清洗兩次，每次 1 ml，4 ℃ vertical rotator 上 3 rpm 轉動分鐘，最後將上清液完全清除，加入 15 μl 2X sample buffer ，95 ℃加熱 10 分鐘使蛋白質變性，再利用西方墨點法進行分析。

2.8 間接免疫螢光染色(indirect immunofluorescence assay)

將細胞培養於 10-cm 培養皿 (含玻片) 內，進行質體轉染後，在指定時間將玻片取出標記好，以 1X PBS 去除多餘細胞培養液，利用 4%

paraformaldehyde (in PBS) 室溫下作用 20 分鐘以固定細胞，再以 PBS 清洗 5 分鐘兩次後，風乾玻片。利用 Immedge^TM筆於玻片上劃開欲偵測範圍並置於化學抽風櫃待墨水風乾，將玻片放入 0.1% Triton X-100 (in PBS) 室溫反應 5 分鐘。再以 PBS 清洗 5 分鐘兩次後，以 1% BSA (in PBS) Blocking

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30 分鐘至一小時，以 1% BSA (in PBS) blocking buffer 配置適當稀釋的一級抗體，均勻滴於欲偵測範圍的玻片上，37 ℃反應 90 分鐘，PBS 清洗 5 分鐘三次後，以 PBS 配置適當稀釋的二級螢光抗體，均勻滴於欲偵測範圍的玻片上，37 ℃反應 60 分鐘，PBS 清洗 5 分鐘三次後，將玻片置入 1:1000 稀釋的 Hoechst 33238 (in PBS) 作用反應 5 分鐘，PBS 清洗 5 分鐘三次後，以 1:1 稀釋的 mounting solution 封片，以指甲油封邊，防止樣品接觸空氣，以保持樣品品質，進行螢光顯微鏡觀察，或共軛焦顯微鏡觀察。一級抗體有 anti-HA(GenTex, GTX29110)、anti-Alix 3A9(GenTex, GTX42812)、anti-Emerin (Santacruz, sc-25284)。

2.9 表現及純化 BFRF1 蛋白

送入目標質體 pRSET-6x His- BFRF1 或 pRSET-6x His- BFRF1-△TM 至 E.coli BL21 ，挑選新鮮單一菌落，培養在 37℃ TB (1.2% Peptone, 2.4% Yeast extract, 0.4% Glycerol, 0.231% KH2PO4, 1.254% K2HPO4, pH=7) 培養液 16-18 小時，以 1/500-1/1000 稀釋至 500 ml TB 培養液。37℃培養至 OD600 =0.5，加入 1 mM 乳糖誘導劑 IPTG (Isopropyl β-D-1-

thiogalactopyranoside)，37℃誘導 6 小時，離心 6000 rpm、10 分鐘。保留菌體沉澱物，以 1XPBS 清洗轉入 50 ml 離心管，離心 10000 rpm、10 分鐘，去除上清液，測量菌體沉澱物重量，加入每 g 重 10 ml Lysis Buffer ( 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10mM imidazole, 0.5% Triton x-100, pH=8, 1X protease inhibitor cocktail, 1 mg/ml lysozyme ) 混勻後，4 ℃、水平搖蕩器 100 rpm、60 分鐘使 lysozyme 完全反應。在 (-80℃急速冷凍 5 分鐘，

37℃快速解凍) 重複三循環，利用超音波震盪儀(sonicator, Sonica –S4000) 全程於冰上震盪，(40 瓦特震盪 5 分鐘，關閉 5 分鐘)重複循環共 20 分鐘，

將細胞壁及細菌染色體打斷，離心最高轉速、10 分鐘，去除上清液。加入 10 ml membrane protein wash buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10mM

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imidazole, 2% Triton x-100, pH=8)，劇烈震盪 30 秒，離心最高轉速、10 分鐘，去除上清液。加入 10 ml DNA wash buffer (50 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, 10mM imidazole, 2% Triton x-100, pH=8 )，劇烈震盪 30 秒，離心最高轉速、10 分鐘，去除上清液。清洗過的內涵體(inclusion body)溶於 10 ml urea buffer (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, pH=8)，劇烈震盪 1 分鐘，室溫水平搖蕩器混合 30 分鐘。以最高轉速、5 分鐘離心，保留上清液加至 nickle beads，4 ℃、垂直搖蕩器一小時，以最高轉速、5 分鐘離心，

去除上清液，加入 10 ml washing buffer (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, pH=6.3)，4 ℃、垂直搖蕩器 10 分鐘，以最高轉速、5 分鐘離心，去除上清液，加入 5 ml elution buffer-1 (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris- HCl, 8 M Urea, pH=5.9)，4 ℃、垂直搖蕩器 10 分鐘，以最高轉速、5 分鐘離心，保留上清液待 SDS-PAGE 確認，加入 5 ml elution buffer-2 (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, pH=4.5)，4 ℃、垂直搖蕩器 10 分鐘，以最高轉速、5 分鐘離心，保留上清液待 SDS-PAGE 確認，加入 5 ml elution buffer-3 (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, pH=4.0)，

4 ℃、垂直搖蕩器 10 分鐘，以最高轉速、5 分鐘離心，保留上清液待 SDS-PAGE 確認，加入 5 ml elution buffer-4 (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, pH=3.0)，4 ℃、垂直搖蕩器 10 分鐘，以最高轉速、5 分鐘離心，保留上清液待 SDS-PAGE 確認。

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2.10 慢病毒製備 (Lentivirus packaging)

HEK293 細胞計數 3x10⁵顆細胞培養於 6 well 培養皿，37 ℃、5 % CO2 培養 16-18 小時。將包裹慢病毒的材料 ─ dR8.91 450ng、pMD.G 50ng、shRN A 慢病毒質體 50 ng，加 ddH2O 至 112.5 μl 備用，再加入 12.5 μl 2.5 M CaCl2 與 125 μl 2x BBS (50 mM BES ph6.95, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4) ，混合後靜置 12 分鐘，將混合製劑加入細胞培養液中，於 37 ℃、3 % CO2培養 18 小時候後，更換為含有 1% BSA 新鮮 DMEM 培養液，在培養 24-48 小時後收取上清液備用，以作為慢病毒感染的對照組 shLuc。

2.11 慢病毒感染 (Lentivirus infection)

利用細胞計數器將目標細胞株 ( NA 或 HeLa ) 2 x10⁵/ml，培養於 6 孔盤中，依照實驗設定均勻加入所需要之病毒感染劑量 ( Multiplicity of infection, MOI )，使用 MOI 約 4.5~5 之間，本次實驗使用中研院 RNAi core 提供的盤式病毒(表一)，每個欲作用的基因，皆約 3~5 株病毒，MOI 平均分散各株病毒加入的量。例如：欲 knockdown Vps4A 基因，具有五株病毒株，則平均每株病毒株加入 MOI=1 的病毒量。加入慢病毒液後以 2250 rpm,室溫離心 30 分鐘後再置於 37℃培養箱中培養 48 小時，然後，用 3 μg/ml Puromycine 篩選感染 ( infection )成功之細胞。

2.12 細胞內 EBV 病毒核酸萃取

將細胞刮落之後以 PBS 清洗，4℃、13500 rpm 、30 秒離心，去除上清液，取 400 μl Digestion buffer (0.1% SDS, 0.125 mg/ml proteinase K, 50 mM Tris-HCl pH=8 , 10 mM EDTA pH=8) 混合細胞，以 55℃反應 3 小時，

加入 RNase A (最終濃度為 0.5 mg/ml)，55℃反應 16-18 小時，反應後先置室溫冷卻。加入等體積的 phenol/chloroform/IAA(25:24:1) 劇烈震盪 15 秒，靜置一分鐘後以 4℃、13500 rpm 、10 分鐘離心，將上層(約 350 μl)

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移至新的 1.5 ml Eppendorf，再加入 2 倍體積的 100% ethanol 及 0.1 倍體積的 3M NaOAC pH=5.2，混合均勻後置-20℃冷凍沉澱 16 小時，4℃、

13500 rpm、10 分鐘離心，去除上清液，加入 1 ml 70% Ethanol 潤洗 DNA pellet ，℃、13500 rpm、10 分鐘離心，去除上清液，風乾 10 分鐘，加入滅菌水50 μl，置於 4℃冰箱待 DNA 溶解完全，之後以 spectrophotometer 測量 DNA 濃度。

2.13 細胞外 EBV 病毒核酸萃取

將細胞培養液取 1 ml 至 1.5 ml Eppendorf ，離心 4℃、13500 rpm、30 分鐘，吸取 445 μl 最上層液體，再加入 5 μl DNaseI (1 U/μl)及 50 μl 10X DNase buffer，混合均勻後室溫反應 15 分鐘，以加入 EDTA (最終濃度=

25mM) 並於 65℃ 反應 10 分鐘將 DNaseI 酵素反應中止，完成前處理的細胞培養液可先保存於 -80℃。

使用 QIAmp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN) ，先將 25 μl

QIAGEN Protease /每隻樣本，分裝至新的 1.5 ml Eppendorf，再加入 200 μl 前處理的細胞培養液以及 200 μl Buffer AL (含有 28 μl/ml 的 carrier

RNA)，劇烈震盪 15 秒後 56 ℃反應 15 分鐘後先置於室溫回溫，加入 250 μl 100% Ethanol 劇烈震盪 15 秒，靜置室溫 5 分鐘，以 1200 rpm 30 秒離心，使管壁殘留液體集中後，將全數液體移入標示好的 QIAamp MinElute column，8000 rpm 1 分鐘離心，去除收集管廢液。在 column 加入 500 μl Buffer AW1，8000 rpm 1 分鐘離心，去除收集管廢液。在 column 加入 500 μl Buffer AW2，8000 rpm 1 分鐘離心，去除收集管廢液。在 column 加入 500 μl 100% Ethanol，8000 rpm 1 分鐘離心，去除收集管廢液。後更換為新的收集管，再以空 column 離心 13200 rpm 3 分鐘使 column 內部結合膜乾燥，丟掉收集管，更換為標示好 1.5 ml Eppendorf。置於 60 ℃烘箱 3 分鐘，直接滴加50 μl 滅菌水於膜上靜置室溫 10 分鐘，離心 13200 rpm 3

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分鐘，即取得培養液內的核酸。

2.14 即時定量聚合酶連鎖反應 (Quantitative polymerase chain reaction) 以絕對定量後的 293 TetEZ p2089 細胞含有 5x10⁷ EB病毒基因組及 1x10⁴細胞基因組，當作標準線十倍序列稀釋，作為定義 BamHI W 及 β- globin的基準曲線，將檢體稀釋成5 ng/μl，取5 μl 檢體與0.8 μl 核酸引子 (10 μM)，和 10 μl 2X SYBR Green 反應混合液 ( SensiFASTTM SYBR No- ROX Kit, BIOLINE) 混合後用滅菌水補至最後體積 20 μl 混合均勻。將標準線稀釋液與檢體加入 96-Well PCR 反應盤，其中還有 NTC (no template control) 組別，每個實驗須有二重複或三重複，進行聚合酶鏈鎖反應並以 Bio-Rad CFX Manager version 3.0 偵測及分析。

( BamHI W 使用引子為 LMRC366、LMRC367，β-globin 使用引子為 LMRC970、LMRC971 (Junying, et al. 2003)。 )

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3. 實驗結果

3.1 BFRF1 的 ESR 功能區正電胺基酸，對於 BFRF1 和 Alix PRR 功能區 的結合是重要的

實驗室之前觀察到 HA-BFRF1 於 HeLa 細胞中表現，可以和內生性 Alix 結合，並吸引ESCRT 膜剪切模組協助由核膜衍生細胞內液泡的產生。當細胞內的 Alix 表現量受 siRNA 影響而下降，亦會影響 BFRF1 產生衍生液泡 (C. P. Lee, et al. 2012)。之前實驗室劉冠婷曾利用免疫沉澱法發現 BFRF1 wildtype 可能透過兩段功能區與 Alix 結合，當將 BFRF1 EBV specific region (ESR) (270 a.a - 290 a.a) 去除時，會影響 BFRF1 和 Alix PRR 的結合能力，但不影響與 Alix Bro 功能區的結合能力(附錄三)。另外，曾在HIV的研究中發現，HIV 的 gag 蛋白的 NC 功能區富含正電，可透過吸引細胞內的核醣核酸 (RNA)，作為 gag 蛋白與 Alix 間結合的媒介。先前劉冠婷曾在免疫沉澱實驗中發現，當細胞萃取液加入 nuclease 會使 BFRF1 與 Alix PRR結合減弱 (附錄四)，推測 BFRF1 蛋白可能帶有正電胺基酸可以吸引核酸物質作為與 Alix 結合的媒介。於是在本論文中發現ESR功能區富含正電胺基酸，將 BFRF1

273RRHRTRETRRMR²⁸⁵正電核苷酸 (精胺酸 Arginine) 置換為丙氨酸 Alanine，突變後為²⁷³AAHATAETAAMA²⁸⁵(以下稱為BFRF1 PCM)。在免疫沉澱實驗中， BFRF1 wildtype 可以和 Alix 的 Bro 及 PRR 功能區結合 (圖一A, lane 8 and 10)，然而，BFRF1 PCM 僅和 Alix 的 Bro 功能區結合 (圖一B, lane 8 and lane 10)。表示 BFRF1 透過 ESR 的正電胺基酸吸引核酸當作媒介與 Alix PRR 功能區結合。

綜合前人與本論文的實驗結果顯示，BFRF1 可透過 N 端的 LD1 與 Alix Bro 功能區結合，C 端的 ESR 與 Alix PRR 結合。因此想利用同時突變 N 端及 C 端的 BFRF1，看是否完全影響 BFRF1 與 Alix 的結合

(33)

能力。因此建構了 BFRF1 2LA-PCM 的質體，以作進一步的觀察。

3.2 HA-BFRF1 mutants 使衍生液泡減少並且改變內生性 Alix 於細胞內的分 布位置

為了瞭解 BFRF1 HA-BFRF1 mutants 於細胞內的分布變化，以及 BFRF1 mutants 與吸引 Alix 的能力是否和 BFRF1 與產生衍生液泡相關。將 HA-BFRF1 與 HA-BFRF1 mutants 質體轉染於 HeLa 細胞中，並於轉染後24小時進行免疫螢光染色及共軛焦顯微鏡分析 (圖二)， HA- BFRF1 wildtype 於細胞中，可以偵測到許多衍生液泡，LD1_2LA 於細胞中的衍生液泡數量大幅下降， BFRF1 PCM 的於細胞中的衍生液泡則體積變小，並聚集於細胞核周 (perinuclear)，至於 BFRF1 2LA-PCM 表現在細胞質中，幾乎不會產生衍生液泡，而是較均勻散佈在細胞質。在 vector control 及 BFRF1 wildtype 細胞中，Alix 主要均質表現於細胞質，我們認為當 Alix 完成 ESCRT 膜剪切機制後，會再回歸於其原本的位置。但當細胞表現 LD1_2LA、PCM 時，在核膜表面與 Alix 有相對較明顯的共位現象 (colocalization) ，但無衍生液泡形成。可能是當 BFRF1 突變後，延遲了 Alix 吸引 ESCRT 蛋白的能力，使 BFRF1 需要 Alix 參與並接續至 ESCRT 的膜剪接機制，一旦原本在細胞內達成動態平衡的 ESCRT machinery 受阻而失控， Alix 的分布位置即改變。

3.3 HA-BFRF1 mutants 減弱核膜塑形能力使核膜衍生液泡減少

為了更直接的觀察 BFRF1 產生核膜衍生液泡的功能，因此偵測主要表現在內核膜的 Emerin 蛋白，以作為內核膜的指標。轉染 HA-BFRF1 與 HA-BFRF1 mutants 質體於 HeLa 細胞中，並於轉染後24小時進行免疫螢光染色及共軛焦顯微鏡分析 (圖三)。觀察到轉染 vector control 的細胞中，Emerin 主要表現在核膜，形成完整平滑的核膜染色型態(圖三A)。在表現 HA-BFRF1 wildtype 的細胞中， Emerin 會因為 BFRF1產生衍生液

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泡而被連帶牽引並表現在細胞質，另可觀察到 HA-BFRF1 會在核膜邊緣以及細胞質的液泡結構與 Emerin 形成共位現象。在表現 LD1_2LA 的細胞中發現到產生衍生液泡的數量減少，主要會在核膜邊緣與 Emerin 形成共位現象。至於在表現 BFRF1 PCM 的細胞中發現產生的衍生液泡體積較小，並且集中在細胞核外圍的某一側，較不會與 Emerin 形成共位現象。

然而，在表現 BFRF1 2LA-PCM 的細胞中，無法觀察到細胞質的液泡結構，也無法和 Emerin 形成共位現象。在圖三 B 中不同視野的 BFRF1 mutants 與 Emerin 共位現象的觀察中發現，於表現 PCM 及 2LA-PCM 細胞，也較無法觀察到 BFRF1 蛋白表現在核膜上的型態，PCM 及 2LA- PCM 這兩種 BFRF1 mutants 即使產生小泡也不會連帶著 Emerin 到細胞質表現，主要的原因不是因為突變蛋白在細胞內表現量較低而造成的(圖三 C)。HA-BFRF1 PCM 主要產生的液泡可能是由內質網衍生，特徵是聚集在核周 (perinuclear) 較小的液泡(圖三B)，可推測當喪失ESR的正電胺基酸，會影響到 BFRF1與內核膜及 Emerin 靠近，甚至減少由核膜產生的衍生液泡。

3.4 以免疫沉澱法偵測 BFRF1 mutants 與 Alix 蛋白結合能力無明顯差異 因為在圖二中觀察到 BFRF1 mutants 和 Alix 有較強的共位現象，故利用免疫沉澱法偵測 BFRF1 mutants 與 Alix 蛋白結合能力。在 HeLa 細胞中轉染 BFRF1 wildtype 表現24小時後，以 RIPA buffer收取細胞萃取液，利用 anti-HA.11 (Covance) 進行共同免疫沉澱，並進行 SDS-PAGE 與西方墨點法分析(圖四)。利用 Image J 數值化後，將 BFRF1 wildtype 與免疫沉澱後的 Alix 訊號視為 100% (=1) ， LD1_2LA、 BFRF1 PCM 、2LA-PCM 和 Alix 的結合能力則稍有的下降，免疫沉澱試驗的結果與先前利用免疫螢光染色所偵測到的結果不相符。推論Alix在細胞中呈動態結合，不適合利用免疫沉澱法探討結合能力。

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3.5 pLenti4-GFP-BFRF1 短暫的轉染與篩選為誘導穩定細胞株後的表現形態 不同

另外，為了證明 ESCRT 膜剪切機制會影響 BFRF1 產生衍生液泡，

利用 BFRF1 誘導細胞搭配 shRNA 使ESCRT components 表現量下降，

觀察是否影響 BFRF1 產生衍生液泡。首先，以 pLenti4-GFP-BFRF1 暫時轉染 (transient) 至 T-Rex HeLa 誘導細胞 (ThermoFisher)，培養16小時後，加入 50 ng/ml Doxycycline 誘導 GFP-BFRF1 表現24小時後收取細胞玻片，以免疫螢光顯微鏡觀察。Flag-GFP vector control 在細胞內均質的表現在細胞的各處，細胞核內的訊號較細胞質強。 GFP-BFRF1 表現的細胞，可在細胞膜上觀察到完整的環狀訊號，在細胞質中亦可以觀察到數量較多的衍生液泡 (圖五A)。因為以暫時轉染方式表現的細胞，會因為誘導細胞內的基本基因表現控制不夠嚴謹，使 Tet-repressor 基因表現量較低，

即使未添加誘發物即表現蛋白的情形發生，因此不適合用於需要嚴密調控基因表現的用途(圖五A左側)。故通常操作誘導細胞都會以藥物篩選為單純細胞株後，再執行實驗。將 pLenti4-GFP-BFRF1 轉染至 T-Rex HeLa 細胞，培養16小時後以 200 μg/ml Zeocin 及 12.5 μg/ml Blasticidine 進行抗生素篩選，大約進行兩~三周，可在培養皿中發現的單一細胞群落，將單一群落挑出培養為穩定細胞株。分別有 Flag-GFP control 三株細胞 (clone 2.4.12)與 GFP-BFRF1 四株細胞 (clone 1.2.4.6) (圖五B)。Flag-GFP 穩定細胞株經誘導後，表現形態與暫時轉染細胞 (transient) 相仿(圖五B)。但 GFP-BFRF1 穩定細胞株經誘導後，表現形態與暫時轉染細胞相比，無明顯衍生液泡，主要表現在細胞核膜上(圖五B)。另外，以西方墨點法偵測轉染細胞與穩定細胞株內所含有的 GFP-BFRF1 表現量，發現穩定細胞株的蛋白表現量明顯少了許多(圖五C)，顯示此系統不適合作為探討其它 ESCRT 之 shRNA 對 BFRF1 衍生液泡的影響。

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3.6 Knockdown Chmp4B 和 Vps4A 促進 EBV 病毒釋出

在HIV budding的研究中發現，主要執行功能的 ESCRT 成員是 Chmp4B 與 Vps4A (Prescher, et al. 2015)。先前實驗室也曾將 dominant negative 的 GFP-Chmp4B 及 Vps4DN 轉染至有EB病毒的鼻咽癌上皮細胞株NA細胞中，以 real-time PCR 偵測培養液中的病毒量下降，於是認為 ESCRT的成員 Chmp4B 與 Vps4 是重要的(Lee, et al. 2012)。首先，利用 shRNA將 Chmp4B 與 Vps4 A 這兩個 ESCRT component 於 NA 細胞中 knockdown ，以 real-time PCR 定量細胞內及釋出細胞外病毒顆粒中的 EBV DNA copy number，觀察 ESCRT component knockdown 對EB病毒在細胞核內的複製及成熟殼體的釋出有無影響。 NA 細胞利用 shRNA 病毒感染兩天後，以 puromycine 篩選五天，利用 Rta 質體轉染使EB病毒進入融裂期，在細胞核內複製並表現病毒蛋白，於西方墨點法分析(圖六A)，當 Chmp4B 與 Vps4A knockdown 時並不影響病毒蛋白的表現量。以 real- time PCR 偵測細胞內 EBV DNA copy number，和 shLuc control 相比較，

當 Chmp4B 與 Vps4A knockdown時，細胞內的 copy number 類似(圖六 B)。至於細胞外培養液純化的核酸以 real-time PCR 偵測，和 shLuc control 相比較，當 Vps4A knockdown 時，細胞外的 copy number 兩者數值相仿，但當 Chmp4B knockdown 時，以 Rta 誘導會使細胞外的 EBV copy number 比 shLuc 上升2倍多。雖然目前結果僅初步以 screening test 測試一次，但在這次結果中發現 knockdown Chmp4B 會使病毒釋出量上升，與先前發現以 dominant negative GFP-Chmp4B 使病毒釋出量下降的結果不相符，可能是因為當細胞內的 Chmp4B 表現量下降使，會使其他 Chmp4 蛋白(如 Chmp4A、Chmp4C )代償性表現上升，反而促進病毒的釋出量，詳細的機制需要更進一步探討。

3.7 Knockdown ESCRT-III (Chmp4A/Chmp4B/Chmp4C/Chmp6/Chmp7) 對

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促進 EBV 病毒的釋出

已知主要扮演膜剪切功能的 ESCRT component 是 ESCRT-III 這群蛋白 (Guizetti, et al. 2011)，於是首先將以 ESCRT-III 蛋白作為 screening test 的候選者，篩選對於EB病毒複製或釋出影響的 component 。同時亦可分別 knockdown Chmp4 (A、B、C) 蛋白，以觀察是否有代償性表現上升而促進病毒釋出量的情形。將 NA 細胞用 shRNA 病毒感染兩天後，以 puromycine 篩選五天，利用 Rta 質體轉染使EB病毒進入融裂期，在細胞核內複製並表現病毒蛋白，於西方墨點法分析(圖七A)，當 knockdown Chmp4A、Chmp4B、Chmp4C、Chmp6 或 Chmp7 時，並不影響誘導後病毒蛋白的表現量。以 real-time PCR 偵測細胞內 EBV DNA copy number，

和 shLuc control 相比較，當 Chmp4B、Chmp4C 被 knockdown 時，細胞內的 copy number 無明顯差異(圖七B)，至於 knockdown Chmp4A、

Chmp6 或 Chmp7 時，會使細胞內的 copy number 略為上升。至於細胞外以培養液純化的核酸，利用 real-time PCR 偵測並且和 shLuc control 相比較(圖七C)，當Chmp6、Chmp7 被 knockdown 時，以 Rta 誘導會使細胞外的 EBV copy number 和 shLuc 無明顯差異，而當 Chmp4A、

Chmp4B、Chmp4C knockdown 時，誘導後細胞外的 copy number 比 shLuc 分別高出約2.5倍、1.5倍、2.5倍。由此可以說明 Chmp4 會影響EB 病毒的釋出，當分別 knockdown Chmp4 (A、B、C) 蛋白，可能會使其他兩種蛋白代償性表現上升而促進病毒釋出量，需再測試 Chmp4 的

knockdown 效率如何並且是否會使其他兩種蛋白表現量上升，以說明此推論。

3.8

Knockdown ESCRT-III (Vps4A/Chmp1B/Chmp2B/Chmp3) 對於EBV 病 毒複製與釋出的影響

此外，亦觀察其他 ESCRT-III 對EB病毒的影響，將knockdown

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Vps4A、Chmp1B、Chmp2B 或 Chmp3 的 NA 細胞以 puromycine 篩選五天後，利用 Rta 質體轉染使EB病毒進入融裂期，利用西方墨點法分析病毒蛋白表現量 (圖八A)，當 Vps4A、Chmp1B、Chmp2B 與 Chmp3 knockdown 時，並不影響誘導後病毒蛋白的表現量。以 real-time PCR 偵測細胞內 EBV DNA copy number，和 shLuc control 相比較，當 Chmp1B 與 Chmp2B knockdown 時，細胞內的 copy number 類似(圖八B)，至於 knockdown Vps4A 與 Chmp3 時，會使細胞內的 copy number 略為上升。

另外，也去純化細胞外培養液病毒核酸，利用 real-time PCR 偵測並且和 shLuc control 相比較，當 Vps4A、shChmp2B、Chmp3 knockdown時，誘導後細胞外的 copy number 比 shLuc 分別高出約6倍、11倍、2倍，但當 Chmp1B knockdown時，以 Rta 誘導會使細胞外的 EBV copy number 比 shLuc 反而下降2倍多(圖八C)。NA細胞 knockdown Chmp1B 時，對於 Rta 誘導後仍能完成細胞核內複製並表現病毒蛋白，但成熟殼體系出細胞的的數量極低， knockdown Chmp1B 後對EB病毒的影響如同預期，

Chmp1B 蛋白不會影響EB病毒的複製，僅會影響EB病毒於細胞內外的運輸，使EB病毒釋出量下降。

綜合圖六、圖七、圖八的一次性實驗結果顯示，ESCRT-III蛋白雖不影響EB病毒的複製，一旦 knockdown Chmp2B、Chmp4A、Chmp4B、

Chmp4C、及 Vps4A，會促進成熟EB病毒殼體釋出細胞，反觀 Chmp1B 則會使EB病毒釋出量下降，為了更確定本實驗的現象是否確切，後續實驗需再以 RT-PCR 確定 ESCRT 的 mRNA 表現量。

3.9 建立細菌表現重組蛋白His-BFRF1及以變性環境的純化系統

為了後續實驗可能需要探討到 BFRF1 蛋白質晶體結構，或者利用純化蛋白生成特異性高、親和性高的抗體。在研究過程同時亦利用細菌表現重組蛋白的方法，分別將質體 pRSET-6x His-BFRF1/pRSET-6x His-BFRF1-

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dTM 轉形 (transform) 至 E.coli BL21 表現，分別測試在加入 IPTG 後以 30℃ 及 37℃ 不同誘導溫度下，蛋白質的表現量(圖九A)，pRSET-6x His- BFRF1-dTM 在誘導溫度 37℃ 下，表現量較高且比較不會有雜蛋白，故後續純化實驗皆以表現 BFRF1-dTM 蛋白的細菌執行實驗。利用 TB 培養液大量表現的 BFRF1-dTM 蛋白主要表現於細菌內涵體，因此以 Lysis Buffer 與超音破震盪儀打破細菌細胞壁及染色體，配合 membrane protein wash buffer 及 DNA wash buffer 潤洗內涵體並去除細菌內的大部分蛋白質。再將內涵體融入含有 8M urea buffer 中，使蛋白質變性融出內涵體，

以 nickel beads 進行親和性結合純化。利用 buffer pH 改變，當 pH 低於蛋白質等電點時會使蛋白質帶正電，而使蛋白與鎳離子(帶正電)分開而流出，得以用此原理純化蛋白。在這過程 His-BFRF1 需要pH值=3時，方能得到較為純淨的蛋白質(圖九C)。另外，亦以西方墨點法分析，配合 anti- BFRF1 抗體偵測，能在 urea buffer 中偵測為純化前的 BFRF1 蛋白訊號，接上 nickel beads以buffer 潤洗過程中都沒有 BFRF1 流出，直至 buffer pH 低於蛋白質等電點，Elution buffer 3 (pH=4)、Elution buffer 4 (pH=3) 中偵測到 BFRF1 蛋白訊號，因此得到純化後的 BFRF1 蛋白。利用此純化 BFRF1 病毒蛋白系統，未來可進一步純化大量的病毒蛋白。

探討 BFRF1 與ESCRT 模組在EB 病毒出核時所扮演 的角色與機制