我們接著以大腸桿菌JM109[pkpfABCD]及 JM109[pkpfRABCD]進行天 竺鼠紅血球凝集能力測試，分析Kpf 纖毛的生物活性。圖十一(A)顯 示大腸桿菌JM109[pkpfRABCD]具有最高稀釋倍數為 2 的凝集現象，
而大腸桿菌JM109[pkpfABCD]則即使在 1 倍菌液濃度也觀察不到凝集 現象，此結果與前述實驗結果相吻合。我們進一步以甘露醣競爭凝血 現象，圖十一(B)顯示當甘露醣的濃度為 0.001M 時，菌株
JM109[pkpfRABCD]的凝血現象受到完全抑制，此結果也與我們重組 第三型纖毛JM109[pmrkABCkpfD]的結果得以互相闡述。
討論
我們發現表現 KpfD 黏附蛋白的重組大腸桿菌具有很高的凝集天 竺鼠紅血球能力，我們可以用KpfD 專一性抗體去競爭掉此凝集現象，
顯示造成重組大腸桿菌凝血現象的的確是KpfD 蛋白質。我們發現此 凝血現象會受低濃度的mannose 所抑制，不同於愛德華氏菌Etf 纖毛 的凝血現象不受D-mannose 抑制，但對於 fetuin 及 N-acetylneuraminic acid 這兩種醣類的存在敏感(34)，克雷白氏肺炎感菌 Kpf 纖毛的凝血 特性和大腸桿菌第一型纖毛的特性相似(13)，因此我們比對了 KpfD 與大腸桿菌Fim 的胺基酸序列及二級結構，並參考文獻(19, 26, 32, 36) 指出的大腸桿菌FimH 與 mannose 結合的保留序列及重要胺基酸，分 別是N46 至 D54 區域，特別是 Asn46，Asp47 及 Asp54 三個胺基酸，
另外還有疏水性胺基酸例如Phe1，Ile13，Try48，Ile52，Tyr137 及 Phe142，由於當蛋白質折疊成三集結構時分布在重要胺基酸區域四周，
對FimH 結合甘露醣的能力也有不同程度的貢獻。我們根據大腸桿菌 Fim 的 mannose 結合保留位置，推測出克雷白氏肺炎感菌 KpfD 與 mannose 結合的重要序列可能位於 D73 至 A83 之間，因此我們設計 兩段不同大小的KpfD 表現載體，一段不包含我們預測的 KpfD mannose 結合重要序列，另一個則是包含 KpfD 黏附蛋白 mannose 結 合重要序列的全長受體結合區域，分別純化蛋白質進行競爭性凝血實 驗。實驗結果顯示兩蛋白質在濃度0.1ug/ml 時皆能競爭抑制凝血現象，
但當蛋白質濃度更低時則兩蛋白質都無法競爭抑制凝血現象。此一結 果無法證明我們預測的KpfD mannose 結合重要序列正確與否，可能 的原因推測有三 : (一)競爭實驗中純化的蛋白質濃度最高僅 0.1ug/ml，
可能因為濃度太低因此不易比較出包含或不包含mannose 結合區域 的蛋白質競爭凝血能力的差別。(二)由於此二蛋白質大量表現後形成 不溶性的內含體，因此我們以 6N 尿素使蛋白質變性加以純化，再用 透析方式使蛋白質重新折疊，而此過程中蛋白質可能折疊不完全，造 成純化的蛋白質構型和天然構型有所不同，例如原本裸露的結合位置 可能因錯誤折疊而被包覆至結構裡面，造成兩種蛋白質競爭凝血能力 無差別。(三)依照文獻指出(1)，突變 FimH 的 pilin 或受體結合區域會 使mannose 結合區域形成結構上的變構(allosteric)，使 FimH 對
mannose 的親和力大幅增加 ; 另外文獻也指出除了保留性甘露醣結 合區域外，其他在三級結構上分布於此區域四周的胺基酸所帶有的特 性也會影響FimH 對 mannose 結合能力(19)，因此除了我們所預測的 mannose 結合位置之外，其他胺基酸可能也扮演 KpfD 對甘露醣結合 的重要角色。
我們以大腸桿菌的FimH被報導的結晶結構(4)當模版，預測克雷 白氏肺炎感菌KpfD的三級結構，我們發現KpfD黏附蛋白的receptor結 合區域結構和第一型纖毛的黏附蛋白FimH相似度極高，皆為11至12 個β-strand以正-反股配對的方式，形成穩定的手套狀結構，兩者間最 大差別在於FimH有一個α-helix在receptor結合區域的第五與第六個
β-strand之間，而KpfD的唯一一個α-helix則在receptor及pilin區域中間 連結處。但比對KpfD的pilin區域三級結構，卻和FimH不同反而與克 雷白氏第三型纖毛黏附蛋白MrkD的pilin區域結構相似，以α-helix為 主要組成並有較短的β-strand。由此可以推測本實驗室所建構以重組
第三型纖毛表現不同的頂端黏附蛋白有組裝聚合的差異，可能是因為 這些被替換的黏附蛋白的pilin區域與第三型纖毛主要組成次單位 MrkA在三級結構上的差異，導致黏附蛋白與MrkA次單位在聚合時的 交互作用能力改變，進而影響到重組纖毛的聚合及穩定，因此大腸桿 菌的重組纖毛表現系統在此也增加我們探討黏附因子特性時的變 因。
我們進一步選殖克雷白氏肺炎感菌Kpf纖毛的基因組，並於大腸 桿菌中表現，我們發現調控子KpfR的存在與否會影響Kpf纖毛的表現。
分析KpfR可能的domain(附錄四)，發現KpfR蛋白質C端具有GerE功能 性區域 (第170個到第227個氨基酸區域)。GerE屬於LuxR/FixJ 蛋白質 家族，此蛋白質家族依啟動機制不同分為三個次家族 : (1) 雙分子調 控系統 (two-component)中磷酸化活化的蛋白質，例如 : 調控腸內菌 胞外多醣生成的RcsB (2) 受到細菌的quorum sensing分子活化或抑制 的蛋白質，例如 : 調控carbapenem抗生素生合成的CarR (3) 不同於
以上兩者，以自我調控方式活化或抑制的蛋白質，例如 : Ger，會以 helix-turn-helix結構形成雙複合體去結合DNA進行活化。未來我們希 望盡一步KpfR如何調控Kpf纖毛表現的機制。