克雷白氏肺炎桿菌NTUH-K2044 中纖毛黏附蛋白KpfD的功能性分析

國 立 交 通 大 學

生物醫學研究所

碩士論文

克雷白氏肺炎桿菌 NTUH-K2044 中纖毛黏附蛋白 KpfD

的功能性分析

Characterization of the adhesin KpfD from Klebsiella

pneumoniae NTUH-K2044

研究生：鐘純珊

Student: Chun-Shan Chung

指導教授：彭慧玲 博士

Advisor: Hwei-Ling Peng, Ph.D

中華民國九十八年八月

縮寫表 ... v 中文摘要 ... vi Abstract ... viii 致謝 ... x 前言 ... 1 實驗材料與方法 ... 6 結果 ... 15 討論 ... 25 參考文獻 ... 29

圖表目錄 附錄一 第三型纖毛組裝機制 ... 39 附件二 本實驗室預測之克雷白氏肺炎桿菌 NTUH-K2044 所有纖毛基因組的基因座 ... 40 附件三 重組第三型纖毛表現質體建構方式示意圖 ... 41 圖一、KpfD 與愛德華氏菌 Etf 纖毛黏附蛋白 EtfD 胺基酸序列的比較 ... 42 圖二 (A)、重組第三型纖毛大腸桿菌 MrkA 免疫螢光染色分析 ... 44 圖二(B)、重組第三型纖毛大腸桿菌凝集天竺鼠紅血球分析 ... 45 圖二(C)、重組大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺鼠紅血球甘露醣競爭分析 ... 46 圖三(A)、重組 KpfD 表現質體 DNA 建構方式示意圖 ... 47 圖三(B)、重組 KpfD 蛋白質純化膠體電泳圖 ... 48 圖三(C)、專一性抗體 MrkA、MrkD 及 KpfD 分析重組第三型纖毛黏附蛋白表現情形 ... 49 圖四、重組第三型纖毛大腸桿菌 KpfD 免疫螢光染色分析 ... 50 圖五(A)、克雷白氏肺炎桿菌第一型纖毛黏附蛋白 FimH 與 KpfD 二級結構比對 ... 51 圖五(B)、克雷白氏肺炎桿菌纖毛黏附蛋白 KpfD 三級結構預測 ... 52 圖五(C)、克雷白氏肺炎桿菌纖毛黏附蛋白 KpfD 與大腸桿菌第一型纖毛黏附蛋白 FimH 三 級結構 alignment ... 53 圖六(A)、重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺鼠紅血球之甘露醣競爭 分析 ... 54 圖六(B)、重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺鼠紅血球之 N-acetyl-D-glucoseamine 競爭分析 ... 55

圖六(C)、重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺鼠紅血球之 D-fucose 競爭分析 ... 56 圖六(D)、重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺鼠紅血球之抗體競爭分 析 ... 57 圖七(A)、不同長度的重組 KpfD 蛋白質表現純化 ... 59 圖七(B)、重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺鼠紅血球與不同長度之 KpfD 蛋白質競爭測試 ... 60 圖八、重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABC]、JM109[pmrkABCD]、 JM109[pmrkABCkpfD]細胞黏附能力測試 ... 61 圖八(C)、重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABC]、JM109[pmrkABCD]、 JM109[pmrkABCkpfD]對肝臟細胞(HepG2)黏附之吉姆薩氏染色測試 ... 62 圖九(A)、Kpf 纖毛建構示意圖 ... 63 圖九(B)、Kpf 纖毛表現情形 ... 64 圖十、大腸桿菌表現 Kpf 基因簇的免疫螢光染色分析 ... 65

圖十一(A)、大腸桿菌 JM109[pkpfABCD]及 JM109[pkpfRABCD]凝集天竺鼠紅血球能力測 試 ... 66

圖十一(B)、大腸桿菌 JM109[pkpfRABCD]凝集天竺鼠紅血球之甘露醣競爭分析 ... 67

附錄四 分析 KpfR 可能的 domain ... 68

縮寫表

APS Ammonium persulfate

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate CFU Colony forming unit

DTT 1,4-dithio-threitol

EDTA N’N’N’N’-ethylenediaminetetraacetate HA Hemagglutination

IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside LB Luria-Bertani broth

NBT Nitro blue tetrazolium PCR Polymerase chain reaction PVDF Polyvinylidene fluoride

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED N’N’N’N’-tetramethylethyl-endiamide DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s

中文摘要

纖毛在細菌感染時扮演黏附宿主細胞的重要角色。基因體解碼後， 序列分析顯示細菌基因體中可比對出多套表現纖毛的基因組，在克雷白 氏肺炎桿菌NTUH-K2044 中，除了第一、三型纖毛基因組外，也發現其 他未曾被報導過的七套纖毛基因組，分別被命名為 kpa、kpb、kpc、kpd、 kpe、kpf 及 kpg 纖毛。先前實驗室建立第三型纖毛表現系統，並以此系 統表現 MrkD 以外的黏附蛋白，藉以探討這些未知黏附蛋白的活性。本 論文除了以免疫螢光標定証實此重組纖毛結構蛋白的表現外，還以血球 凝集試驗確認 KpfD 凝集天竺鼠紅血球的能力，及可被 0.002 M 甘露醣 所抑制凝集作用的黏附特性。同時，我們構築可表現重組 KpfD 蛋白的 質體，在大腸桿菌中大量表現並純化KpfD 重組蛋白來製備多株抗體， 進一步利用此專一之KpfD 抗體藉西方點墨實驗及免疫螢光分析，証實 黏附蛋白KpfD 可以成功的表現於重組纖毛成頂端。接著，我們利用醣 類抑制實驗證實KpfD 黏附蛋凝集天竺鼠紅血球的活性可被 0.001 M 甘 露醣抑制，其凝集活性也可被 0.01 M 的 N-acetyl-D-glucoseamind 抑制 卻不受 D-fucose 的影響；而利用 KpfD 專一性抗體證實此凝集現象確實 經由KpfD 的黏附作用。為了了解 KpfD 與甘露醣交互作用的區域，我 們比較分析KpfD 與第一型纖毛黏附蛋白 FimH 的二級與三級結構，預 測KpfD 與甘露醣交互作用的區域可能在 KpfDD73 至 A83 之間，因此， 我們分別表現並純化包含及不含此預測作用區域的KpfD 截短蛋白，然 而，血球凝集競爭試驗顯示兩者皆無法抑制凝集現象。細胞黏附能力測 試顯示表現重組第三型纖毛的大腸桿菌具有自我凝集(autoaggregation)

的能力，因此，我們建構表現 kpf 纖毛的質體 pKpfABCD 及 pKpfRABCD，

而利用 KpfD 抗體進行西方點墨法及免疫螢光分析，證明 pKpfRABCD

可以使大腸桿菌表現 kpf 纖毛；血球凝集測試也證實帶有 pKpfRABCD 質體的大腸桿菌具有凝集天竺鼠血球的活性，而且此凝集活性可受到甘 露醣抑制。

Abstract

Fimbriae play an important role in establishing an infection by adhering to specific host tissues. The available genome sequences of many

enterobacteria reveal multiple fimbrial loci are commonly contained in a genome. In addition to type 1 and 3 fimbrial gene clusters, seven novel fimbrial operons were identified in Klebsiella pneumoniae NTUH K2044 and named kpa, kpb, kpc, kpd, kpe, kpf and kpg. We have previously generated a type 3 fimbrial display system by replacing the mrkD adhesin gene with each of the fimbrial adhesion genes. In the study, analysis using immuno-fluorescence microscopy (IFM) and western blot hybridization were employed to demonstrate the recombinant type 3 fimbriae expressed properly. The recombinant fimbriae was found to be able to bind to

erythrocytes of guinea pig, and the hemaaglutination (HA) activity was inhibited by 0.002 M D-mannose. In addition, the recombinant plasmid for overexpression of KpfD was generated and transformed into Escherichia

coli NovaBlue (DE3). The heterologous expressed KpfD protein was then

purified for polyclone antibody preparation. The antibody was then used to demonstrate the KpfD was assembled on the tip of the recombinant type 3 fimbriae by western blot and IFM analysis. The HA competition analysis revealed that the agglutination activity could be inhibited by 0.001 M

D-mannose or 0.01 M N-acetyl-D-glucoseamind, but not affected by D-fucose. Furthermore, the KpfD antibody could inhibit the HA activity indicating KpfD adhesin is responsible for the specific binding activity to erythrocytes of guinea pig. Comparative analysis of the secondary and tertiary structure with E. coli FimH revealed a putative mannose binding pocket on KpfD D73 to A83.The recombinant plasmids containing truncation of the KpfD protein with or without the predicted mannose binding pocket were generated and the recombinant proteins purified for competition assay of the HA activity. However, neither recombinant protein could inhibit the HA activity. Cell adherence analysis indicated that the overexpression of the type 3 fimbriae on the surface of the recombinant E.

coli rendered an autoaggregation phenotype. In order to prevent from the

overestimated non-specific cell binding activity, the recombinant plasmid containing kpfABCD or kpfRABCD was generated and the expression of the recombinant kpf fimbriae was assessed by western blot hybridization, IFM assay, and HA activity measurement. The results indicated that the

recombinant E.coli expressed kpf fimbriae on the surface exerted an HA activity that could be inhibited by D-mannose.

致謝

如果人生是首交響曲，這兩年的歷程無疑自成一篇樂章 ; 如果人 生是旅行，兩年的旅程如今告一段落。 這一小段崎嶇不平的路，最要感謝我的指導老師，彭慧玲，老師。 如果沒有您的耐心指導，殷殷教誨，資質駑鈍如我將不會有這篇論文產 生 ; 如果沒有您的溫柔愛心，打氣鼓勵，從精神心靈層面給予支持， 迷網如我將不知會走向何方。感謝兩位口試委員張晃猶 老師與袁俊傑 老師，細心的審閱論文初稿，認真批改加註意見於初稿，並於口試時提 出更多值得我思考的方向，使本篇論文能更臻完善。 兩年來像家一般待著的實驗室，感謝有像家人一般的你們。盈蓉學 姊，像實驗室的小太陽，有妳在的地方就有溫暖歡笑，感謝妳在實驗技 巧，實驗設計及論文寫作上給予的幫助，以及無數的支持鼓勵。健誠學 長、新耀學長、靜柔學姊，是彭家的大支柱，感謝你們對實驗室的一切 付出和對問題的解答追求的態度，都是學弟妹們最好的榜樣。智凱、登 魁、朝陽幾位已畢業的學長，還是很關心實驗室的大家，總是以過來人 的身分鼓勵我們。好同學雅雯、顗峰及志桓，感謝你們兩年來互相幫忙 作伙走過。承哲、哲充、家華及佩君，你們的樂觀開朗及活力，帶給處

於碩二的我們莫大的快樂。崴云、品瑄及豪君是彭家的生力軍，彭家的 傳承要靠你們了。 感謝張晃猶老師實驗室的諸位學長姐學弟妹，你們在實驗材料上無 條件的給予支持，在實驗想法及投影片呈現上給予的指教，讓我在最後 階段獲益良多。特別感謝我的好同學芊瑜，除了在細胞實驗材料上麻煩 妳甚多，更忘不了每一次報告前的打氣小紙條。欣瑜學姊及婕伶學姊， 感謝妳們在實驗上給予的協助以及朋友般的傾聽。感謝吳東昆老師及袁 俊傑老師實驗室成員，除了實驗設備的支援外也總不吝嗇給予一個關心 的微笑。感謝清大游翠蓉老師實驗室國良學長，可愛的兩位學妹惠櫻及 亞璇，也許實驗上沒有幫忙太多，卻是永遠的好夥伴好朋友。 感謝重要的朋友們，姊妹淘嘉怡、牧芸及依蓁，妳們如家人般的存 在，聖德及淳安共享歡憂喜樂，大姐姐嘉怡，不因距離而稍損我們的情 誼，士杰的陪伴加油，以及最摯愛的爸、媽，是我最堅強的後盾，永遠 敞開雙手溫暖安撫我哭泣受創的心。感謝你們，這段旅程因為有你們才 能夠走完，下一個旅行將往何方?我也不知道，唯有帶著堅定的心、穩 健的腳去實踐旅行的意義，期待受到這麼多人灌溉照顧的小樹苗，有一 天也能供一兩人於樹下乘涼。

前言

克雷白氏肺炎桿菌 (Klebsiella pneumoniae) 是一株具有莢膜的革 蘭氏陰性桿菌，屬於腸內桿菌科(Enterobacteriaceae)，不具鞭毛且無運 動性(31)，在LB培養基上會形成大而黏的菌落，在伊紅-甲烯藍瓊脂 (Eosin-Methylene Blue; EMB) 固態培養基上會呈紫紅色。克雷白氏肺炎 桿菌也是一伺機性感染病原菌(opportunistic pathogen)，存在人體的腸胃 道、呼吸道或泌尿道，由於易造成的人類肺炎而得名，也常引發尿道感 染、外科傷口感染、敗血症等疾病，是院內感染及社區性感染的常見病

原菌之一(6, 21, 31, 33)。近年來，亞洲各國紛紛報導出現一新型侵襲性

的克雷白氏肺炎桿菌感染症狀，會引起健康成人或糖尿病病人的肝膿瘍 (pyogenic liver abscess)，有時併發轉移成眼內炎或腦膜炎(22, 44)。自1980 年代到1990年代，克雷白氏肺炎桿菌在台灣造成的單一菌種性肝膿瘍之 比例持續上升，其嚴重性不容忽視(16, 22, 24, 44)。 目前已知的克雷白氏肺炎桿菌致病因子包括(一) 莢膜 (capsule) : 莢膜由多醣類構成，可保護細菌抵抗吞噬細胞的吞噬作用，並且可以抑 制血清中補體的活化。被報導過的莢膜有77種血清型，第二型莢膜（K2） 是歐美最常見且毒性較高的血清型，而在台灣則以第一型莢膜（K1）血 清型居多，引起化膿性肝膿瘍的克雷白氏肺炎桿菌也以K1血清型為主 (27)。近年有報導指出，在台灣引起肝膿瘍的克雷白氏肺炎桿菌和magA 與rmpA基因有高度相關(46)。(二) 脂多醣 (lipopolysaccharides) :脂多醣

可為克雷白氏肺炎桿菌提供血清抗性(31, 38)。(三) 螯鐵分子

(siderophore) :鐵是細菌生長所需的因子，而螯鐵分子和鐵有很強的親和 力，可以奪取宿主的鐵為己用(31)。(四) 纖毛 (fimbriae) :纖毛為細絲狀 毛髮物，突出於菌體外，當細菌進行感染時，會經由纖毛頂端的黏附因 子(adhesin) 專一性的黏附宿主細胞而決定感染的細胞種類。除了第一型 纖毛 (type 1 fimbriae)、第三型纖毛 (type 3 fimbriae)及KPF-28 纖毛，還 有一屬非纖毛的附著因子(non-fimbrial adhesin) CF29K，都曾被報導過能 提供專一性的附著能力(10, 11, 15, 31)。 第一型纖毛長約1 μm寬約7 nm，是由fimABCDEFGHI基因群組轉 譯表現(39)。第一型纖毛會造成紅血球凝集現象，而添加甘露糖會抑制 此纖毛與紅血球的凝集，因此第一型纖毛造成的凝血現象又稱為甘露醣 敏感型凝集（mannose-sensitive hemagglutinins，MSHA）。第一型纖毛 可和宿主細胞表面的醣蛋白結合，克雷白氏肺炎桿菌可利用此型纖毛附 著於宿主的泌尿道、呼吸道或腸道的黏膜及上皮細胞(12, 14, 31)。第三 型纖毛長約0.5~2 μm寬約2~4 nm，由mrkABCDF基因組組成。第三型纖 毛只能凝集被單寧酸處理過的紅血球，且此作用不會被甘露醣抑制，因 此被歸類為甘露醣抵抗型凝集(mannose-resistant hemagglutinins，MRHA)， 但此凝集現象可被亞精胺(spermidine)抑制。克雷白氏肺炎桿菌也可利用 第三型纖毛附著於宿主的血管內皮細胞、呼吸道及泌尿道上皮細胞(17, 41)，也有報導指出此纖毛和克雷白氏肺炎桿菌的生物膜(biofilm)形成有

關 (10, 17, 23, 40)。KPF-28纖毛可使克雷白氏肺炎桿菌附著於腸上皮細 胞 (11)，CF29K則被發現和人類腸細胞株Int-407與CaCo-2的附著有關 (9)。

關於纖毛組裝機制目前可歸類四種類型 : (一)大腸桿菌P pili所代表 的chaperon-usher機制 ; (二)第四型纖毛代表的general secretion機制 ; (三)以curli為代表的extracellular nucleation-precipitation機制 ; (四)以CS1 及CS2 operon所轉錄的CFA/I纖毛代表的alternate chaperon機制(37)。克雷 白氏肺炎感菌的第一型及第三型纖毛其組裝機制類似大腸桿菌的P pili， 以第三型纖毛的組裝為例(附錄一)，首先，纖毛單元體MrkA及MrkD以 第二型蛋白分泌系統Sec分泌途徑將之送到細菌內膜，與位於周膜間隙 的chaperon蛋白MrkB交互作用，幫助纖毛單元體正常折疊並保護其不受 周膜間隙的蛋白脢水解，接著chaperon-subunit複合體與細菌外膜的usher 蛋白MrkC交互作用，將纖毛單元體送出並固著於外膜，形成毛髮狀結 構(5, 35) 。位於纖毛頂端的黏附蛋白，除了擔任感染時的黏附功能外， 也是纖毛組裝的起始者，本實驗室過去的研究指出，缺少黏附蛋白的第 三型纖毛，除了黏附能力缺失外也會造成纖毛結構的改變(18)。典型的 黏附蛋白在序列上常具有相似的組成，在蛋白質N端帶有20至30個信號 肽(signal peptide)，當纖毛蛋白由細胞質送至周膜間隙時信號肽會被切除。 去除信號肽後的黏附蛋白結構可分為兩大部分 : 受體結合區 (receptor binding domain)及菌毛區 (pilin domain)。受體結合區負責專一性的辨認

黏附蛋白結合目標，菌毛區則與纖毛主要組成蛋白交互作用，使黏附蛋 白能座落於纖毛頂端。

許多腸內致病菌株的基因體被解碼後，序列分析顯示這些細菌基因 體中都帶有許多套可轉譯表現纖毛的基因組。例如:沙門氏傷寒桿菌

（Salmonella enterica serovar Typhi）除了較廣泛研究的第四型纖毛及agf、

sef、fim、saf、tcf纖毛操縱子(fimbrial operon)外，由解碼的基因體分析

顯示還有bcf、sta、stb、 stc、std、ste、stg及sth纖毛基因組(8, 42)。大 腸桿菌(Escherichia coli)O157:H7則除了已報導過的MAT及ppdD 纖毛

基因組外，還帶有14套表現纖毛的基因組，這些纖毛基因在一般實驗室

培養的條件下大多不表現(25)。奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) HI4320 在基因體解碼完成後，除被報導過的MR/P、UCA (NAF)、PMF (MR/K)、 ATF及PMP纖毛外，另有12個從未被報導的chaperone-usher纖毛基因組 (29)。 本研究中的克雷白氏肺炎桿菌NTUH-K2044菌株分離自國立臺灣大 學醫學院附設醫院一名40歲男性病患的血液培養，這名病患患有原發性 克雷白氏肺炎桿菌肝膿瘍，合併菌血症及轉移性腦膜炎。而克雷白氏肺 炎桿菌NTUH-K2044的基因體已被定序註解完畢(45)。本實驗室藉由序 列比對發現:在NTUH-K2044基因體中具有九套chaperone-usher pathway 類型的纖毛基因組，包含第一型纖毛、第三型纖毛以及七組未曾被報導 的纖毛，分別被命名為kpa、kpb、kpc、kpd、kpe、kpf 及 kpg纖毛(附錄

二)。同時，分析了105株克雷白氏肺炎桿菌臨床菌株，結果發現kpb以及 kpc纖毛基因組的分佈與K1血清型具有顯著的相關性（p<0.001）(7)。我 們進一步選殖了這些纖毛基因組，將帶有纖毛基因組的重組質體轉型至 大腸桿菌中，藉由大量表現這些重組的纖毛，來分析各個纖毛的黏附特 性。並且置換纖毛頂端的黏附蛋白進一步建構了重組第三型纖毛(附件 二)。透過初步的功能性分析，我們發現重組大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]對天竺鼠紅血球具有很高的凝集能力，而此黏附活 性可被添加甘露醣所抑制(48)。另外有文獻指出，在肝膿瘍菌株的DNA microarray中有一套纖毛基因組的RNA表現量上升(47)，經過本實驗室比 對證實此套纖毛基因組為Kpf纖毛基因簇。基於這些原因，本篇論文希 望探討Kpf纖毛的功能以及在感染時所扮演的角色，希望能闡明此黏附 因子的特性及專一性受質。

實驗材料與方法

生長曲線測試

將隔夜培養的菌液加至新鮮含抗生素的培養液，調整濃度至OD600吸光 值約0.1後於37℃震盪培養，並在不同時間點測量OD600下的吸光值。

染色體 DNA 抽取

將K. pneumoniae以LB培養液隔夜培養，12000 rpm離心5分鐘去除上清液， 加入800 μl lysis solution (200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, 0.2% Triton X-100, 5 mM DTT, 80 μg lysosome)後劇烈震盪，於37℃下作 用30分鐘以打破菌體，之後在Proteinase K濃度為0.1 mg/ml，溫度50℃的 水浴槽作用隔夜。次日將樣本放置冰上10分鐘，加入250 μl飽和食鹽水 輕微搖晃後繼續放置冰上10分鐘，以12000 rpm離心10分鐘，取400 μl上 清液分別加入兩個微量離心管中，每管各加入1000 μl絕對酒精輕輕翻轉， 放置冰上20分鐘後，以12000 rpm離心15分鐘，去除上清液，加入75%絕 對酒精並將沉澱的DNA搖起，再以12000 rpm離心10分鐘，於37℃烘乾 後加入100 μl二次水，放置隔夜後即可使用或放置-20℃冰箱永久保存。

基因表現載體的建構

在本論文中研究的黏附蛋白基因前端皆帶有一段訊息胜肽序列，透過生 物資訊軟體SignalP 3.0( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )確認訊息 胜肽序列長度後，將引子設計在訊息胜肽序列之後，並於正向引子尾端 加上EcoRI限制酵素的切位。利用PCR增幅標地基因後轉殖到yT&A，以 定序確認序列的正確性，接著以EcoRI及yT&A上的限制酵素切位切下目 標基因，再轉殖於表現載體pET30a上。

質體 DNA 快速篩選

取隔夜培養的菌液500 μl經12000 rpm離心5分鐘後吸去上清液，加入50 μl cracking buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) 後將菌塊刮散，再加入50 μl等體積混合的phenol/chloroform溶液混合均 勻，以15000 rpm離心5分鐘，取適量上清液以1%瓊脂凝膠電湧分析。

微量質體 DNA 萃取及瓊脂電泳膠體回收 DNA

使用High-Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid, Taiwan)，依照產品建議的使 用流程抽取質體DNA。另本研究使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid, Taiwan)，依照產品建議使用方式，由瓊脂電泳膠體中回收 DNA。

重組蛋白的誘導表現

將帶有目標基因的重組表現質體pET30a轉型到大腸桿菌NovaBlue(DE3) 或BL21(DE3)。接著將隔夜培養的重組菌株定量稀釋於新鮮培養液LB至 OD600約0.1，37℃搖晃培養至OD600 0.4至0.5之間，再以0.5 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)誘導大量表現重組蛋白。重組 蛋白的Ｎ端皆融合六個His-tag， 因此這些重組蛋白接下來將藉由鎳樹 脂(nickel resin)的親和力管柱來純化 (Novagen，Madison，WI)。

重組蛋白質之純化

由於本研究中的重組蛋白質皆帶有His-tag，因此能藉由鎳金屬離子和His 氨基酸間的親和力純化出目標蛋白質。首先收集誘導表現目標蛋白的菌 液，以10 ml lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl)復溶後，以超音波震盪打兩秒停五秒震盪一分鐘，連續震盪三次， 再以15000 rpm 4℃離心收集菌塊，去除上清液後加入10 ml wash buffer I (50 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100)復 溶後再次離心，並重複此步驟一次。接著將菌塊以10 ml wash buffer II (50 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 2% sodium

deoxycholate)復溶後水平震盪二十分鐘後離心，並重複此步驟一次。離 心完的菌塊以10 ml lysis buffer復溶後再次離心，最後以含有6 N尿素的 binding buffer (5 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.9)復溶

並水平震盪隔夜。隔日純化前再次離心，收集含有目標蛋白質的上清液 進行接下來的純化。在每次純化前先以一次水充分洗過鎳樹脂，再依序 加入12 ml的charge buffer (50 mM NiSO4)及7 ml binding buffer後，加入離

心過的蛋白質溶液，此時帶有His-tag的目標蛋白就能被鎳樹脂抓住而與 其他蛋白質分離。接著依序加入25 ml binding buffer, 15 ml wash buffer (60 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.9)及15 ml elute buffer (1 M imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.9)，並且在加入 elute buffer 後以1.5 ml離心管蒐集溶離出的蛋白質，最後以7 ml strip buffer (100 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.9)洗去殘留在 樹脂上的蛋白質及鎳離子，並將樹脂浸泡於strip buffer中冰於4℃保存。 蒐集的蛋白質則以SDS-PAGE 分析目標蛋白質是否被純化出來。

抗體製備

純化的重組KpfD全長蛋白質(濃度約5mg)溶於含有6N 尿素的PBS，經過 SDS-PAGE分離後再挖膠純化蛋白質，送波仕特公司施打兔子產生多株 抗體。肌肉注射免疫兔子四次後，於免疫後第65日犧牲兔子，取得100 ml 多株抗體。

SDS-PAGE 分析

ml；running buffer 1 ml （3 ml Tris-HCl, pH 8.0）；10% SDS 80 μl；40% （W/V）acrylamide solution（acrylamide：bis-acrylamide= 27.5：1）3 ml； TEMED（N,N,N’,N’-tetramethylethyl-enediamide）9 μl；10% APS 100 μl。 上層膠（stacking gel）的成分為：5% gel：deionized water 1.9 ml；stacking buffer 0.83 ml （1 ml Tris-HCl, pH 8.0）；10% SDS 33 μl；40%（W/V） acrylamide solution（acrylamide：bis-acrylamide= 27.5：1）0.4 ml；TEMED （N,N,N’,N’-tetramethylethyl-enediamide） 5 μl；10% APS 60 μl。 取需 要分析的菌體，加入適量的protein lysis buffer （50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl）將菌體復溶後混合2X loading dye，於100℃ 加熱10分鐘，插冰冷卻後後取適量滴入電泳膠中，通電140伏特20分鐘 後改成90伏特100分鐘，將蛋白質分離後，取出電泳膠，以Coomassie blue （0.25 g Coomassie blue, 45 ml deionized water, 45 ml methanol, 10 ml glacial acetic acid）進行染色。

Coomassie blue 染色

將凝膠電泳後的上層膠切去，浸泡於染色液(0.25g Coomassie Brilliant

Blue R250, 45 ml methanol, 10 ml glacial acetic acid)室溫搖晃10至20分鐘 後，將膠體浸於退染液I (40% methanol, 10% acetic acid)中室溫搖晃30分 鐘並置換退染液I兩次，再將膠體置於退染液II(5% methanol, 7% acetic acid)中退染至能清楚看見蛋白質。

西方墨點法

蛋白質由SDS-PAGE分離後在緩衝液（25 mM Tris-base, 190 mM glycine, 20% methanol, pH 8.8）於25伏特200安培作用50分鐘轉印到纖維膜 (PVDF, ImmobilonTM-P)，進行清洗步驟：在含0.5% Tween-20的磷酸緩 衝液中搖晃10分鐘共2次後以磷酸緩衝液清洗纖維膜一次，再置於含5% 脫脂牛奶的磷酸緩衝液中室溫下搖晃2小時或4℃下搖晃至隔日。重複清 洗步驟後，將纖維膜置於適當稀釋比例的一級抗體中室溫下搖晃2小時， 再重複清洗步驟後將纖維膜置於稀釋10000倍的anti-mouse IgG AP conjugate的二級抗體中搖晃一小時後再重複清洗步驟。最後將纖維膜浸 泡在加有NBT 66 μl和BCIP 33 μl的緩衝液(100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5)當中呈色，呈色反應以去離子水清洗終止反 應。

免疫螢光染色

細菌在LB培養液中於37℃震盪培養16小時後，取20μl溶於磷酸緩衝液 (phosphate buffered saline, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,

1.8 mM KH2PO4, pH 7.3)，以12000 rpm離心5分鐘再復溶於磷酸緩衝液的

方式，清洗菌體兩次，最後回溶於1ml無菌二次水。取經上述方式處理 好的菌液樣品10 μl滴於載玻片上，過火乾燥進行熱固定，再滴上250倍

稀釋的一級抗體，室溫下反應一小時後，以磷酸緩衝液清洗兩次。待載 玻片乾燥後接著滴上100倍稀釋的二級抗體，於室溫下避光反應一小時， 再以磷酸緩衝液清洗兩次。最後待載玻片乾燥後滴上10μl含有10%甘油 的磷酸緩衝液，蓋上蓋玻片並以指甲油固定，於螢光顯微鏡下觀察。

血球凝集測試

參考文獻(2, 43)方法，血球處理: 採台大動物實驗中心飼養天竺鼠的血 液靜置於4℃至分層，以3000 rpm 4℃離心10分鐘後去除血漿，吸取紅血 球經過離心清洗兩次後，以3%的比例稀釋於磷酸緩衝液。另外以丹寧酸 (tannic acid)處理的紅血球則在經清洗後溶於含0.001%單寧酸的磷酸緩 衝液，於37°C水浴作用15分鐘後，再以PBS清洗兩次。細菌處理: 隔夜 培養的細菌濃縮至OD600約為3，並將菌液經15000 rpm離心5分鐘再復溶 於磷酸緩衝液的方式清洗兩次。最後將濃度為3%的天竺鼠紅血球以及 3%經單寧酸熱處理過的天竺鼠血球與菌液以1：1混合，在室溫下靜置30 分鐘後，觀察紅血球凝集現象。紅血球凝集的判斷方式參考文獻方法， 紅血球經30分鐘後沉降於V型盤的底部，若紅血球的範圍和對照組(血球 加磷酸緩衝液)相當，則判定為未凝集 ; 若紅血球沉降的範圍大於對照 組且輕搖V型盤時紅血球具有顆粒感，則判定為有凝集反應。而同一HA 條件下菌液以二分之一倍率稀釋，最後一個判定為有凝集反應的菌液稀 釋倍率即定義為此實驗的HA unit。

細胞培養

人類肝癌細胞株 HepG2 以含有10% 胎牛血清, 0.22% sodium

bicarbonate, 0.03% L-glutamine, 100 unit/ml penicillin/streptomycin, 100 μM sodium pyruvate及100 μM NEAA之Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM)培養液培養。人類結腸細胞株 HCT-8以含有10% 胎牛血清, 0.22% sodium bicarbonate, 0.03% L-glutamine, 100 unit/ml

penicillin/streptomycin, 100 μM sodium pyruvate及100 μM NEAA的RPMI 1640培養液培養。人類腸道細胞株 Int-407 以含10%胎牛血清的Basal Eagle培養液(BME，Hyclone-SH30159-03)培養。將細胞株置於含5%的 37℃恆溫培養箱內培養，每株細胞約三到四天分盤培養。細胞分盤時， 先將培養皿中舊的細胞培養液吸出，加入10 ml 磷酸緩衝液沖洗一次後， 加入2 ml胰蛋白酶溶液(0.01% trypsin、0.02% EDTA)，後置於37℃恆溫 培養箱內5分鐘，使細胞脫離培養皿，接著以10 ml含血清的細胞培養液 沖洗細胞培養皿，將細胞懸浮液吸至15 ml 離心管中，於常溫離心2000 rpm 5分鐘後，將上清液去除，再加入適量細胞培養液，反覆沖吸細胞 塊均勻混合後，取適量濃度種入培養皿中，再將培養液補至總體積10 ml。

纖毛黏附細胞能力測試

參考文獻(18)方法，將腸道表皮細胞株Int407、人類大腸癌細胞株HCT-8 及人類肝癌細胞株HepG2在37℃並含5% CO₂的恆溫培養箱以24孔細胞 培養皿(TPP industries， France)培養，至每格細胞培養皿的細胞數約 1X105，以磷酸緩衝液清洗兩次以去除細胞培養液中補體成分，再加入 不含胎牛血清的細胞培養液，將細胞置於恆溫培養箱中待用。另一方面 欲測試黏附力的細菌菌液離心後以磷酸緩衝液清洗復溶兩次，並調整細 菌濃度為1X107 CFU/100 μl。之後每格細胞培養皿加入100 μl細菌，在 37℃, 5% CO 2恆溫培養箱下靜置1小時，之後以磷酸緩衝液清洗兩次，每 次作用10分鐘，再加入150 μl 0.1% Triton X-100室溫下震盪作用10分鐘 將細胞打破，最後取100 μl菌液以磷酸緩衝液做系列稀釋，以塗盤或滴 菌10 μl方式計數菌數，再推算原始與細胞黏附的菌數有多少，而黏附能 力以推算回收率來代表，將反應前的總菌數與黏附細胞後回收的菌數相 除，得到的百分比即代表回收率。

結果

Kpf 與愛德華氏菌 Etf 纖毛黏附蛋白胺基酸序列的比較

  由附錄二得知Kpf 基因組的結構，可發現是由五個基因所組成。KpfA 為纖毛主要的組成次單位，KpfB 為 chaperone 蛋白，KpfC 為 usher 蛋白，KpfD 為纖毛頂端黏附蛋白，KpfR 則是一個轉錄調控子。利用

NCBI BLAST 比對胺基酸序列，我們發現克雷白氏肺炎桿菌 KpfA 在 功能上與序列上都與愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的 EtfA 相似(34)， 而EtfA 又與 S. marcescens 的第一型纖毛 FimA(28)，Salmonella

typhimurium 的 LpfA(3)及 Escherichia coli O157:H7 的 Z4971(30)具有

同源性，相似度依序為68.9%，38.6%及 39.9%，另外我們比對克雷

白氏肺炎桿菌黏附蛋白KpfD 與愛德華氏菌纖毛黏附蛋白 EtfD 蛋白

質序列（圖一），發現具有約 20%相似度，這些證據顯示克雷白氏肺

炎桿菌Kpf 纖毛與愛德華氏菌 Etf 纖毛很可能為同源基因。愛德華氏

菌屬於腸道桿菌科，是一伺機性病原菌，會造成魚類及鳥類腸道感染 (20)，對 Etf 纖毛的研究不多，目前已知 Etf 纖毛由 etfABCD 基因組

重組第三型纖毛表現及凝血特性分析

重組第三型纖毛表現系統由黃登魁建構(48)，而我們為了確認不同的 重組第三型纖毛表現的穩定性及其特性的再現性，分別以SDS-PAGE 及西方點墨法偵測MrkA 的單體及聚合體，再以 MrkA 專一性抗體螢 光標定偵測細菌表面的重組第三型纖毛表現情形。如圖二(A)顯示， 除了大腸桿菌JM109[pGEMT]表面無法偵測到螢光訊號外，其餘菌株 皆可在菌的周圍偵測到MrkA 的螢光訊號。進一步透過天竺鼠紅血球 凝集分析，我們確認重組的第三型纖毛的菌株具有生物活性，結果如 圖二(B)顯示，表現 KpfD 纖毛頂端黏附蛋白的菌株 JM109[pmrkABCkpfD]觀察到凝集現象最高稀釋倍數可達 32 倍，對照 於表現第三型纖毛的JM109[pmrkABCDNTUH]其凝集現象的最高稀釋 倍數為2，其餘菌株則無觀察到凝集現象。其結果和先前的實驗結果 (48)一致，我們再次確認此重組的 KpfD 黏附蛋白確實具有凝集天竺 鼠紅血球的特性。而由圖二(C)結果顯示，此重組大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD] 在 0.002M 濃度的甘露醣下凝血功能即受到抑 制，表示KpfD 的凝血現象為類似第一型纖毛 FimH 作用的甘露醣敏 感型。

KpfD 專一性抗體製作

我們以pET30a 為載體建構表現不含訊號胜肽的重組 KpfD 蛋白全長 的質體pCS3(圖三Ａ)，將質體 pCS3轉型於大腸桿菌NovaBlue (DE3) 後隔夜培養於LB 中，次日以十分之一比例稀釋至新鮮 LB 中，培養 至OD600 0.4~0.5 間，在加入 0.5 mM IPTG 於 37℃誘導三小時，收集 菌液並以鎳離子親合性管柱加以純化後，將蛋白質溶於含6N 尿素的 磷酸緩衝液中，接著進行SDS-PAGE 分離會與鎳離子親合性管柱結 合的雜質，挖膠再次純化(如圖三(B))，並以此回收的蛋白質對兔子進 行肌肉免疫，得到KpfD 專一性多株抗體。兔子免疫部分經由波仕特 公司完成。接著我們以獲得的KpfD 及實驗室過去製備的 MrkA 及 MrkD 專一性抗體分析重組第三型纖毛黏附蛋白表現情形。如圖三(C) 所示，菌株JM109[pmrkABCkpfD]可以分別被 MrkA 及 KpfD 抗體偵 測到訊號，而菌株JM109[pmrkABCD]則可以分別被 MrkA 及 MrkD 抗體偵測到訊號，結果顯示抗體的專一性良好，並且重組大腸桿菌確 實能成功表現並組裝我們置換的頂端黏附蛋白。

利用 KpfD 專一性抗體分析重組第三型纖毛黏附蛋白 KpfD

表現情形

我們分別使用MrkA 及 KpfD 專一性抗體偵測菌株

JM109[pmrkABCDNTUH]及 JM109[pmrkABCkpfD]表面的重組纖毛表現

情形。結果如圖四所示，菌株JM109[pmrkABCkpfD]可以 MrkA 及 KpfD 專一性一集抗體於菌體表面偵測到螢光訊號，顯示菌株 JM109[pmrkABCkpfD]確實組裝出以第三型纖毛 MrkA 為骨幹並表現 KpfD 黏附蛋白於頂端之重組纖毛。對照組菌株 JM109[pmrkABCDNTUH] 可以MrkA 專一性一集抗體於菌體表面偵測到螢光訊號，但無法以 KpfD 專一性一級抗體偵測到螢光訊號。

第一型纖毛黏附蛋白 FimH 與 KpfD 二級結構比對及 KpfD

三級結構預測

由於KpfD 凝集活性可被甘露醣競爭，顯示 KpfD 和第一型纖毛的黏 附蛋白FimH 有相同的甘露醣敏感型凝集特性，因此我們進一步比對 KpfD 與大腸桿菌 FimH 的二級與三集結構。我們利用生物資訊工具 於PS2 service (http://ps2.life.nctu.edu.tw/) 預測克雷白氏肺炎桿菌黏附 蛋白KpfD 二級結構，並與大腸桿菌第一型纖毛黏附蛋白 FimH 二級 結構比對。結果如圖五(A)顯示，克雷白氏肺炎桿菌黏附蛋白 KpfD 具有一個α-helix 和十七個β-strand，大腸桿菌第一型纖毛黏附蛋白 FimH 則已知有兩個α-helix 和十七個β-strand，兩者在二級結構上具一 定的相似程度。因此我們進一步以已解出結晶結構的大腸桿菌黏附蛋

白FimH(4)為模版，同樣以生物資訊工具 PS2 service

(http://ps2.life.nctu.edu.tw/) 預測克雷白氏肺炎桿菌黏附蛋白 KpfD 三

級結構，並以軟體PyMOL 繪圖呈現。結果如圖五(B)顯示，KpfD 的

Receptor domain (第二十六至第一百七十八個胺基酸) 預測的三級結 構與FimH 的 Receptor domain 兩者的β-strand 在結構上高度相似。

我們參考2002 年發表的文獻(19)指出，比對兩百株尿道感染大腸桿

菌，發現具有保留性胺基酸序列和甘露醣結合能力相關，並將胺基酸 N46 至 D54 區域稱做 mannose-binding pocket。比對 FimH 與 KpfD 的

二級與三級結構，我們發現KpfD 的胺基酸 D73 至 A83 區域與 FimH mannose-binding pocket 在三級結構上相似(圖五(C))，比對胺基酸序列 亦具有保留性，因此我們推測克雷白氏肺炎桿菌黏附蛋白 KpfD 的胺 基酸D73 至 A83 為一段與甘露醣結合特性相關的區域。

重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺

鼠紅血球之醣類競爭分析

由於先前初步的研究指出KpfD對天竺鼠的凝血現象受到甘露醣的抑 制，因此我們進一步研究不同醣類對KpfD凝血現象的影響。圖六(A) 顯示當甘露醣的濃度為0.001M時，菌株JM109[pmrkABCkpfD]的凝血 現象受到完全抑制，並隨甘露醣濃度下降有劑量依存性，當甘露醣的

濃度為0.00001M時不具有抑制凝血的能力。由於醣類和血型表面抗原 有很大的關係，例如常見的人類血球分型中A型和O型血球只相差一 個N-acetyl-D-glucoseamine (GalNAc)表面抗原，而另一種血球分型法 Lewis A型及Lewis B型則只相差一個fucose，因此我們選定此兩種醣 類進一步研究是否能抑制KpfD凝集活性。圖六(B)顯示當 N-acetyl-D-glucoseamine的濃度為0.01M時，JM109[pmrkABCkpfD]的 凝血現象由32倍下降至8倍，當N-acetyl-D-glucoseamine的濃度為 0.001M時則完全不具有抑制凝血的能力。圖六(C)顯示當D-fucose的濃 度為0.01M時，菌株JM109[pmrkABCkpfD]的凝血現象仍完全不受到抑 制。此結果顯示不同醣類對抑制KpfD凝集天竺鼠紅血球的能力不同， 以甘露醣抑制凝血的效果最佳，暗指甘露醣可能與KpfD受體結合區 域的專一性有關。

重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺

鼠紅血球之抗體競爭分析

我們以KpfD 專一性抗體證明在天竺鼠凝血測試中作用造成凝血的確 實是KpfD 黏附蛋白。圖六(D)顯示當 KpfD 專一性抗體的稀釋比例為 100 倍時，能完全抑制菌株 JM109[pmrkABCkpfD]的凝血現象，並隨

抗體稀釋倍率上升而有劑量依存性，當抗體稀釋至 10000 倍時及失去 保護作用。

重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]凝集天竺

鼠紅血球之蛋白質競爭分析

為了驗證我們預測的KpfD 甘露醣結合區域是否正確，我們構築了兩 段KpfD 蛋白質表現載體(圖三 A)，分別是不包含預測的 KpfD 甘露 醣結合區域的pCS1及包含預測的KpfD 甘露醣結合區域的 pCS2。將 質體pCS1及 pCS2轉型於大腸桿菌NovaBlue (DE3)後隔夜培養於 LB 中，次日以十分之一比例稀釋至新鮮LB 中，培養至 OD600 0.4~0.5 間， 在加入0.1 mM IPTG 於 37℃誘導三小時，收集菌液並以鎳離子親合 性管柱加以純化後，將蛋白質溶於含 6N 尿素的磷酸緩衝液中，接著 進行dialysis 降低磷酸緩衝液中尿素的濃度，使純化的重組蛋白質進

行再折疊(refolding)，再以 18.3%SDS-PAGE 分離蛋白質(圖七 A)。純

化後得到可溶性的蛋白質經過濃度分別為：KpfD1 : 0.129 μg/ml 及 KpfD2 : 0.18 μg/ml。接下來我們以不同濃度的重組 KpfD 蛋白進行蛋 白質競爭測試，結果如圖七(B)所示，兩蛋白質在濃度 0.1ug/ml 時皆 能競爭抑制凝血現象，但當蛋白質濃度更低時則兩蛋白質都無法競爭 抑制凝血現象。此一結果無法證明我們預測的KpfD mannose 結合重 要序列正確與否。

重組第三型纖毛大腸桿菌 JM109[pmrkABCkpfD]細胞黏附

能力測試

為了分析克雷白氏肺炎桿菌黏附蛋白KpfD 對人類細胞株的黏附能力， 我們使用三株不同細胞株 : HepG2 (人類肝癌細胞株) ; HCT-8 (人類 結腸癌細胞)；Int407 (人類腸道細胞株)，進行細胞黏附試驗，以細菌 的回收率代表黏附能力，結果如圖八(A)所示。我們發現三株菌株 JM109[pmrkABC]、JM109[pmrkABCD]及 JM109[pmrkABCkpfD]對三株 人類細胞株的黏附力的趨勢大致相同，其中菌株JM109[pmrkABCD] 在不同的細胞株中都有相對最高的回收率，而菌株JM109[pmrkABC] 及JM109[pmrkABCkpfD]則有相近且相對較低的回收率，而 KpfD 對 人類細胞株的黏附能力，與不表現任何黏附蛋白的對照組 JM109[pmrkABC]程度相當甚至更低。另外我們比較三株人類細胞株， 發現重組大腸桿菌對HepG2 細胞的黏附能力明顯比其他細胞株高， 顯示HepG2細胞是此實驗較佳的細胞株模型。 我們進一步以吉姆薩氏(geimsa)染劑染色細胞，於正立式顯微鏡下觀 察重組大腸桿菌與HepG2細胞黏附的情形。結果如圖八(C)顯示，菌 株JM109[pmrkABCD]較傾向於細菌之間自我聚集(autoaggregation)， 造成回收率偏高，而菌株JM109[pmrkABC]及 JM109[pmrkABCkpfD] 則是以單一隻細菌的方式黏附於細胞上，因此回收率較低卻較有代表

性。

克雷白氏肺炎桿菌 Kpf 纖毛基因組的建構與表現

為了避免重組第三型纖毛過度表現造成菌體自我聚集的問題，我們分

別將包含調控區域及不含調控區域的Kpf 纖毛基因組以專一性引子

放大，再接到yT&A 載體上，送入大腸桿菌 JM109 中表現，其中

kpfABCD 以順著載體上 promoter 的方向接入，kpfRABCD 則逆著載體

上promoter 的方向接入(圖九 A)。接著我們以 0.5 mM IPTG 誘導表現

後進行蛋白質電泳分析，結果如圖九(B)所示，我們可於 16.2% SDS-PAGE 分離出菌株 JM109[pkpfRABCD]於分子量約 20 kDa 處大量

表現一蛋白質，推測可能是克雷白氏肺炎桿菌Kpf 纖毛的主要組成次

單位KpfA(分子量為 19.4 kDa)，且此纖毛不需要 IPTG 進行誘導就能

表現，而菌株JM109[pkpfABCD]的表現情形則是與送入 yT&A 載體的 對照組菌株相同。同時我們以KpfD 專一性抗體進行西方點墨法，發 現菌株JM109[pkpfRABCD]可於分子量約 30 kDa 處偵測到訊號，此大 小約為去除信號肽的KpfD 蛋白質分子量。 我們進一步以 KpfD 專一性抗體利用免疫螢光染色的方式，偵測 帶有Kpf 纖毛基因組質體的大腸桿菌表面纖毛表現情形，結果如圖十 所示，菌株JM109[pkpfABCD]無法在菌體表面偵測到螢光訊號，而菌 株JM109[pkpfRABCD]則可以在菌體表面偵測到螢光訊號。此結果顯

示，菌株JM109[pkpfRABCD]透過未知的分子調控 kpfR 基因，可以成 功組裝克雷白氏肺炎桿菌Kpf 纖毛至菌體表面，並且當菌株缺乏 kpfR 基因時Kpf 纖毛就無法表現，顯示 kpfR 基因透過未知的分子及路徑 參與調控Kpf 纖毛的表現。

Kpf 纖毛凝集天竺鼠紅血球特性分析

  我們接著以大腸桿菌JM109[pkpfABCD]及 JM109[pkpfRABCD]進行天 竺鼠紅血球凝集能力測試，分析Kpf 纖毛的生物活性。圖十一(A)顯 示大腸桿菌JM109[pkpfRABCD]具有最高稀釋倍數為 2 的凝集現象， 而大腸桿菌JM109[pkpfABCD]則即使在 1 倍菌液濃度也觀察不到凝集 現象，此結果與前述實驗結果相吻合。我們進一步以甘露醣競爭凝血 現象，圖十一(B)顯示當甘露醣的濃度為 0.001M 時，菌株 JM109[pkpfRABCD]的凝血現象受到完全抑制，此結果也與我們重組 第三型纖毛JM109[pmrkABCkpfD]的結果得以互相闡述。

討論

我們發現表現 KpfD 黏附蛋白的重組大腸桿菌具有很高的凝集天

竺鼠紅血球能力，我們可以用KpfD 專一性抗體去競爭掉此凝集現象，

顯示造成重組大腸桿菌凝血現象的的確是KpfD 蛋白質。我們發現此

凝血現象會受低濃度的mannose 所抑制，不同於愛德華氏菌Etf 纖毛

的凝血現象不受D-mannose 抑制，但對於 fetuin 及 N-acetylneuraminic acid 這兩種醣類的存在敏感(34)，克雷白氏肺炎感菌 Kpf 纖毛的凝血 特性和大腸桿菌第一型纖毛的特性相似(13)，因此我們比對了 KpfD 與大腸桿菌Fim 的胺基酸序列及二級結構，並參考文獻(19, 26, 32, 36) 指出的大腸桿菌FimH 與 mannose 結合的保留序列及重要胺基酸，分 別是N46 至 D54 區域，特別是 Asn46，Asp47 及 Asp54 三個胺基酸， 另外還有疏水性胺基酸例如Phe1，Ile13，Try48，Ile52，Tyr137 及 Phe142，由於當蛋白質折疊成三集結構時分布在重要胺基酸區域四周， 對FimH 結合甘露醣的能力也有不同程度的貢獻。我們根據大腸桿菌 Fim 的 mannose 結合保留位置，推測出克雷白氏肺炎感菌 KpfD 與 mannose 結合的重要序列可能位於 D73 至 A83 之間，因此我們設計 兩段不同大小的KpfD 表現載體，一段不包含我們預測的 KpfD mannose 結合重要序列，另一個則是包含 KpfD 黏附蛋白 mannose 結 合重要序列的全長受體結合區域，分別純化蛋白質進行競爭性凝血實 驗。實驗結果顯示兩蛋白質在濃度0.1ug/ml 時皆能競爭抑制凝血現象，

但當蛋白質濃度更低時則兩蛋白質都無法競爭抑制凝血現象。此一結 果無法證明我們預測的KpfD mannose 結合重要序列正確與否，可能 的原因推測有三 : (一)競爭實驗中純化的蛋白質濃度最高僅 0.1ug/ml， 可能因為濃度太低因此不易比較出包含或不包含mannose 結合區域 的蛋白質競爭凝血能力的差別。(二)由於此二蛋白質大量表現後形成 不溶性的內含體，因此我們以 6N 尿素使蛋白質變性加以純化，再用 透析方式使蛋白質重新折疊，而此過程中蛋白質可能折疊不完全，造 成純化的蛋白質構型和天然構型有所不同，例如原本裸露的結合位置 可能因錯誤折疊而被包覆至結構裡面，造成兩種蛋白質競爭凝血能力 無差別。(三)依照文獻指出(1)，突變 FimH 的 pilin 或受體結合區域會

使mannose 結合區域形成結構上的變構(allosteric)，使 FimH 對

mannose 的親和力大幅增加 ; 另外文獻也指出除了保留性甘露醣結 合區域外，其他在三級結構上分布於此區域四周的胺基酸所帶有的特 性也會影響FimH 對 mannose 結合能力(19)，因此除了我們所預測的 mannose 結合位置之外，其他胺基酸可能也扮演 KpfD 對甘露醣結合 的重要角色。 我們以大腸桿菌的FimH被報導的結晶結構(4)當模版，預測克雷 白氏肺炎感菌KpfD的三級結構，我們發現KpfD黏附蛋白的receptor結 合區域結構和第一型纖毛的黏附蛋白FimH相似度極高，皆為11至12 個β-strand以正-反股配對的方式，形成穩定的手套狀結構，兩者間最 大差別在於FimH有一個α-helix在receptor結合區域的第五與第六個

β-strand之間，而KpfD的唯一一個α-helix則在receptor及pilin區域中間 連結處。但比對KpfD的pilin區域三級結構，卻和FimH不同反而與克 雷白氏第三型纖毛黏附蛋白MrkD的pilin區域結構相似，以α-helix為 主要組成並有較短的β-strand。由此可以推測本實驗室所建構以重組 第三型纖毛表現不同的頂端黏附蛋白有組裝聚合的差異，可能是因為 這些被替換的黏附蛋白的pilin區域與第三型纖毛主要組成次單位 MrkA在三級結構上的差異，導致黏附蛋白與MrkA次單位在聚合時的 交互作用能力改變，進而影響到重組纖毛的聚合及穩定，因此大腸桿 菌的重組纖毛表現系統在此也增加我們探討黏附因子特性時的變 因。 我們進一步選殖克雷白氏肺炎感菌Kpf纖毛的基因組，並於大腸 桿菌中表現，我們發現調控子KpfR的存在與否會影響Kpf纖毛的表現。 分析KpfR可能的domain(附錄四)，發現KpfR蛋白質C端具有GerE功能 性區域 (第170個到第227個氨基酸區域)。GerE屬於LuxR/FixJ 蛋白質 家族，此蛋白質家族依啟動機制不同分為三個次家族 : (1) 雙分子調 控系統 (two-component)中磷酸化活化的蛋白質，例如 : 調控腸內菌 胞外多醣生成的RcsB (2) 受到細菌的quorum sensing分子活化或抑制 的蛋白質，例如 : 調控carbapenem抗生素生合成的CarR (3) 不同於

以上兩者，以自我調控方式活化或抑制的蛋白質，例如 : Ger，會以 helix-turn-helix結構形成雙複合體去結合DNA進行活化。未來我們希 望盡一步KpfR如何調控Kpf纖毛表現的機制。

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附錄 參考 單元 Mrk 蛋白 cha 受周 的u 成毛 錄一 第三 考大腸桿菌 元體MrkA kD 代表纖 白分泌系統 aperon 蛋白 周膜間隙的 usher 蛋白 毛髮狀結構 三型纖毛組 菌P 型纖 A，B 代表 纖毛頂端黏 統Sec 分 白MrkB 交 的蛋白脢 白MrkC 交 構的纖毛 組裝機制 纖毛組裝機 chaperone 黏附蛋白 分泌途徑將 交互作用 脢水解，接 交互作用 毛。 機制繪圖。 e MrkB，M 。纖毛單 將之送到細 ，幫助纖 接著chaper ，將纖毛單 。圖中縮寫 MrkC 為位 單元體 Mrk 細菌內膜， 纖毛單元體 ron-subun 單元體送 寫A 表示第 位於細胞膜 kA 及 Mrk ，與位於周 體正常折疊 nit 複合體 送出並固著 第三型纖 膜外的ush kD 以第二 周膜間隙的 疊並保護其 體與細菌外 著於外膜， 纖毛 her， 二型 的 其不 外膜 形

附件 因組 組織 本實 毛外 kpd 件二 本實 組的基因座 織侵襲性克 實驗室以生 外，另有七 d，kpe，k 實驗室預測 座 克雷白氏 生物資訊 七套類似纖 kpf，kpg 基 測之克雷白 氏肺炎桿菌 訊方式分析 纖毛基因組 基因簇。 白氏肺炎桿 菌NTUH-K 析其基因體 組的基因座 桿菌NTU K2044 完整 體，發現除 座，分別命 UH-K2044 整基因組定 除了第一型 命名為 kpa 4 所有纖毛 定序完成 型及第三型 a，kpb，kp 毛基 成後， 型纖 pc，

附件 本實 組第 與 九套 件三 重組 實驗室過去 第三型纖毛 mrkD，fi 套纖毛頂端 組第三型纖 去透過置 毛表現質 imH，kpa 端黏附蛋 纖毛表現質 置換第三型 質體，建構 aE，kpbD 蛋白基因重 質體建構方 型纖毛頂端 構方式是將 D，kpcD， 重組，最後 方式示意 端的黏附蛋 將第三型纖 kpdD，k 後將質體送 意圖 蛋白的方式 纖毛的mr kpeD，kpf 送入大腸桿 式建構了重 rkABC 基 fD，kpgD 桿菌表現 重 基因 D 共 。

圖一 參考 NC 種黏 EtfD 不同 一、KpfD 考文獻(34 CBI BLAS 黏附蛋白胺 fD 與 KpfD 同但具相似 D 與愛德華 4)所發表 ST 比對克 胺基酸序 fD 具保留 似屬性的 華氏菌Etf 表的愛德華 克雷白氏肺 序列相似度 留性的胺基 的胺基酸。 f 纖毛黏附 華氏菌EtfD 肺炎桿菌 K 度約20%。 基酸，底色 附蛋白Etf D 黏附蛋白 KpfD 與 E 。圖中第三 色灰色標示 fD 胺基酸 白胺基酸 EtfD 胺基酸 三行標示之 示的為Etf 酸序列的比 酸序列，利 酸序列。 之胺基酸為 fD 與 Kpf 比較 利用 兩 為 fD

圖二 以 con 光訊 果 JM JM JM JM 二 (A)、重 MrkA 一級 njugated a 訊號。圖中 。(A) JM1 M109[pmrk M109[pmrk M109[pmrk M109[pmrk 重組第三型 級抗體偵 nti-mouse 中a 代表螢 109[pmrkA kABCkpbD kABCkpdD kABCkpfD kABCfimH 型纖毛大 偵測大腸桿 e IgG 二級 螢光訊號 ABCDNTUH D]; (D) JM D]; (F) JM D]; (H) JM H]; (J) JM1 大腸桿菌M 桿菌重組第 級抗體反應 號觀察結果 H]; (B) JM M109[pmrk M109[pmrk 109[pmrk 109[pmrkA MrkA 免疫 第三型纖毛 應之後，於 果，圖中b M109[pmrk kABCkpcD kABCkpeD kABCkpgD ABC]; (K) 疫螢光染色 毛的表現 於螢光顯微 代表明視 kABCkpaE D]; (E) D]; (G) D]; (I) ) JM109[p 色分析 ，並與FIT 微鏡下觀察 視野下觀察 E]; (C) pGEMT] TC 察螢 察結

圖二 將培 紅血 中箭 照組 對照 察到 釋倍 二(B)、重 培養於GC 血球以1: 箭頭所指部 組JM109[ 照組JM10 到凝集現象 倍數可達 重組第三型 CAA 培養 1 體積比例 部分為此 [pmrkABC 09[pmrkA 象 ; 菌株 32 倍 ; 其 型纖毛大腸 養液中二十 例混合， 此HA 試驗 CDNTUH]觀 ABC]及 JM 株JM109[p 其餘菌株 腸桿菌凝集 十小時的菌 於 96 孔 V 驗中，具凝 觀察到凝集 M109[pGE pmrkABCk 株則無觀察 集天竺鼠紅 菌液，系列 V 型盤靜 凝血現象的 集現象的最 EMT]在 1 CkpfD]觀察 察到凝集現 紅血球分 列稀釋後與 靜置觀察凝 的最終稀釋 最高稀釋倍 倍菌液濃 察到凝集現 現象。 分析 與3%天竺 凝集現象。 釋倍率。正 倍數為2 ; 濃度下仍無 現象最高稀 竺鼠 圖 正對 負 無觀 稀

圖二 醣競 將培 合後 於 驗中 JM 株 到抑 二(C)、重組 競爭分析 培養於GC 後室溫作用 96 孔 V 型 中，具凝集 M109[pmrk JM109[pm 抑制。 組大腸桿 CAA 培養 用一小時 型盤靜置觀 集現象與 kABCDNTU mrkABCkp 桿菌JM109 養液中二十 時，再與3 觀察凝集現 與不具凝集 UH]在不同 pfD] 在 0 9[pmrkAB 十小時的一 %天竺鼠紅 現象。圖 集現象的醣 同濃度的甘 0.002 M 濃 BCkpfD]凝 一倍菌液與 紅血球以 圖中箭頭所 醣類稀釋倍 甘露醣下凝 濃度的甘露 凝集天竺鼠 與不同濃 以1:1 體積 所分際部分 倍率。菌株 凝血功能不 露醣下凝血 鼠紅血球甘 濃度甘露醣 積比例混合 分為此HA 株 不受抑制 血功能即 甘露 醣混 合， A 試 ，菌 即受

圖三 以 K PCR 的酵 的重 三(A)、重 K. pneum R 放大 D 酵素切位轉 重組KpfD 重組KpfD onia NTU NA 片段 轉殖至表 D 表現質體 表現質體 UH-K2044 ，以TA 選 表現載體p 體，分別 體DNA 建 4 染色體 D 選殖到yT ET30a 上 別命名為 pC 建構方式示 DNA 為模 T&A 載體 上，最終得 CS1、pCS 示意圖 模版，以專 體上，再以 得到表現三 S2及pCS3 專一性引子 以引子上帶 三種不同長 3。 子 帶有 長度

圖三 37℃ 稀釋 37℃ 進行 三(B)、重 ℃下LB 中 釋至新鮮 ℃誘導3 小 行 13.5% 重組KpfD 中隔夜培養 LB，培養 小時，收集 SDS-PAG 蛋白質純 養的大腸 養至OD600 集菌液並 GE 分析。 純化膠體電 腸桿菌 Nov 0 0.4~0.5 之 並以鎳離子 。 電泳圖 vablue (D 之間，再加 子親合性管 E3)以十分 加入0.5 m 管柱純化目 分之一比例 mM IPTG 目標蛋白 例 G 於 ，再

圖三 附蛋 37℃ JM SD Mrk 三(C)、專 蛋白表現情 ℃下LB 中 M109[pmrk S-PAGE 進 kA、Mrk 專一性抗體 情形 中培養的大 kABCDNTU 進行分離 kD 及 Kpf 體MrkA、 大腸桿菌 UH]及 JM1 ，再轉漬 fD 偵測重 MrkD 及 菌表現重組 09[pmrkA 漬於PVDF 重組第三型 及KpfD 分 組纖毛JM1 ABCkpfD] 纖維膜上 型纖毛表現 分析重組第 109[pmrkA ，收集菌 上，分別以 現情形。 第三型纖毛 ABC]、 菌液以 13.5 以專一性抗 毛黏 5% 抗體

圖四 分別 二級 JM 驗組 四、重組第 別使用M 級抗體反應 M109[pmrk 組。圖中a 第三型纖 MrkA 及 Kp 應之後， kABCDNTU a 代表螢光 纖毛大腸桿 pfD 一級抗 偵測重組 UH]為正對 光訊號觀察 桿菌KpfD 抗體與 FI 組大腸桿菌 對照組 ; 菌 察結果，圖 免疫螢光 ITC conju 菌的纖毛表 菌株JM10 圖中b 代表 光染色分析 ugated anti 表現。菌株 09[pmrkAB 表明視野下 析 i-mouse Ig 株 BCkpfD]為 下觀察結果 gG 為實 果。

圖五 結構 比較 附蛋 二級 五(A)、克雷 構比對 較大腸桿菌 蛋白KpfD 表示β 級結構比對 雷白氏肺 菌第一型 D 胺基酸序 β-strand。 對於PS2 s 肺炎桿菌第 型纖毛黏附 序列 ; 預 FimH 胺 service (h 第一型纖毛 附蛋白Fim 預測的二級 胺基酸序列 ttp://ps2.li 毛黏附蛋白 mH 與克雷 級結構 列來自 NC ife.nctu.ed 白FimH 與 雷白氏肺炎 表示α BI protein du.tw/) 完 與KpfD 二 炎桿菌纖毛 α-helix ; n database 完成。 二級 毛黏 es，

圖五 (1)克 第一 Fim 以 五(B)、克 克雷白氏 一型纖毛黏 mH 的結晶 PyMOL 軟 克雷白氏肺 氏肺炎桿菌 黏附蛋白 晶結構於P 軟體繪圖呈 肺炎桿菌纖 菌纖毛黏附 白FimH 的 PS2 servic 呈現。 纖毛黏附蛋 附蛋白Kp 的結晶結構 ce (http://p 蛋白KpfD fD 三級結 構(4)。Kpf ps2.life.nc D 三級結構 結構預測 fD 三級結 ctu.edu.tw 構預測 (2)大腸桿 結構預測以 w/) 預測， 桿菌 以 並

圖五 毛黏 將預 bin 白色 的 結構 體繪 五(C)、克雷 黏附蛋白 預測的Kp nding dom 色方框)比 FimH 甘露 構對照顯示 繪圖呈現 雷白氏肺炎 FimH 三級 pfD 三級結 ain 進行 a 比對，結果 露醣結合區 示KpfD 可 。 炎桿菌纖 級結構al 結構(深色 alignment 果如左下小 區域在三 可能的甘 纖毛黏附蛋 lignment 色)與 FimH t，並且針對 小圖所示 三級結構上 甘露醣結合 蛋白KpfD H 三級結構 對保留性甘 。我們以小 上的位置， 合區域。所 與大腸桿 構(淺色)針 甘露醣結 小點標示 與KpfD 所有結果以 桿菌第一型 針對recep 結合區域(大 示出文獻指 D 的預測三 以PyMOL 型纖 ptor 大圖 指出 三級 L 軟