本實驗設計之 Luciferase 報導基因由被切割後之γ-secretase 受質胞內端
AICD-GAL4 與 NICD-GAL4 所驅動而表現，故可假設以 Luciferase 受質反應後偵 測其冷光訊號強度與γ-secretase 之活性呈現正相關性，此報導基因之實驗結果中 C99 細胞株對照組與表現 ATP6V0d1 基因之 Luciferase 冷光訊號並無顯著之差異，
而以 DAPT 與 Bafilomycin A1 處理下冷光訊號強度下降(圖七)；而在 NG 細胞株內 則可觀察到表現 ATP6V0d1 基因之組別冷光訊號顯著上升為對照組之 2.37 倍，同 時以 DAPT 與 Bafilomycin A1 處理下皆可降低訊號強度(圖八)。
此一階段實驗結果顯示表現 ATP6V0d1 基因會顯著增強 NICD-GAL4 所驅動之 Luciferase 基因表現，但並不會顯著影響 AICD-GAL4 所驅動之 Luciferase 基因表 現。此一實驗中 NICD-GAL4 之增強結果可能是因為 Notch 訊號需要 V-ATPase 活 性之緣故，故增強 V-ATPase 活性導致了 NICD-GAL4 訊號之增強。
免疫螢光染色實驗結果
為進一步了解不同蛋白質於細胞中之交互作用之可能與位置，以免疫染色法觀察 細胞內 ATP6V0d1、NCT 與 LAMP2(Lysosome-associated membrane protein 2)於細 胞內之分布位置，結果顯示 C99 細胞株中 ATP6V0d1 與 NCT 於細胞中具重疊之分
布，同時亦與 LAMP2 具重疊分布(附圖一)，顯示其於細胞中可能之交互作用；NG 細胞株中，則可觀察到 ATP6V0d1 與 NCT 於細胞中具重疊之分布，但是與 LAMP2 卻無重疊之分布(附圖二)，顯示其可能具不同之作用機制。
討論與結論
首先讓我們重整個實驗之結果，從本次的研究結果顯示 ATP6V0d1 對於γ-secretase 之活性具有選擇性的影響，在 Western blot 實驗中我們在表現 ATP6V0d1 與
γ-secretase 受質之細胞株中可發現 γ-secretase 對於 NΔE 之切割作用受到 ATP6V0d1 表現之抑制(圖一)，而其對於 C99-GAL4 之切割作用卻有著增強之效果(圖二)；但 是在 Luciferase 報導基因之實驗中卻呈現不同之結果，其結果顯示γ-secretase 對於 NΔE-GAL4 之切割活性顯著的上升(圖八)但是在 C99-GAL4 之切割作用卻無顯著 改變(圖七)，而同時我們檢驗可能受到表現 ATP6V0d1 所影響之溶小體，發現其有 明顯之酸化情形(圖五；圖六)。
為什麼會產生如此之差易？而我們又該如何對這樣的結果作出解釋？因為本研究 內容可大致區分成兩條不同之路徑，所以我們個別討論。而先以前人研究較多之 Notch 路徑著手，從實驗結果中我們可以明顯的發現 Western blot 實驗與 Luciferase 報導基因實驗結果互相牴觸，即 Western blot 實驗中代表 Notch 路徑活性之
NICD-GAL4 表現量之顯著下降與 Luciferase 報導基因實驗中受 NICD-GAL4 調控 之 luciferase 表現量顯著上升，面對這樣相互矛盾的結果，我們勢必進一步考慮實 驗設計背後之意義與參考其他人之研究結果以下結論。從 Western blot 實驗中可以 發現γ-secretase 受質之表現量發生了改變，但這是否直接代表了 γ-secretase 之活性，
在假設人為表現之情況下受質蛋白質最初之表現量不變，則最終於 Western blot 被 抗體辨識之蛋白質則已經於細胞中經過了不同的修飾、切割、分泌、運送等等之 過程，而這其中大部分之過程或多或少有 V-ATPase 參與其中，考量 V-ATPase 酸 化胞器之功能足以影響其運輸、分泌或是胞器內酵素之活性，而我們也確實在實
驗中觀察到表現 ATP6V0d1 增強了溶小體(lysosome)之酸化程度，而如此酸化程度 之改變是否也可能造成實驗中所觀察到之結果。有研究指出 Notch 路徑之正常功 能需要仰賴 V-ATPase 之正常活性(Thomas et al. 2010; Yan et al. 2009)，如果抑制 V-ATPase 之活性將會造成 Notch 路徑無法正確表現其下游基因，我們在 Western blot 實驗中觀察到表現 ATP6V0d1 增強了 V-ATPase 之活性，同時亦觀察到 Notch 訊息路徑中之 NICD-GAL4 表現量減少，NICD 進入細胞核中調控下游基因之表現，
所以當 NICD 減少時代表 Notch 訊息路徑之功能是受到抑制的，但是在 Luciferase 報導基因實驗中我們卻可以看到 Luciferase 訊號顯著之上升，能代表 Notch 下游功 能並未受到抑制，即 NICD-GAL4 能夠正常的轉移至核內驅動 Luciferase 基因表現，
只是在 Western blot 實驗上所觀察到之 NICD-GAL4 表現量減少了。而從前人的研 究中，γ-secretase 降解 Notch 的反應是會被 V-ATPase 的功能影響(Valapala et al.
2013)。配合本次之研究可以推論，在表現 ATP6V0d1 之狀況下，因強化了溶小體 之酸化反應而提升了其對 Notch 之降解功能，並同時促進了 Notch 下游路徑之活化。
NICD 很難在核內被偵測到(Lubman et al., 2007)，可能是因為其帶有 PEST 序列而 能加速其在細胞內之分解(Fryer et al., 2004; Tsunematsu et al., 2004)，從這樣的角度 可以推測 ATP6V0d1 之表現對γ-secretase 切割 NΔE 之活性為促進功能，而 Western blot 中所見之表現量下降原因乃因為 NICD-GAL4 被快速的分解所導致，如此亦能 驗證前人之研究，同時我們亦觀察到 ATP6V0d1 與 NCT 於細胞內重疊分布之情形 (附圖二)。
而在γ-secretase 切割 C99-GAL4 之路徑上我們可以從 Western blot 實驗中觀察到 C99-GAL4 表現量之減少(圖二)，但是在 Luciferase 報導基因實驗中卻無法顯示出 差異(圖七)，這個部分可能需要從數個部分著手來探討，首先 C99 與 APP 於細胞 中可能表現於內質網、高基氏體、細胞膜、內噬體與溶小體(Haass et al. 1992a; Lai et al. 1995; Marquez-Sterling et al. 1997)，並且這樣的位置表現為動態的，故 C99 經 常在細胞內各處移動，當 C99 表現在內噬體與溶小體時部分可能會被γ-secretase
切割，而部分則會經由非γ-secretase 調控之機制而水解(Weidemann et al. 1989)，而 我們可以從 Lysosensor 實驗中觀察到 V-ATPase 之活性受到表現 ATP6V0d1 而增加，
綜合前人所研究之 V-ATPase 功能而言，這樣的改變可能造成 C99 於細胞表面之回 收量增加、分解量增加或是直接的影響了γ-secretase 之活性，因此我們在 Western blot 上觀察到 C99-GAL4 表現量下降卻無法於 Luciferase 報導基因實驗中得到同樣 之結果。同時當我們以γ-secretase 抑制劑 DAPT 與 V-ATPase 抑制劑 Bafilomycin A1 處理時卻可以看到相似之效果，意即 C99-GAL4 表現量上升與 NICD-GAL4 表現量 下降(圖三、圖四)，我們已能預料 DAPT 抑制γ-secretase 活性將會造成如此之結果，
但何以抑制 V-ATPase 之活性會產生同樣之結果，Bafilomycin A1 在細胞中為 V-ATPase 抑制劑，之前所提到之多篇研究已證實其能抑制 Notch 路徑表現，於本 研究中我們也可以在 Luciferase 報導基因實驗中觀察到冷光訊號之下降，而同樣的 訊號下降亦發生於表現 C99-GAL4 之 C99 細胞株，這樣的結果可能顯示了
Bafilomycin A1 透過抑制 V-ATPase 而對γ-secretase 產生抑制作用。而我們亦觀察 到 ATP6V0d1 與 NCT、LAMP2 於細胞內之重疊分布(附圖一)，顯示此交互作用可 能發生於溶小體中，此一現象並無其他相關之研究，故值得進一步的研究。
為了進一步證實可能之作用機轉，未來之實驗內容須針對假設一一做出解答，必 須確認表現 ATP6V0d1 對 V-ATPase 之整體功能是否尚有其他之影響，同時能夠更 加精確的追蹤細胞中 V-ATPase、γ-secretase 與其受質蛋白之表現位置、運輸分泌與 降解過程，在 amyloidogenic 路徑中，專注於γ-secretase 受質 C99 於細胞內之表現 動態，與 AICD 對於其下游基因之調控能力使否受到表現 ATP6V0d1 而影響，我
們可以更進一步檢視其路徑所產生之β-類澱粉蛋白是否有種類上之改變，因
γ-secretase 所產生之 β-類澱粉蛋白具有不同之胺基酸長度，其中又以 42 個胺基酸 長度之片段被認為具有較高之細胞毒性與致病能力(Haass and Selkoe 2007)，此一 部分亦是需要仔細確認的。而在 Notch 路徑中，則需要進一步了解 NICD 於細胞中 之轉移分佈與其降解過程，以了解何以 NICD 表現量於細胞質中下降但是報導基
因訊號卻顯著上升。有鑑於 V-ATPase 與γ-secretase 在細胞內皆參與廣泛之功能，
表現 ATP6V0d1 於細胞內之影響相信是全面且多元的。
因此，本研究之結論為 ATP6V0d1 對γ-secretase 活性之影響具有選擇性，其對於 NΔE-GAL4 之切割作用受到 ATP6V0d1 表現而促進，可能是透過增強 V-ATPase 活 性而達成此一影響，這一點可由前人之研究而推測，故透過直接抑制γ-secretase 活性或是抑制 V-ATPase 活性可以消除此一影響亦與前人之研究相符合；而對於 C99 之切割作用卻有相較之下更為複雜之影響，於 Western blot 實驗中觀察到
C99-GAL4 表現量增加與無顯著差異之 Luciferase 報導基因實驗呈現不一致之結果，
合理之解釋乃表現 ATP6V0d1 可能增強了溶小體降解蛋白質之能力而增強
C99-GAL4 非γ-secretase 路徑之分解效率，同時亦影響了 γ-secretase 活性之雙重功 效下而造成此一結果。
而因為 V-ATPase 所參與之細胞生理層面相當廣泛，如果想要確認其影響γ-secretase 活性之路徑與方法則尚需要更進一步之實驗方可達成，在此希望本實驗能夠為後 來之研究人員提供一些想法與線索，而在未來之實驗上達到實質之幫助，亦期待 能夠早日發現γ-secretase 其精密之調控路徑，以助於阿茲海默症治療藥物之開發，
提升病患生活品質與降低照護負擔。
參考文獻
Alzheimer’s Association. 2008. 2008 Alzheimer’s disease facts and figures.
Alzheimer’s & Dementia 4. 110-133.
Anderson JJ, Holtz G, Baskin PP, et al. 2005.Reductions in β-amyloid concentrations in vivo by the γ-secretase inhibitors BMS-289948 and BMS-299897. Biochem
Pharmacol.69(4):689–698.
Anraku Y, Umemoto N, Hirata R, Ohya Y. 1992. Genetic and cell biological aspects of the yeast vacuolar H+-ATPase. J Bioenerg Biomembr. 24:395–406.
Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. 1999. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science. 284(5415):770-6.
Bauerle C, Ho MN, Lindorfer MA, Stevens TH. 1993. The Saccharomyces cerevisiae VMA6 gene encodes the 36-kDa subunit of the vacuolar H+-ATPase membrane sector. J Biol Chem. 268:12749–12757.
Busciglio J Gabuzda DH, Matsudaira P, Yankner BA. 1993.Generation of beta-amyloid in the secretory pathway inneuronal and nonneuronal cells. Proc Natl Acad Sci.
90:2092–2096.
Busciglio J, Pelsman A, Wong C, et al. 2002. Altered metabolism of the amyloid betaprecursor protein is associated with mitochondrial dysfunction in Down’s syndrome. Neuron. 33:677-88.
Clague MJ, Urbe S, Aniento F, Gruenberg J. 1994. Vacuolar ATPase activity is required for endosomal carrier vesicle formation.J Biol Chem. 269:21–24.
DeStrooper B, Annaert W, Cupers P, et al. 1999. A presenilin-1-dependent
γ-secretase-like protease mediates release of Notch intracellular domain. Nature.
398(6727):518–522.
Dries DR, Yu G. 2008. Assembly,maturation, and traffickingof the gamma-secretase complex in Alzheimer’s disease.Curr Alzheimer Res. 5: 132–146.
Dries DR, Shah S, Han YH, Yu C, Yu S, Shearman MS, Yu G.2009. GLU333 of nicastrin directly participates ingamma-secretase activity. J Biol Chem. 284:
29714–29724.
Duce JA, Tsatsanis A, Cater MA, James SA, Robb E, Wikhe K, Leong SL, Perez K,
Johanssen T, Greenough MA, et al. 2010. Iron-export ferroxidase activity of β-amyloid precursor protein is inhibited by zinc in Alzheimer’s disease. Cell. 142:
857–867.
Edbauer D, Winkler E, Regula JT, Pesold B, Steiner H, Haass C. 2003. Reconstitution of gamma-secretase activity. Nat Cell Biol. 5(5): 486-8.
Faller P. 2009. Copper and zinc binding to amyloid-β: Coordination, dynamics, aggregation, reactivity and metalion transfer. Chembiochem. 10: 2837–2845.
Forgac M. 2007. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and
pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Biol. 8:917–929.
Fryer CJ, White JB, Jones KA. 2004. Mastermind recruits CyeC:CDK8 to
phosphorylate the Notch ICD and coordinate activation with turnover. Mol Cell.
16:509-20.
Haapasaloa A, Kovacs DM. 2011.The Many Substrates of Presenilin/γ-Secretase.J
Alzheimers Dis. 25(1):3-28.
Haass C, Selkoe DJ. 2007. Soluble protein oligomers in neurodegeneration:Lessons from the Alzheimer’s amyloidbeta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8: 101–112.
Haass C, Koo EH, Mellon A, Hung AY, Selkoe DJ. 1992a.Targeting of cell-surface beta-amyloid precursor proteinto lysosomes: Alternative processing into
amyloidbearingfragments. Nature. 357: 500–503.
Haass C, Scholssmacher M, Hung AY, Vigo-Pelfrey C, Mellon A, Ostaszewski B, Liederburg I, Koo F, Schenk D, Teplow D, et al. 1992b. Amyloid β-peptide is produced by cultured cells during normal metabolism. Nature. 359: 322–325.
Hasegawa H, Sanjo N, Chen F, Gu YJ, Shier C, Petit A,Kawarai T, Katayama T,
Hasegawa H, Sanjo N, Chen F, Gu YJ, Shier C, Petit A,Kawarai T, Katayama T,