將細胞培養於白色 96 孔之微量分析盤中，並分別給予 1μg/ml tetracycline、1μg/ml DMSO 處理 24 小時與 200μM Bafilomycin A1 處理 1 小時之後將培養液倒除，加入 20μl 之 1X Passive lysis buffer 充分混和後置於水平搖盪台於 4℃狀態下搖盪 45 分 鐘後，加入 20μl luciferase 受質靜置反應 5 分鐘再使用 Perkin Elmer 1420
Luminescence Counter 偵測其冷光。
細胞免疫染色
於六孔式培養皿中放入蓋玻片，加入 2ml 培養基與 8×104細胞培養 24 小時後加入
1μg/ml tetracycline，經過 24 小時候吸除培養基，加入 1ml 4% paraformaldehyde 處 理 30 分鐘固定細胞，以 PBS 清洗兩次後加入 1ml 0.5% Triton X-100/PBS 處理 15 分鐘，以 PBS 清洗兩次後加入 1ml BSA/PBS 處理 30 分鐘後進行免疫染色。染色 使用一級抗體為 anti-ATP6V0d1 (1:250)、anti-NCT (1:250)、anti-LAMP2 (1:250)於 室溫下處理兩小時，以 PBS 清洗兩次後加入二級抗體 goat anti-mouse IgG (1:500)、
donkey anti-goat IgG (1:500)、goat anti-rabbit IgG (1:1000)於常溫下處理一小時，以 PBS 清洗兩次後加入 DAPI 染劑處理 15 分鐘，以 PBS 清洗兩次後於在玻片滴上 10μl Glycerol/PBS 將蓋玻片蓋上，再以 Leica TCS-SP5 MP 共軛焦顯微鏡 63X 物鏡觀察 樣品。
數據處理與統計
實驗數據統計以對照組為基準以百分比方式呈現各組別間數據之比較，所有實驗 數據之顯著性則以 Student’s t test 統計方式檢驗。
研究結果
ATP6V0d1 對 γ-secretase 之活性影響之實驗結果
為了瞭解 ATP6V0d1 對γ-secretase 活性之影響，在此以 HEK 細胞株分別表現 γ-secretase 之受質 C99-GAL4 與 NotchΔE-GAL4 並以 Western blot 偵測此二受質蛋 白之表現量，以代表γ-secretase 之活性。實驗結果顯示，於表現 NotchΔE-GAL4 之細胞株中，表現 ATP6V0d1 造成 NICD 之蛋白質表現量顯著下降為對照組的 29±20%，(圖一，n=5, p<0.001)，顯示 ATP6V0d1 對γ-secretase 切割 NotchΔE-GAL4 之活性產生抑制之作用，在表現 C99-GAL4 之細胞株中表現 ATP6V0d1 對
C99-GAL4 之蛋白質表現量亦顯著下降為對照組的 52±26%，(圖二，n=6, p< 0.01)，
顯示其能夠增強γ-secretase 切割 C99-GAL4 之活性而造成 C99-GAL4 蛋白質表現 量之減少。
以 DAPT 抑制γ-secretase 活性與以 Bafilomycin A1 抑制細胞內 V-ATPase 活性之結 果顯示於 C99 細胞株中此二種藥物之處理皆可造成 C99-GAL4 之蛋白質表現量顯 著之上升(圖三，n=5, p< 0.01)，而於 NG 細胞株中則可造成 NICD 表現量顯著下降 (圖四，n=4, p< 0.01)，並且在實驗組與對照組中無顯著差異，顯示此二種藥物處理 皆能完全掩蓋表現 ATP6V0d1 所造成之影響。
此一階段之實驗結果顯示，表現 ATP6V0d1 將造成 C99-GAL4 與 NICD-GAL4 之表現量下降，並且因為使用 V-ATPase 抑制劑處理可消除此現象，推測其作用可 能與 V-ATPase 之活性有關。
溶小體酸鹼值測定實驗之結果
近年之研究證據支持 ATP6V0d1 次單元參與 V-ATPase 之酵素活性(Tsuyoshi et al.
2003; Bauerle et al. 1993)，而因 V-ATPase 主要表現於溶小體(Lysosome)，而其功能 係溶小體之酸化，故推測表現其次單元將會對 V-ATPase 活性產生影響，進而影響 溶小體之酸鹼值，故在此以對酸鹼值敏感之染劑 Lysosensor 進行細胞內溶小體之
染色以測量其酸鹼值。溶小體酸鹼值以 Lysosensor 螢光比值對校正曲線求得之酸 鹼值結果顯示在表現 ATP6V0d1 基因之狀態下 C99 與 NG 細胞株之溶小體酸鹼值 皆有顯著之下降，C99 組別 pH 值下降為對照組之 93.87±0.56%，p<0.001，而 NG 組別 pH 值下降為對照組之 90.73±1.36%，p<0.001(圖五；圖六)，並且雖然未達統 計顯著，細胞在以 Bafilomycin A1 處理下溶小體之酸鹼值皆有上升之趨勢。
此一實驗結果顯示表現 ATP6V0d1 基因對於 V-ATPase 活性具有增強之影響，而提 高了其酸化溶小體之效率，造成溶小體酸鹼值顯著之降低。