一般 MALDI 以配備飛行時間 (Time-of-Flight, TOF) 質量分析儀為 主，而MALDI-TOF 主要組成元件為雷射、樣品游離室、TOF 質量分析 儀、離子偵測器及訊號處理系統。而MALDI 的樣品製備方法，是將約 0.5 μl 的基質 (10~30 mg/ml) 以特定莫耳比例與待測分析物混合後，取 約1 μl 置於樣品探針上，待有機溶劑揮發後，樣品會形成類似結晶狀的 固體，即可將此探針送入質譜儀進行分析。當雷射照射在樣品與基質的 混合物上，基質可以吸收雷射能量並扮演能量傳遞的媒介，將所吸收的 能量傳給周圍的樣品分子，使樣品分子得到足夠的能量而在瞬間脫附游 離至氣相，並在外加固定高電壓下，獲得特定的加速動能而進入固定長 度的飛行管，依據到達偵測器時間的不同而達到質量分析的目的。
2-1 MALDI 的發展歷史
早在 1960 年代，就有研究學者利用高能量的雷射光束照射在固體表 面上，可從表面脫附出完整的氣相分子離子，並由質譜儀直接進行偵測。
2-41978 年 M. A. Posthumus 等人利用雷射脫附質譜法成功地分析核苷 酸、胺基酸、胜肽、醣類等生化小分子。12直到 1985 年，利用雷射脫附 質譜法所能得到的質量上限均侷限在2000 Da 以下。13
在1987年的一項學術會議中，5日本Shimadzu公司的研發部門工程師 田中耕一 (K. Tanaka) 發現了當蛋白質分子混以金屬奈米級粉末 (~300Å) 與甘油組合的基質，利用波長337 nm的氮雷射進行照射可將完整蛋白質
分子離子脫附游離而被質譜偵測。次年，田中正式在期刊上發表了以鈷 金屬粉末 (~300Å) 混以甘油的系統做為基質，14再加入樣品溶液充分混 合，利用波長337 nm的氮雷射進行脫附游離質譜分析的方法，可以偵測 到Chymotrypsinogen (25,717 Da)、Carboxypeptidase A (34,472 Da) 以及 Cytochrome c (12,360 Da) 的分子離子訊號，這是使用無機材料輔助樣品 在雷射脫附游離的肇始。而在同年，德國的研究學者M. Karas和F.
Hillenkamp也發表了一種稱為基質輔助雷射脫附游離質譜法的技術，即 MALDI。6利用波長在266 nm的Nd-YAG雷射為照射光源，而在樣品中混 入在266 nm波長有相當吸收率的尼古丁酸 (Nicotinic acid)，一舉將所能偵 測質量範圍擴展至100 kDa左右。由於尼古丁酸能夠吸收並傳遞雷射能量 以提供足夠能量來輔助蛋白質分子從凝相態過渡至氣相離子，便將這種 具有輔助性質的有機小分子稱為基質 (Matrix)。自此之後，許多的研究 學者陸陸續續加入此一研究領域，而開發出各種適合不同樣品的基質，15 以下將簡介目前常用的MALDI基質。
2-2 基質的特性與功能
MALDI 和直接雷射脫附 (Laser desorption, LD) 質譜法的主要不同 點在於MALDI 的樣品中添加了可吸收特定雷射波長能量的基質，藉以輔 助樣品分子的脫附游離。一般商業化的MALDI-TOF 主要以配備波長在 337 nm 的氮雷射為主，也有在波長 355 nm 產生自三倍頻的釹釔鋁石榴 石雷射或2.94 μm 的 IR 雷射可供選擇。一般而言，適合 UV-MALDI 的 基質均具有共軛雙鍵或芳香族環的小分子，而IR-MALDI 的基質取得較 方便，凡是具有特定IR 波長吸收率的化合物如水皆可用來當做 MALDI
基質。一般來說，良好的MALDI 基質必須具備兩個要件：(1) 基質和分 析物分子需有良好的互溶性；(2) 基質對在 MALDI 所使用的雷射波長需 有相當的吸收率 (500~15000 Lmol-1cm-1)。16
一般基質和待測樣品的莫耳比例通常需調整在 100：1 到 50000：1 之間，且會隨著待測樣品分子愈大，所需比例也愈高，如此基質才可提 供足夠能量給分析物以進行脫附。綜合上述，基質主要有三個功能：17 (1) 防止分析物聚集 (Aggregation)
基質在樣品的比例通常遠高於分析物，目的是以基質隔離分析物分 子並防止分析物聚集在一起。如此可使得分析物和基質有較好的共同結 晶化而能加強雷射能量的傳遞及樣品分子的脫附游離化率。
(2) 具有吸收特定雷射波長能量的能力
基質需具有吸收雷射能量的能力，並且能夠將能量傳遞至鄰近分析 物的分子，以提供足夠的能量而將樣品瞬間從凝相態轉換成氣態。
(3) 幫助分析物游離化
基質大多為具有酸性官能基的芳香族有機物，能夠有效提供氫離子 給分析物，因此分析物在過渡至氣相時，可經一連串的離子-分子反應由 基質得到氫離子而被離子化。
因為基質與分析物形成共同結晶化的好壞，會影響能量傳遞給分析 物的效率，因此針對不同極性的分析物分子所選用的基質也應作適當調 整。不同類型的分析物，其適用的基質也不同。如Sinapinic acid 常用於 分析蛋白質、胜肽；醌茜 (1,4-Dihydroxyanthraquinone) 適用於高分子的
分析；而3-HPA (3-Hydroxypicolinic acid) 適用於核苷酸的分析。表一為 常用的基質結構及其適用的分析物類型。15, 18, 19-20
表一、常用的MALDI 基質及適用的分析物
基質名稱 分子量 結構式 型態 適用分析物
3-pyridine carboxylic acid
(Nicotinic acid) 123 Da 固體 蛋白質、胜肽
核醣核酸 α-cyano-4-hydroxy-
cinnamic acid
(α-CHCA) 189 Da 固體 蛋白質、胜肽
3,5-dimethoxy-4-hydroxy- cinnamic acid
(Sinapinic acid, SA) 224 Da 固體 蛋白質、胜肽
2,5-dihydroxybenzoic acid
(2,5-DHB) 154 Da 固體 蛋白質、胜肽
碳水化合物 3-hydroxypicolinic acid
(3-HPA) 139 Da 固體 寡核苷酸
去氧核醣核酸 3-methoxy-4-hydroxy-
cinnamic acid
(Ferulic acid) 192 Da 固體 蛋白質、胜肽
trans-3-indoleacrylic acid
(IAA) 187 Da 固體 蛋白質、胜肽
高分子
3-nitrobenzyl alcohol 153 Da 液體 蛋白質、胜肽
3,4-dihydroxycinnamic acid
(Caffeic acid) 180 Da 固體 蛋白質、胜肽
1,4-dihydroxyanthraquinone
(醌茜) 240 Da 固體 高分子
3-aminoquinoline 144 Da 固體 多醣體
2-amino-5-nitropyridine 139 Da 固體 核苷酸
glycerol
(甘油) 92 Da 液體 蛋白質、胜肽
2-3 樣品在 MALDI 中的脫附游離機制
在 MALDI 中，樣品從凝態相過渡至氣相形成氣相離子，主要包含兩 個過程：即脫附和游離。當固態或液態樣品分子在瞬間 (~ps) 受到雷射 照射吸收能量後，使得樣品分子有足夠能量進行相轉移，即由固相過渡 到氣相，且當此相轉移的速率大於受熱分解的速度時，仍能保持樣品分 子結構的完整性而能脫附游離至氣相，此現象稱為脫附 (Desorption)。而 在此過程中，電荷轉移的反應會同時進行，即一連串的離子-分子反應發 生，樣品分子因而可被游離化而帶上電荷，稱為游離化 (Ionization)。
事實上，基質如何輔助分析物脫附游離的機制，及分析物如何在高 能量的雷射照射下仍能維持其分子本身的完整性並能瞬間從凝相態過渡 成氣態離子，目前其作用機制尚未能夠被完全了解，但已有許多的 MALDI 機制被提出，例如相爆炸、21, 22多光子游離、23, 24激發態氫離子 轉移模型等，25, 26Zenobi 和 Knochenmuss 歸納目前所提出來有關 MALDI 的離子游離機制，將其歸納為兩大類：27即一次離子游離及二次離子游 離。一次游離即中性分子在經一次游離時即可形成離子；二次游離即指 分析物離子的形成，是先經由基質離子形成，再經由基質離子與分析物 碰撞反應才形成。如果能夠了解在MALDI 中形成氣相離子的機制，將有 助於樣品分析的進行，以下將對文獻中已提出之機制做一簡介：28
(1) 相爆炸 (Phase explosion) 模型
MALDI 中的凝相態分子如何能夠在高能量的雷射照射下，脫附游離 成為氣相離子？Sunner 等人針對液態二次離子質譜法 (Liquid Secondary
Ion Mass Spectrometry, LSIMS) 所提出的相爆炸模型應該可以解釋在 MALDI 過程中為何可以產生完整的氣相分子離子。此模型說明當高能量 束撞擊在凝態的樣品上時，樣品會被快速加熱至一相當高的溫度，當達 到所謂臨界超熱 (Critical superheat) 溫度以上時，樣品分子會變得相當 不穩定，而產生相爆炸的現象，此時能量用於將樣品分子從凝相轉移至 氣相，而此相轉移的速度大於熱分解的速率，因此樣品分子得以保持其
完整性。21, 22
(2) 多光子游離 (Multiphoton ionization, MPI) 模型
Ehring 等人所提出的多光子游離模型是目前最常用來解釋 UV-
兩個光子的基質分子的能量加起來，應該足以將一個基質分子激發至激 (4) 激發態氫離子轉移 (Excited state proton transfer)
激發態氫離子轉移是另一個常用來解釋 MALDI 中游離化的機制。即
最常討論的兩種反應。27在氣相中，基質離子與分析物的碰撞反應是否會 進行，取決於基質與分析物的氣相鹼度，即質子親和力。Zenobi 等人根 據文獻中的報導整理出常用的基質其質子親和力約介於183-225 kcal/
mole 之間，27, 33而Harrison 等人測量一般的蛋白質及胜肽發現其質子親 和力約為240 kcal/mole 左右，34所以在碰撞反應中質子由基質離子轉移 到蛋白質或胜肽是一個較容易進行的放熱反應 (ΔG＜0)。
鹼金屬離子加成游離化的反應，常發生在具有羥基官能基的極性分 析物，而過渡金屬離子的加成反應則是一些偏非極性的分析物主要的游 離化方式。35, 36例如銅、銀離子其d 軌域和非極性分子中雙鍵的π鍵具有 相當強的引力，而可以與非極性分子形成鍵結，因此將這些過渡金屬添 加至非極性的樣品如高分子中，可以輔助高分子游離進而能夠被MALDI 分析。
2-4 MALDI 中形成的離子特徵
由於質譜法只能分析帶有電荷的離子，而大部分的基質為具有芳香 環的有機酸，為很好的氫離子 (Proton) 供給者，分析物分子藉此能夠得 到一氫離子而被游離化。因此當樣品分子 (M) 在正離子的偵測模式下，
我們主要觀察到的訊號為帶上一氫離子的假分子離子 (MH+)。如果在環 境中有鈉、鉀的存在，所形成的鈉加成物 (MNa+) 和鉀加成物 (MK+) 也會在圖譜中被發現。而MALDI 是一種軟性游離法，因此大部分以完整 的分子離子存在，離子碎裂程度並不嚴重。
2-5 飛行時間質量分析儀 (TOF) 的原理
當樣品在游離源室 (Ion source) 經由雷射照射而脫附游離時，會同 時被給予一相同的加速電壓 (20~30 kV)，離子因而可獲得足夠的動能進 入飛行時間管。根據eV=KE=mv2/2 (eV 是電場所提供的位能，KE 是動 能，m 代表分析物的質量，v 是飛行速度)，當離子得到相同的的動能時，
質量較小的離子會有較快的飛行速度，質量較大的則反之，在經過一定 長度的飛行管後，根據不同質量的離子到達偵測器時間的不同，可以區 分不同質量的離子，而將到達時間轉換成質荷比 (m/z) 即可得到質譜圖。
飛行管主要由一支長約 1~1.5 公尺的金屬管所組成，金屬管需維持在
飛行管主要由一支長約 1~1.5 公尺的金屬管所組成，金屬管需維持在