將細胞置於96 孔培養盤中培養，調整細胞濃度為 5 × 103個細胞 /100 μl/well，以含 10% 血清 DMEM 培養液培養 16 小時後，加入以 含有不同濃度活化蛋殼萃取物之培養液進行共培養，並測試不同培養 時間的影響。完成後，以PBS 清洗 3 次，加入 100 μl 含 500 μg/ml MTT 的含10% 血清 DMEM 培養液，培養 2 小時，隨後去除廢液並加入 100 μL DMSO 震盪溶解結晶一小時，待結晶完全溶解後讀取 OD570 nm。
計算公式為：細胞存活率 (Cell viability %) = (樣品 OD570 nm －空 白組OD570 nm)/(無處理組 OD570 nm－空白組OD570 nm) × 100%。
(四)、 細胞自體凋亡測試
1. Annexin V 染色分析
採用Annexin V–FITC 配合 PI 雙染進行細胞凋亡偵測，實驗原 理為：細胞膜之雙層脂質結構，內外膜組成略有不同，磷脂質絲氨酸 (phosphotidyl serine, PS) 原為內膜構造，但在細胞凋亡早期細胞膜會 發生磷脂質不對稱性破壞，導致PS 翻轉至膜外。而 Annexin V 是鈣 依賴性的磷脂結合蛋白，會與PS 進行結合，而成為偵測凋亡的指標 之ㄧ。
然而，當細胞呈現Annexin V 染色時，並非全部皆由凋亡所造 成，當細胞在壞死後期，會出現細胞膜破裂，Annexin V 亦可結合上 細胞內膜的PS，故會造成誤判。因此本實驗搭配常用於判定細胞死 活的PI 染劑，將 Annexin V 與 PI 同時進行雙染，以排除破裂細胞所 造成的誤判。
附圖 14. Annxin V 測定法圖述。 (擷取自 http://www.bd.com/)
實驗方法：使用Annexin ＆ PI 商業套組 (ApoScreen Annexin V Apoptosis Kit – FITC, Beckman Coulter, 731718)，依據其說明步驟進 行，將細胞以trypisn 懸浮後，以冰冷的 PBS 清洗 3 次，每管放入 2 × 105個細胞，以500 g、5 min、4℃條件離心，將細胞團塊以 100 μl 1 × Binding Buffer 沖散，並加入 1 μl Annexin V 與 4 μl PI 混勻後，
於冰上避光作用15 min，隨後加入 400 μl 1 × Binding Buffer 中止反 應，於30 分鐘內以流式細胞儀 (Quanta SC flow cytometer, Beckman Coulter, Miami, FL) 進行偵測，使用激發光為 488 nm。
2. Caspase-3 活性分析
Caspase (Cysteine proteases) 家族是細胞凋亡過程中的重要路徑 之ㄧ。而Caspase-3 為 Caspase 家族下游的活化物，活化時導致細胞 死亡與型態改變，故 Caspase-3 常被作為偵測細胞凋亡的指標之一。
本試驗使用商業套組PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit (BD Biosciences, 550914) 進行細胞中 Caspase-3 活性分析，檢測方式如 下：首先將待測細胞計數調整為1 × 106個/管後，以冰冷的 PBS 清 洗兩次，再將細胞移至0.5 ml 的 Cytofix/CytopermTM溶液中，於冰上 靜置20 分鐘，去除溶液後，再以 Perm/WashTM溶液清洗 2 次，隨後 以0.1 ml Perm/WashTM沖散細胞，並加入20 μl 抗體，於室溫下作用 30 分鐘後，以 BD Perm/WashTM將抗體移除，以流式細胞移偵測紅螢 光 (FL-3 濾鏡)。
3. Caspase-9 活性分析
活化 Caspase-3 的上游訊號，目前主要有兩條路徑，分別為 Caspase-8 與 Caspase-9，本試驗挑選 Caspase-9 進行上游訊息測試。
以Western blot 方式進行細胞中 Caspase-9 活性的分析，將細胞經由 各試驗設計之處理方式後收集，先以Protein Assay Kit (Bio-Red) 進行 蛋白質定量，將蛋白質量調整成為 25 μg / lane 後以 SDS-page 電泳 方式進行蛋白質分離，隨後將膠片上蛋白質以半乾式電泳法轉漬到硝 化纖維膜上，將此轉漬膜先以Blocking Buffer (PBS + 0.05%
Tween-20 + 5%脫脂乳) 於室溫下培養 2 小時，隨後去除 Blocking Buffer 並與兔抗人類 Caspase-9 單株抗體 (human specific caspase-9 antibody) 於 4 ℃下共培養 16 小時，以 PBS-T (PBS + 0.05% Tween-20) 洗滌3 次，再以 HRP-結合山羊抗兔 IgG 抗體 (HRP-conjugated polyclonal goat anti-rabbit IgG antibody) 共培養 2 小時，隨後以 PBS-T 洗滌3 次，加入 1 ml 反應基質作用一分鐘後，以 BioSpectrum AC Imaging system. (Ultra-Violet Products Ltd.; Cambridge, UK) 進行冷光 偵測。
4. 粒線體功能分析
粒線體為重要的胞器與細胞的存亡息息相關，當細胞進行凋亡時 粒線體的功能喪失，與Caspase-9 的活化有直接關係。當粒線體正常 維持呼吸鏈運作時，會將化學能貯存於粒線體內膜上，使粒線體產生 內負外正的電位差，也因此當粒線體失去功能時，電位差會消失。於 是利用粒線體電位差的原理，以脂溶性可穿透細胞膜的正電分子 rhodamine 123 進行染色，rhodamine 便會與粒線體內膜結合。
rhodamine 123 與細胞於室溫下培養 15 分鐘後，以流式細胞儀偵測紅 螢光 (FL-3 濾鏡)。
六、統計分析
本研究之統計方法主要採用SigmaStat 3.1 軟體，使用one-way ANOVA (analysis of variance) 及LSD (least significant difference) 分 析各組間的差異性。並以p < 0.05為達顯著差異水準，p < 0.001為達極 顯著差異水準。所有結果皆以平均加減標準偏差(mean ± S.D.)表示。
肆、結果
一、靑蛋殼膽綠素萃取與分析
(一)、 建立膽綠素測定指標
為評估各種變因對於蛋殼中膽綠素萃取效率的影響，本實驗首先 建立一簡易的膽綠素吸光值偵測法。將商業膽綠素、青蛋殼酸解液與 白蛋殼酸解液進行全波長吸光值掃描 (圖 1)，結果顯示：商業膽綠素
於波長OD375 nm 處具有一吸光波峰，而青蛋殼酸解液亦是，蛋白蛋殼
酸解液則較不明顯，因此判定OD375 nm 最適合做為青蛋殼中膽綠素含 量之測定指標。
(二)、 建立最佳之青蛋殼酸解方法
由於青蛋殼中膽綠素與蛋殼礦物質緊密結合，為取得蛋殼中膽 綠素成分，因而必須將蛋殼中礦物質進行分解，本實驗嘗試以乙二胺 四乙酸 (EDTA) 進行蛋殼中鈣離子之螯合，並與硫酸、鹽酸、醋酸 等酸液進行蛋殼分解，測試OD375 nm 測定，初步結果以醋酸浸泡較 佳，因此以醋酸作為酸解溶液，進而試驗最佳作用濃度與作用時間，
結果以醋酸作用最佳酸解效率，其酸解溶液外觀，如圖 2 A 所示。
(三)、 建立最佳之青蛋殼酸解方法
當蛋殼酸解完畢後，蛋殼中膽綠素等物質會溶解於其中，但其濃 度較低且酸度極高，因此必須發展出適當的萃取方式，才可使用於後 續的有效活性之研究。含有綠色色素之物質會懸浮於上方有機層中 (圖 2 B)。
(四)、 靑蛋殼抽提液之 HPLC 圖譜分析
為進一步確認抽提液是否具有膽綠素成分，本實驗以HPLC 進行 蛋殼抽提液分析。首先以商業膽綠素測試條件，在極性與非極性液體 濃度改變之下，C-18 管柱所結合的膽綠素約於滯留時間 (retention time, RT) 4.64 分鐘流出，為波長 371 nm 可見光所偵測 (圖 3 A)，進 一步將此波峰進行一次的可見光全波長掃描，分別於371 nm 與 635 nm 呈現吸光波峰 (圖 3 B)，此標準品測試結果與先前分光光度計所 分析之吸光波長相似。
將青殼蛋抽提液以同樣條件進行HPLC 分析，可見於 RT 1.33nim 與4.61 nim 處具有兩個主要波峰 (圖 4 A)，且 RT 4.61 nim 波峰佔有 面積比率很高，進一步將波峰以全波長掃描，可見此波峰在371 nm 與635 nm 下具有最強吸光值 (圖 4 B)，顯示膽綠素為青蛋殼抽提液 中的主要成分。而在白殼蛋抽提液的分析圖譜中，則僅餘RT 1.33 min 處有一主要波峰 (圖 5 A)，雖在 RT 4.64 min 處亦有細碎波峰，但經 全波長掃描後，證實並非為膽綠素成分 (圖 5 B)。因此判定白殼蛋抽 提液中並不含或僅含少量膽綠素成分。
二、抗氧化能力測定
(一)、 清除 DPPH 能力之測定
無論是在白蛋殼或是青蛋殼抽提液中，都不具有還原DPPH 的 能力，其清除DPPH 的效率與溶劑組之間並無差異，然而正對照組 α-生育醇 (Vit E)，具有極顯著的清除 DPPH 能力 (p < 0.001)，結果 得知蛋殼抽提液不具有供氫還原自由基之能力 (圖 6)。
(二)、 清除超氧陰離子能力之測定
本試驗結果証實：青蛋殼與白蛋殼抽提液之清除超氧化陰離子能 力明顯高於溶劑組 (p < 0.001)。但青蛋殼與白蛋殼抽提液兩者之間 並無差異，由此可推測青蛋殼抽提液的清除超氧陰離子能力，並與 蛋殼顏色差異無關，亦非由膽綠素所致 (圖 7)。
(三)、 清除脂質過氧化物能力之測定
過氧化脂質會導致體內的游離金屬氧化，進一步造成後續體內 氧化反應，由圖 8 可知青蛋殼抽提液會明顯的抑制脂質氧化所造成 的過氧化物產生 (p < 0.001) ，而白蛋殼抽提液則不具有清除脂質過 氧化物的能力。比較商業上常使用的人工合成防腐劑丁基羥基甲氧
苯 (butylated hydroxyanisole, BHA)，靑蛋殼抽提液中約有 60 mM BHA 的抗過氧化脂質能力，推測青蛋殼萃取物的抗脂質氧化能力來 自於蛋殼顏色差異造成，可能為膽綠素所致。
三、抗腫瘤能力之測定
(一)、 活化蛋殼萃取物抑制腫瘤細胞能力之研究
1. 濃度與處理時間對肝臟腫瘤細胞抑制能力的影響
對huh 7 細胞進行不同濃度與不同時間的活化青殼蛋萃取物處 理。結果顯示：huh 7 會隨著活化靑蛋殼萃取物處理濃度的上升與處 理時間的增加，而存活率隨之下降 (p < 0.001) (圖 9 A)。將白蛋殼以 相同方法製成活化白蛋殼萃取物，以同樣方式測試其對huh 7 細胞存 活率之影響，結果顯示：活化白蛋殼萃取物與靑蛋殼同樣具有抑制 huh 7 細胞存活之能力(圖 9 B)。
2. 對不同細胞株存活率之影響
比較活化青蛋殼萃取物對肝臟腫瘤細胞株Hep G2、huh 7、肺癌 細胞株 A549 與乳癌細胞株 MCF 7 等 4 株腫瘤細胞存活率之影響，
結果顯示以含4% 活化靑蛋殼萃取物的培養液處理，對肝臟腫瘤細胞 株huh 7 與 Hep G2 最具明顯的抑制效果。而小鼠胚胎纖維母細胞 MEF 與人類骨髓幹細胞株HBM 01 做為非腫瘤細胞之對照組，結果顯示：
活化靑蛋殼萃取物並不會對HBM 01 產生毒害；而在初代培養的 MEF 實驗中，以含4%活化靑蛋殼萃取物的培養液與細胞處理 48 小時後，
Hep G2 與 huh 7 明顯地減少 40% 與 50% 的毒殺效果 (p < 0.001)(圖 10)。結果推論：靑蛋殼萃取物具有選擇性抑制肝臟腫瘤細胞 Hep G2、
huh 7 的能力，而其中又以 huh 7 的感受性最強。
3. 對肝臟腫瘤細胞型態之影響
以光學顯微鏡觀察細胞型態，明顯地發現無論是Hep G2 或 huh 7 細胞經過靑蛋殼萃取物處理24 小時後，除了細胞數目減少之外，細 胞也會產生明顯的皺縮現象，在靑蛋殼處理組中的細胞體積甚至僅有 溶劑對照組的ㄧ半 (圖 11)。然而，觀察 MEF 在相同處理後，細胞數 目雖有減少，但在型態上並無皺縮情形，仍維持其正常細胞型態。
當以PI 進行細胞核染色時，也發現肝臟腫瘤 Hep G2 與 huh 7 細 胞在經過活化靑蛋殼萃取物處理過後，細胞亦有皺縮現象，而且細胞 核萎縮的比例較細胞型態皺縮的改變更大 (圖 12、13)。
(二)、 活化蛋殼萃取物影響細胞自體凋亡之測定
1. 影響細胞外膜之組成
以活化青殼蛋萃取物處理後之huh 7 細胞進行 Annexin V 與 PI
以活化青殼蛋萃取物處理後之huh 7 細胞進行 Annexin V 與 PI