國立宜蘭大學動物科技學系(研究所) 碩士論文 Department of Animal Science National Ilan University Master Thesis

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國立宜蘭大學動物科技學系(研究所)

碩士論文

Department of Animal Science National Ilan University

Master Thesis

鴨蛋殼中抗氧化與抗腫瘤物質之萃取與分析 The analysis of the antioxidant and anti-tumor complex in

the extract of duck eggshell

指導教授:林佳靜 博士

Chai-Ching Lin, Ph. D.

研究生:汪世崇

Shih-Chung Wang

中華民國九十七年七月

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誌謝

本論文謹獻給我的父親 汪維堅先生,我的母親 鄧春香女士。感 謝你們對我近似溺愛般的支持與鼓勵,讓我無憂無慮的前進與成長,

縱使千言萬語仍言不及義,謝謝你們給予我的所有,假若我有任何一 絲的榮耀,都將是你們的功勞,一切的一切願與你們共享,爸、媽我 真的很愛你們。

而這兩年的研究生涯中,太多人給予我幫助,我將牢記在心,感 謝校長 江彰吉老師,在百忙之中撥空指導,給予許多珍貴建議,讓 本論文更臻完整;感謝 郭村勇老師與宜蘭分所 黃振芳主任,細細校 閱我的論文,耐心指導與改正,使之不至錯誤百出;感謝 陳怡伶老 師,在我未知的領域中為我引導方向,提供知識與材料的支援,讓我 得以完成論文實驗;感謝宜蘭分所 劉秀洲主任,提供我實驗的主原 料,給予我許多鴨蛋的相關知識,讓我知道在青殼蛋的路上我不孤 單;謝謝 吳輔佑主任常常給予我的腦力激盪,給我許多不同的想法,

很高興能向您學習;感謝熱血的 許惠貞老師,給予多方協助,也讓 我感受您到那份對學生的熱情;感謝 陳銘正老師、李德南老師、鄭 永祥老師、楊价民老師能重新回到宜蘭上到你們的課,常常讓我在深 夜,感動的不能自己;謝謝 陳裕文老師在我試驗期間,提供我多種 儀器設備使用;謝謝 陳威戎老師,在您身上學到許多分析的知識;

也感謝 李意娟老師向母親一般的細心照顧,能夠在你們周邊跟著學

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習,真的是非常非常幸運的一件事。

此外,我要特別感謝實驗室夥伴們,首先是泳沖學長,一直記得 你在教授實驗的身影,那份從容與自信可能是我永遠都學不來的,在 我的心中你一直扮演偶像角色;再來是可愛的楹涵,懷念妳尖銳的大 叫與快速的咀嚼,欣賞妳那份果斷與豁達,祝福妳與妳家的葳葳能像 小說一般的幸福快樂;而卓臻大哥,雖然常常跟你鬥嘴,但其實骨子 裡是很佩服你的,或許只是想逞口舌之快,讓我們差距看起來別這麼 遙遠,對你有很多想說:實驗別亂搞、對學妹別太好、別太常請客…,

最重要的是趕快找個對象吧,有時真的覺得你很孤單啊!珍重了我在 內心尊重的好友,有你在的實驗室會令人十分放心;欣潔妹妹,謝謝 妳不時的體貼與關心,聰明與細心如妳,想必能成為最佳的實驗室總 管,繼續奔跑吧,我們會一起瘦下來的;而莉萍妹妹你對事情的計畫 與事前準備動作之周全,我真應該好好向妳學習,多點細心,把實驗 的時間排開一點,我相信妳會做的非常棒;至於誹聞未完成式的佳怡 妹妹,妳曾是我內心的一陣驚嘆,現在的妳在實驗方面已經爐火純青 了,唯一該注意的是妳的身體,好好照顧自己,好嗎?而大四的小朋 友們:冠名 (誰?) 你的自信與快樂是你很大的優勢,繼續保持這份 自信,我很看好你,能和你一起進行實驗這段時間我很開心;而旻臻 (又是誰?) 妳一定要記住妳是最好的,多點自信大刀闊斧的去做 吧,妳一定可以做的很好,能和這麼可愛的學妹一起共事,都覺得自

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己好幸運;而欣茹啊!一定要把你喜歡生病的興趣改掉,妳的認真與 細心讓我自嘆不如,和佳怡一樣都只有身體令人擔心,有健康的身 體,才有快樂的一切。此外,也感謝怡伶老師實驗室的惠惠小姐,在 實驗技術上的指導,與國榮先生的協助。而大三的小朋友們:我們的 認識還沒有這麼深,沒辦法跟你們說些什麼,只能跟你們說要好好做 自己想做的事情,好好加油。還有聰明的靖于學姐、帶給我許多歡樂 的家騰大哥、中字輩的儼嶔、遠走他鄉的婷婷,仍在學海中翻滾的千 媚與文彥多謝你們這段日子的陪伴。而我親愛的九位同學們:特別是 琇茹與浩均實驗期間一直麻煩你們,在此致上最深的謝意,此外與我 一起四處漂流的昌偉,無論是在宜蘭或是在嘉義,都很謝謝你的照 顧。最末,與我同樣悶悶的育京,很高興在碩士生涯能有你這能一同 分享心事的好友,文行至此,似乎還有很多感謝沒說出口,就套用國 中課本上所說的:需要感謝的人太多了,就感謝天罷,謝謝在我週遭 的一切。

在文章的最後,要特別謝謝我的指導教授 林佳靜老師,在兩年 的時間裡,將我原本那空泛的自信粉碎,並幫助我重新堆積出我扎實 的價值,我會一直記得妳豪邁的笑聲與妳一再告訴我的「創造力」,

很慶幸在我的學業生涯中,能接受這樣一位才貌兼備的教授指導。印 象非常非常深刻,在我第一次專討時,老師坐在我身旁一句一句的訂 正我那極糟的英文,那時的情景我會一直記得,藏在心裡深深感動著。

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目錄

中文摘要 ... 04

英文摘要... 06

圖次... 07

附圖次... 09

附表次... 10

壹、前言... 11

貳、文獻檢討... 13

一、蛋殼生產與再利用... 13

(一)、台灣養鴨產業與青殼鴨蛋的生產 ... 13

(二)、蛋殼之形成... 15

(三)、蛋殼色素之形成... 18

(四)、蛋殼顏色對經濟性狀之影響 ... 21

(五)、蛋殼成分的再利用... 24

二、膽綠素 ... 27

(一)、膽汁色素的生理代謝 ... 27

(二)、膽綠素的生理活性 ... 32

參、材料與方法 ... 44

一、試驗大綱... 44

二、蛋殼有效成分抽提與萃取... 46

(一)、樣品挑選... 46

(二)、蛋殼前處理... 46

(三)、蛋殼酸解... 47

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(四)、蛋殼酸解液之液相抽提... 47

(五)、真空減壓濃縮... 48

(六)、樣品測試... 48

三、靑蛋殼抽提液之保健成分分析... 49

(一)、蛋殼抽提液之可見光吸光值分析 ... 49

(二)、蛋殼抽提液之高壓液相層析儀分析 ... 49

四、靑蛋殼抽提液之抗氧化能力測定... 50

(一)、清除 DPPH 能力之測定 ... 50

(二)、清除超氧化陰離子能力測定 ... 51

(三)、抗脂質氧化能力測定... 52

五、活化蛋殼萃取物抗腫瘤能力之測定... 53

(一)、細胞培養... 54

(二)、細胞染色與型態觀測... 55

(三)、細胞存活率測試... 56

(四)、細胞自體凋亡測試... 57

六、統計分析... 61

肆、結果 ... 62

一、靑蛋殼膽綠素萃取與分析... 62

(一)、建立膽綠素測定指標... 62

(二)、建立最佳之青蛋殼酸解方法 ... 62

(三)、建立最佳之青蛋殼抽提方法 ... 63

(四)、靑蛋殼抽提液之 HPLC 圖譜分析 ... 64

二、抗氧化能力測定... 65

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(一)、清除 DPPH 能力之測定 ... 65

(二)、清除超氧陰離子能力之測定 ... 65

(三)、清除脂質過氧化物能力之測定 ... 65

三、抗腫瘤能力之測定... 67

(一)、活化蛋殼萃取物抑制腫瘤細胞能力之研究 ... 69

(二)、活化蛋殼萃取物影響細胞自體凋亡之測定 ... 70

伍、討論... 72

陸、結論... 80

柒、參考文獻... 81

捌、附錄... 104

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摘要

台灣養鴨產業發達,其中鴨蛋產品主要以加工方式呈現,因而產 生大量的蛋殼廢棄物,目前國內廢棄鴨蛋殼多以焚化方式處理,而雞 蛋殼的產量較大,多半以壓碎製成堆肥使用。本研究期望於廢棄蛋殼 中開發出具有高經濟價值的保健成分,以提高畜產加工業的經濟效 益。

本論文目標有二:由青蛋殼中萃取出具有抗氧化活性的成分物 質,已知青蛋殼中含有膽綠素,而膽綠素已被證實具有抗氧化、抗突 變與抗發炎等生理活性,本試驗預期由靑蛋殼中開發出具有活性的膽 綠素或其他有效抗氧化成分。再者,本研究對民間流傳的青殼蛋具有 抗腫瘤之說感到興趣,期望能由青蛋殼萃取物中開發出具抗癌新藥之 物質。

在本試驗過程中,已建立一有效的萃取流程,不僅可分離出含有 抗氧化活性的蛋殼抽提液,而且於加工後具有抗肝臟腫瘤的功能。進 行靑蛋殼中有效成分之抽提,並以光電比色計吸光測試與 HPLC 分 析,證實其中含有膽綠素成分。繼之,將蛋殼抽提液進行三種抗氧化 能力測試:清除 DPPH 能力、SOD-like 活性與抑制脂質過氧化物能 力等。結果顯示:青蛋殼抽提液具有明顯抑制脂質過氧化物的能力,

而白蛋殼抽提液則否,推論為膽綠素成分所致;在 SOD-like 活性測

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試中,靑蛋殼與白蛋殼抽提液兩者皆具有活性,故推測 SOD-like 的 活性是由蛋殼抽提液中非膽綠素的其他抗氧化成份所影響。至於清除 DPPH 的能力,則青、白蛋殼抽提液兩者皆無。

再者,進一步將蛋殼抽提液進行加工處理,發現活化的蛋殼萃取 物對於肝臟腫瘤細胞株 HepG2 與 huh 7 均具顯著性的抑制效果,其 中又以 huh 7之感受性最強。然而,對於鼠胚的初代纖維母細胞 (MEF) 與人類幹細胞株 (HBM01) 的抑制作用則顯著較低 (p < 0.001)。當更 深入探討抗腫瘤的作用機制時,發現活化的蛋殼萃取物會導致肝臟腫 瘤細胞 huh 7 的粒線體活性降低,並且提升細胞內Caspase-9 與 Caspase-3 的活性,進而導致 huh 7 細胞進行自體凋亡 (apoptosis)。

總結上述:本論文為首次發表蛋殼萃取物中具有抗氧化與抗腫瘤之研 究,預期將來可由蛋殼萃取物中開發出具有高經濟價值的保健成分或 抗癌新藥。

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Abstract

The duck industry is vigorously developed in Taiwan. However, the by-product of eggshell is wasted and may cause the environmental pollution. In order to re-utilize the waste to raise the economical value, we tried to extract the high valuable component from the eggshell. Based on the traditional Chinese medicine, the blue egg shell has been believed to be an important medicine-inducer. Some reports indicated that the pigment of blue egg was biliverdin. Biliverdin has been proven to be an important antioxidant, anti-mutagen and immunoregulator in physiology.

We considered that there should be some antioxidants existed in blue eggshell, especially biliverdin.

There were two major objectives in the present study, which were to extract the antioxidative activities of biliverdin and other substrates from blue eggshell, and to assay the anti-tumor ability of the extract. In this study, we obtain the crude extract of eggshell. The biliverdin component in the crude extract was detected by spectrophotometer and by HPLC.

Also, the crude extract of blue eggshell has been proven to have the antioxidative ability to prevent the lipid peroxideation, but that of white eggshell didn’t. Moreover, the crude extract was concentrated by vacuum and then heated to be the active extract. The active extract after heating process has been found to strongly inhibit the proliferation and induce the apoptosis of liver tumor cell lines, huh 7 and Hpe G2, especially huh 7.

However, the cytotoxicity was much lower to the human bone marrow cell (HBM 01) and the primary culture of mouse embryonic fibroblasts.

Also, we proved that the heated eggshell extract could cause huh 7 apoptosis by triggering the pathway of Caspase-9 and Caspase-3 caused by the depolarization of mitochondria.

It is the first time to find the anti-tumor complex existed in eggshell in this study. It may be valuable to develop a new anti-tumor drug from the heated extract of eggshell in the future.

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圖次

圖1. 比較靑蛋殼醋酸水解液與商業膽綠素純化合物之吸光波值 ... 86

圖2. 酸解與抽提後,蛋殼液之外觀。 ... 87

圖3. 商業膽綠素之 HPLC 圖譜 ... 88

圖4. 青蛋殼抽提物之 HPLC 圖譜 ... 89

圖5. 白蛋殼抽提液之 HPLC 圖譜 ... 90

圖6. 蛋殼抽提液之清除 DPPH 能力 ... 91

圖7. 蛋殼抽提液之清除超氧化物陰離子之能力 ... 92

圖8. 蛋殼抽提液抑制脂質過氧化物之能力 ... 93

圖9. 活化蛋殼萃取物不同濃度與時間處理對 huh 7 細胞存活率之影 響... 94

圖10. 活化青蛋殼萃取物對不同細胞株存活率之影響 ... 95

圖11. 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤細胞與小鼠纖維母細胞型態之 影響... 96

圖12. 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤細胞 huh 7 細胞核型態之影響 ... 98

圖13. 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤細胞 Hep G2 細胞核型態之影響 ... 99

圖14. 活化靑蛋殼萃取物處理對肝臟腫瘤細胞 huh 7 自體凋亡率的影 響... 100

圖15. 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞 Casepase-3 活化之 影響...101 16. 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞中 Casepase-9 活性

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之影響...102 圖17. 活化靑蛋殼萃取物對 huh 7 細胞粒線體功能之影響 ...103

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附圖次

附圖1. 家禽產蛋期間殼腺黏膜的上皮變化與蛋殼色素之沉積圖 ... 17

附圖2. 家禽蛋殼主要結構截面圖 ... 17

附圖3. 靑殼與白殼之電子顯微鏡掃描圖 ... 23

附圖4. 非結合性膽紅素與膽綠素的二度與三度結構 ... 29

附圖5. 膽汁色素於體內的代謝步驟 ... 30

附圖6. 血基質體內轉換為膽綠素、非結合性膽紅素、雙葡萄糖 糖醛膽紅素之代謝路徑... 31

附圖7. 膽汁色素氧化還原循環 ... 34

附圖8. 膽汁色素與α-生育醇協同作用以預防細胞膜氧化傷害。.... 35

附圖9. 發炎引發慢性疾病的可能路徑 ... 41

附圖10. 膽綠素抑制過度發炎的反應路徑 ... 42

附圖11. 本論文之實驗架構 ... 45

附圖12. 萃取流程之不同階段產物 ... 46

附圖13. MTT方法偵測細胞存活率原理圖述... 56

附圖14. Annexin V 測定法圖述... 57

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表次

表1 蛋殼抽提液清除 DPPH 之能力 ...104 表2 蛋殼抽提液清除超氧化陰離子物之能力 ...104 表3 蛋殼抽提液抑制脂質過氧化物之能力 ...104 表4 活化靑蛋殼萃取物不同濃度與時間處理對 huh 7 存活率之影響

...105 表5 活化白蛋殼萃取物不同濃度與時間處理對 huh 7 存活率之影響

...105 表6 活化青蛋殼萃取物處理對不同細胞株存活率之影響 ...106 表7 活化靑蛋殼萃取物處理對肝臟腫瘤細胞 huh 7 自體凋亡率的影響

...106 表8 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞中 Casepase-3 活化表 現之影響...107 表9 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞中 Casepase-9 活性之

影響...107

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壹、前言

在台灣與許多國家的禽蛋市場中,青色或棕色的有色蛋較白色殼 蛋具有更佳的售價與競爭優勢,並且青殼鴨蛋較白殼鴨蛋具有更佳的 蛋殼厚度與強度 (王等,1997),可降低鴨蛋搬運時的破損率而提高經 濟價值,也因此青殼鴨蛋的生產受到業界的重視。台灣的鴨蛋產品因 為受到消費習慣的影響,常以皮蛋或鹹蛋的加工方式販售,並產生大 量蛋殼副產物,由於多含鹽份與鹼類,而且產量不穩定,故難以轉作 他用,處理廢棄蛋殼會增加成本開支,故開發鴨蛋蛋殼的再利用方法 為業者所需求的。而本研究期望能利用宜蘭養鴨中心培育出的青殼鴨 蛋之蛋殼,開發出保健產品,以有效利用蛋殼廢棄物,發揚宜蘭養鴨 產業之特色。

青殼鴨蛋為一般民間用於治療牙疼、生瘡與無名腫瘤的重要藥 引,雖然此偏方流傳已久,但終究缺乏科學佐證。已知青蛋殼中含有 膽綠素 (biliverdin) 成分 (Kennedy and Vevers, 1973; Soler et al., 2005;

Zhao et al., 2006),而膽綠素被証實具有抗氧化 (Stock, 2004; Sedlak et al., 2004)、抗突變 (Bulmer et al., 2007)、調節免疫功能 (Sass et al., 2004)、抗病毒(Yamashita et al., 2004) 等生理功能。此外,蛋殼成分 中亦含有其他有效物質,包含有玻尿酸 (Nakano et al., 2001)、抗菌胜

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肽 (Wellman-Labadie et al., 2008a)、碳酸鈣 (Rovensky et al., 2003) 等,但目前畜產業界多半將雞蛋殼粉碎以做成堆肥使用,而鴨蛋殼則 多以焚化處理,兩者皆尚未被開發成保健相關的高經濟價值產品。

然而,鴨青蛋殼中的效成分與蛋殼緊密結合,人體無法消化且吸 收利用,故需要強酸等溶劑進行分解與萃取。截至目前為止,雖有報 告曾利用鹽酸、甲醇、乙腈等溶劑去萃取出蛋殼中的膽綠素 (Soler et al., 2005; Wang et al., 2007; Zhao et al., 2006),但萃取液的酸度極高,

而且使用具有高毒性的乙腈 (為氰化物衍生物),難以被業界採用。若 要研發蛋殼中的有效成分,首先需要解決以往萃取方式的缺點。

本研究期望能發展出一套簡易、安全且低成本的萃取方式,能將 青蛋殼有效成分予以分離,並證明其抗氧化、抗腫瘤等有效活性,試 驗結果將有助於解決畜產加工業的蛋殼廢棄物問題,並且能提高蛋殼 副產物的經濟價值。

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貳、文獻檢討

一、蛋殼生產與再利用

(一)、 台灣的養鴨產業與鴨青殼蛋的生產

台灣養鴨產業發達,主要區分為蛋鴨與肉鴨兩部分,依照2006 年農業統計年報之資料顯示,蛋鴨之在養隻數為251萬餘隻,年產4 億6千萬餘枚蛋,而因為台灣消費者購買習慣之緣故,有超過95%的 鴨蛋是經過加工後販售的,是以皮蛋與鹹蛋為主的加工產品。

菜鴨為台灣主要的蛋鴨生產品種,原產於中國大陸華南地區。台 灣主要的菜鴨品系分為白色菜鴨與褐色菜鴨,而白色菜鴨體型略重於 褐色菜鴨,但產蛋率略低於褐色菜鴨。然而,民間於食肉上對白色菜 鴨有所偏好,據稱具有滋補功能,因而別稱「香鴨」;此外,白色菜 鴨亦做為育種白色改鴨之親代使用。在台灣地區的最主要的食用鴨蛋 來源是褐色菜鴨,其體型較小,不同於白色菜鴨的全身純白,褐色公 菜鴨是局部呈現灰、綠、褐色,而主翼羽則為藍綠色;褐色母菜鴨則 呈現全身黃褐色。褐色菜鴨產蛋性能極佳,無論是產蛋率、蛋重或蛋 殼強度等性狀均為優異,是加工鴨蛋的重要來源 (黃,2001)。

褐色菜鴨因遺傳組成的不同,會生產白色或藍綠色蛋殼之鴨蛋,

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而本省褐色菜鴨群中以產出青殼蛋之比例較高 (約佔65%),經過農委 會畜試所宜蘭分所將生產青殼蛋的菜鴨進行育種選拔,其生產青殼蛋 比例則更高。這些青殼鴨蛋會增加消費者的喜好而影響售價,並且降 低運輸時的破損率與加工時的製成率,因而受到畜產加工業界的重 視。

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(二)、 蛋殼之形成

禽蛋的生產關聯到一串複雜的過程 (附圖 1),禽類先將卵排至輸 卵管的漏斗部 (infundibulum),短暫時間通過後,卵會滯留於輸卵管 壺部 (magnum) 約2- 3個小時,在此期間壺部分泌大量白蛋白包覆於 外,形成禽蛋的蛋白部,卵細胞隨後運送至輸卵管峽部 (isthmus)。

在峽部至子宮之間,具有大量顆粒細胞,會分泌多種複合蛋白質形成 蛋殼膜,約需花費1小時 (Arias et al., 1991)。繼之,卵細胞被運送到 子宮部,其子宮壁富含殼腺,殼腺會分泌大量的碳酸鈣沉澱於蛋殼膜 上形成蛋殼,此步驟需花費17-22個小時,最終完整的禽蛋將於通過 生殖道與洩殖腔後生產 (Dieckert et al., 1989)。

在如此漫長的生產與孵化過程中,蛋殼肩負保護胚胎之責,使其 在發育期間免受外來的感染而造成死亡,因此蛋殼具有堅固、抗菌與 提供胚胎生長所需特殊養分等功能。蛋殼的組成是多層的孔狀結構,

其各層分佈方式如附圖 2 所示 (Lang and Wells, 1987),由內而外分 為6層。最內層為蛋殼膜,蛋殼膜又分為內外兩層,由膠原蛋白、角 質蛋白與纖維蛋白等多種蛋白質交互連結成為緻密的網狀結構,具有 防止外來物質入侵的功能 (Wang et al., 2002a; Wang et al., 2002b);蛋 殼膜上鑲嵌著圓錐形的碳酸鈣結晶,這些錐體稱之為乳頭層

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(mammillary layer),而在乳頭層上方緊密的連結柵狀層 (pallisade layer),柵狀層以平行的方式由乳頭層延伸而出,最後終止於表面結 晶層 (surface crystal layer),形成堅硬的蛋殼主體;而蛋殼的為最外 層為角皮層,角皮層富含纖維蛋白、礦物質與蛋殼色素 (Nys et al., 1991) 等,因所含的蛋白質可填補於蛋殼表面的粗糙孔洞,具有防止 微生物入侵與蛋殼著色的功能。

承如上述,已知在禽蛋的生產與發育過程中,蛋殼扮演著重要的 角色,然而除了蛋殼的厚度與硬度之外,蛋殼顏色也具有育種遺傳與 經濟上的意義,並且台灣的菜鴨生產靑殼蛋的比例很高,因而文獻檢 討中將對蛋殼色澤的產生與影響進行更深入的探討。

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附圖1. 家禽產蛋期間殼腺黏膜的上皮變化與蛋殼色素之沉積圖。

(modified from Lang and Wells, 1987)

附圖2. 家禽蛋殼主要結構截面圖。

含高碘酸顆粒 含紫質顆粒

含紫質顆粒 含高碘酸顆粒

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(三)、 蛋殼色素之形成

受到遺傳、環境、飼糧、年齡與疾病等諸多因素的影響,禽蛋呈 出現多種不同大小、形狀與色澤,常見的禽蛋色澤有:雞白殼蛋、棕 殼蛋與青殼蛋,及鴨的白殼蛋與青殼蛋。

對於家禽有色殼蛋的育種遺傳研究,以雞較為完整,已知道雞的 青殼蛋,是由卵青素 (oocyan, O*) 的顯性基因調控,此基因位於第 一對體染色體的短臂上,與雞冠 (pea comb, P*) 及延遲換羽基因 (tardy feathering, T*) 相互聯鎖,再由兩個以上的微效基因調控其色澤 濃度的深淺 (Bitgood et al., 2000)。而劉等人 (1998) 研究台灣褐色菜 鴨青殼蛋的發生,發現是經由一個具有顯性作用的主效基因所調控,

以及一對以上的微效基因進行蛋殼顏色濃度的修飾,此結果與雞隻青 殼蛋產生的結果相符,至於鴨的主效基因是否與雞的 O* 基因位於 相同位置或相同序列,目前仍屬未知。

而蛋殼色素形成的原因,目前仍無定論。有諸多的學說被提出:

早期認為有色殼蛋的產生,是野外家禽用於隱匿禽蛋避免受到其他動 物的攻擊。而在野外觀察的研究中也發現,非隱匿性的燕雀類鳥巢中 很少有相同色澤與花紋的蛋殼出現在不同鳥巢中,學者推論這可能與 家禽的寄養習性有關,使鳥類發展出自己的著色系統,以減少自己的

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鳥巢被其他鳥類進行寄養 (Stokke et al., 1999)。此外也有學者認為蛋 殼色澤是非隱匿家禽用於調節蛋內溫度的方式 (Lack, 1958)。而近來 則有研究指出:青殼蛋的產生,可能是一種雌性用於吸引雄性交配的 雌性訊號,如同雄禽以較亮麗的羽色或是嘹喨的鳴叫吸引雌禽一般,

雌鳥藉由生產較綠的蛋殼來表示健康狀況與抗氧化能力較佳,藉此吸 引雄禽進行交配,而此推論也同時支持蛋殼的顏色在遺傳學上具有母 方效應 (Soler et al., 2005)。但無論何種說法,目前仍沒有獲得全面的 認同(Westmoreland et al., 2007)。

至於造成青殼蛋呈現特殊顏色的物質為何?目前研究已有初步 暸解。早在1921年世界家禽會議中,學者 Carrera 發表了一種會生產 有色蛋的 Araucano母雞,這種母雞會生產藍色、綠色、灰綠色、棕 色帶有綠色斑點的雞蛋,而這些色素的命名:棕色部分命名為 oorhodeine;綠色色素命名為卵青素 (oocyan),而後發現這些色素皆 為紫質 (porphyrin) 類分子,綠殼蛋的主要色素成分為膽綠素

(biliverdin)、鋅螯合膽綠素 (zinc chelate biliverdin) 與原紫質

(protoporphyrin);棕殼蛋則主要含有原紫質 (protoporphyrin),少部分 的尿紫質 (uroporphyrin) 與糞紫質 (coproporphyrin) (Kennedy and Vevers, 1973; 1976),已知蛋殼色素多數沉積於蛋殼的角皮層 (Zhao et

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指出殼腺上具有多種活化紫質形成的酵素,可以催化紫質類分子的生 物合成 (Schwartz et al., 1980)。蛋殼色素的沉積步驟如附圖 1,學者 發現在蛋殼生成期間,殼腺上皮的頂細胞 (apical) 會產生許多帶有紫 質的小顆粒,這些顆粒會連同殼腺基底細胞所分泌的高碘酸大顆粒,

共同堆積到蛋殼角皮層中,兩者共同完成蛋殼的著色作用 (Lang and Wells, 1987)。

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(四)、 蛋殼顏色對經濟性狀之影響

動物產品的色澤會影響消費者的購買意願,在消費者對禽蛋選擇 喜好中,蛋殼的色澤是一個重要的指標,而各地區對於蛋殼顏色的喜 好有所不同,諸如在英國等歐洲眾多國家中,棕殼蛋具有較佳的市場 優勢,然而在北美與澳洲地區則以白殼蛋的消費為主。在台灣地區偏 好有色殼蛋,在傳統市場中棕殼雞蛋的平均每台斤售價較白殼雞蛋多 出一至兩元,而青殼鴨蛋與其相關產品也較白殼鴨蛋有較佳的售價,

甚而經由特殊通路販售的青殼雞蛋與彩色雞蛋,因為訴求有機養生與 保健功效,其售價可較一般白殼雞蛋多出五至十倍。

研究指出:蛋殼顏色對其內容物之組成與理化特性並無影響,但 可能對其蛋殼的組成有所影響 (Zhang et al., 2005),因而許多家禽飼 養業者認為有色殼蛋有較佳的蛋殼品質。而行政院農委會畜產試驗所 宜蘭分所致力於研究青殼鴨蛋多年,發現蛋殼顏色與蛋殼強度或蛋殼 厚度之間皆呈現顯著正相關 (胡等,2002),並且蛋殼強度會隨著育種 選拔代數增加而有漸增的趨勢 (劉等,2001)。在電子顯微鏡的觀察下 發現,青蛋殼的角皮層結構較為細緻緊密,其間連結的縫隙也較細小 (附圖 3A);而蛋殼膜佔全橫切面的比例亦較高 (附圖 3 B);青蛋殼 的蛋殼膜較為細緻緊密,而白蛋殼的蛋殼膜結構則獨立而鬆散 (附圖

(26)

3 C)。這些顯微結構上的差異,推測是造成青殼蛋具有較佳蛋殼品質 的原因 (王等,1997)。因為青殼鴨蛋具有較佳的蛋殼品質,可部分減 少搬運途中的破損率,並且較佳的蛋殼品質可提高蛋加工產品的製成 率,因而青殼蛋逐漸受到國內家禽產業的重視。由於在國內流傳有青 殼鴨蛋可作為治療生瘡、流鼻血、牙疼、挫瘡、氣血不足、陰虛腎燥、

腫脹與無名腫瘤的中藥藥引,因而在國內的市場調查顯示,有將近一 半 (49.2%) 的民眾認為青殼鴨蛋具有療效,也因此青殼鴨蛋較受到 消費者的喜好,值得國人對青殼鴨蛋進行相關等研究 (林等,2006)。

(27)

附圖3. 青殼與白殼之電子顯微鏡掃描圖。(A)蛋殼表面顯微構造、(B) 蛋殼橫切面顯微構造、(C)蛋殼膜顯微構造。 (王等,1997)

C

(28)

(五)、 蛋殼成分的再利用

鴨鹹蛋黃、液蛋、蛋粉等加工蛋品生產過程中,會產生大量的蛋 殼廢棄物,是蛋品加工過程中最主要的副產物,這些廢棄蛋殼的處 理,可能造成成本的增加與環境的汙染。以全美國的蛋品工廠而言,

平均每年產生 1,000 至 3,000 公噸的廢棄蛋殼,至於這些廢棄蛋殼 的主要處理方法如下:約有 45 % 做為堆肥與飼料中鈣添加劑的使 用,而更有 26.3% 是將之棄置或焚化。計算每廠每年處理廢棄蛋殼 所需的成本,有高達 58% 的加工廠每年必須花費超過 25,000 美元 的金額來進行 (黃與林,1997)。而在國內的蛋殼利用方式,雞蛋殼常 於粉碎後製成動物飼料與植物肥料添加之用,然而加工過後的鴨蛋殼 因具有鹽份與鹼類且產量不穩定,如欲粉碎成為飼料或肥料添加物,

在處理成本上並不划算,故多以回收焚燒方式進行處理。

事實上,蛋殼的再利用在近年來逐漸受到重視。因為蛋殼中含有 大量的碳酸鈣與其他的微量元素,在動物實驗中証實:餵飼蛋殼粉可 增加骨骼密度、促進軟骨生成,比一般肉骨粉 (鈣磷比約為 2:1) (朱,1997),更適合做為鈣質添加劑,因為蛋殼中含磷量非常低 (主 成分約有 98% 的碳酸鈣與 0.7% 磷酸鈣) (王,2007),故不會因為含 磷量過高而抑制鈣的吸收;此外,因為蛋殼的特殊組成方式,使蛋殼

(29)

粉較純化的碳酸鈣具有更高的生物利用率,因此推測蛋殼粉可以開發 成為具有預防與治療骨質疏鬆症 (osteoporosis) 的鈣質補充劑

(Rovensky et al., 2003; Schaafsma et al., 2002)。而亦有研究證實:蛋殼 與蛋殼膜中含有玻尿酸 (hyaluronic acid) 與聚葡萄糖胺

(glycosaminoglycan, GAG) 成分 (Nakano et al., 2001, 2002),已知 GAG 具有保護軟骨 (Fernandez Lopez and Ruano-Ravina, 2006)、對抗 粥狀動脈硬化 (Belizna et al., 2007) 等特性,因此利用蛋殼中 GAG 成分,亦可以發展出保護軟骨與關節的產品,將有助於提高蛋殼的經 濟價值。

再者,有學者從事蛋殼中抗菌蛋白的研究,由於微生物對抗生素 的抗藥性增加,因而取代抗生素的抗菌物質研究逐漸獲得重視。已知 蛋殼是防止蛋中水分喪失與微生物侵入的主要屏障 (Mine et al., 2003),對金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 等多種細菌皆具有 抑制能力;目前已由蛋殼中萃取出:卵蛋白素(ovalbumin) (Hincke, 1995)、卵運體鐵蛋白 (ovotransferrin) (Gautron et al., 2001)、C型溶酶 體 (C-type lysozyme)、ovocalyxin-32 及其他類 ovocalyxin-32 蛋白質 (Wellman-Labadie et al., 2008a, b) 等抗菌蛋白成分,但目前仍處於實 驗室階段,尚未被業界所應用。!

(30)

已知蛋殼中含有膽綠素成份,而純膽綠素化合物具有多種生理功 能。先前的報告指出有關萃取青蛋殼中膽綠素的方式,皆有酸性過高 或萃取溶劑含劇毒的問題存在,故業界尚無法有效利用青蛋殼中膽綠 素成分。故本研究期望發展出安全且簡易之萃取方式,將青蛋殼中所 含的膽綠素或其他有效成分進行萃取與開發,並證明其機能活性,將 有助於解決畜產加工業的蛋殼廢棄物問題,並且提高蛋殼副產物的經 濟價值。

(31)

二、膽綠素

已知膽綠素是造成青殼蛋與白殼蛋的色澤差異之主要成分,而膽 綠素具有許多生理功能,也由於本論文期望能萃取出靑蛋殼中的膽綠 素及其他機能性成分,以供後續應用於人類保健產品或藥物開發,因 此將對膽綠素在人體中的生成代謝與生理功能詳加闡述。

(一)、 膽綠素的生理代謝

膽綠素與膽紅素 (bilirubin) 為膽汁色素 (bile pigment) 家族中 最主要的兩種分子,兩者皆是具有4個吡咯環的紫質 (porphyrin) 家族 類物質 (附圖4) ,紫質家族的環狀結構容易與二價金屬離子結合,且 會隨著中間嵌合的分子不同或是結構的改變而吸收不同波長的光 波,因而呈現多種色澤。

成人每天代謝約 300 mg 的膽汁色素,其代謝途徑如附圖5、附 圖6。體內膽汁色素主要來自於血基質 (heme) 的分解,當老邁的紅 血球與其他含有血基質的酵素等,經由巨噬細胞吞噬分解後會釋放出 血基質,這些血基質將會被運送到網狀內皮系統,並在血基質氧化酶 (heme oxygenase, HO) 的催化之作用下,將血基質分解為藍綠色的膽 綠素,並釋放出二價鐵與一氧化碳。膽綠素在哺乳類體內會迅速的被

(32)

膽綠素還原酶 (biliverdin reductase) 還原成為橙黃色的膽紅素,此時 的膽紅素為脂溶性,又稱為非結合型膽紅素(unconjugated bilirubin),

其會在血液中與血清白蛋白形成非專一性的結合 (Brodersen, 1979),藉由循環系統運送至肝臟細胞,並藉由麩胺基硫轉移酶 (glutathione-S-transferase) 將其運送至肝臟細胞的平滑內質網中,經 UDP-葡萄糖醛酸轉移酶 (UDP-glucuronosyl transfersae) 作用下,加上 兩個親水性的醛酸基團,使其成為親水性的雙醛酸膽紅素 (bilirubin diglucuronid) (Kamisako et al., 2000)。親水性的雙醛酸膽紅素將隨著膽 汁經由膽管分泌至十二指腸,除了少部分的膽紅素會被小腸再吸收之 外,約有 90% 的膽汁色素會被腸內細菌轉變成為糞色素

(stercobilins) 與尿色素 (urobilins),使成為糞便與尿液的特殊顏色 (Moscowitz et al., 1971)。

(33)

附圖4. 非結合性膽紅素(A、B)與膽綠素(C、D)的二度與三度結構。

(Bulmer et al., 2007)

A

B D

C

(34)

附圖5. 膽汁色素於體內的代謝步驟。

(35)

附圖6. 血基質體內轉換為膽綠素、非結合性膽紅素、雙葡萄糖醛酸膽紅素等之代謝路徑。 (Bulmer et al., 2008)

(36)

(二)、 膽綠素的生理活性

膽綠素在體內會快速的被轉換成為膽紅素,而隨即排出體外,所 以在1980 年代之前,這些膽汁色素被視為是無用且具有毒性的血基 質代謝中間產物。然而,膽綠素的代謝速率限制酵素:血基質氧化酶,

已被證實為緊迫誘導酵素,當體內遭受強氧化物、重金屬或 UV 照射 等所造成的緊迫時,皆會誘導血基質氧化酶-1 (HO-1) 的大量表現 (Alam, 2002),以降低氧化、發炎等反應,因此血基質氧化酶被視為 是維持細胞體內平衡的關鍵酵素 (Canzi et al., 2006)。此外,膽綠素 的還原衍生物膽紅素也被証明是一個強大的抗氧化物質,可有效的預 防細胞中DNA、脂質、蛋白質與維生素的氧化作用 (Stocker et al., 1987; Stocker et al., 1990; Stocker and Peterhans, 1989b),由於膽綠素相 關的酵素與還原衍生物皆具有強大的生理功能,因此許多學者對膽綠 素進行生理功能之研究,而目前已經證實膽綠素具有多重的生理功 能,將敘述如下:

(1) 膽綠素具有抗氧化能力

雖然自由基在體內扮演著重要的生理角色,包括免疫反應的進 行、細胞訊號的傳遞、細胞增生以及DNA 的摺疊等;然而,過多的 自由基將會造成DNA、脂質、蛋白質的破壞,甚而導致老化、心血

(37)

管疾病、腫瘤增生、慢性發炎與癌症等退化性疾病的產生 (Halliwell, 1999)。

膽綠素已被證實具有體外抗氧化能力,包括清除 peroxyl radical (ROO‧)、hydroxyl radical (‧HO)、nitric oxide (NO) 等多種活性氧 (reaction oxygen species, ROS) 與活性氮 (reaction nitrogen species, RNS),並且具有還原氧化維生素的能力 (Kaur et al., 2003; Stocker, 2004)。

膽綠素的體外抗氧化能力與其結構有直接關係,因為膽綠素吡咯 環的碳具有多個穩定的共振結構 (resonance-stabilized),因此可以結 合不成對電子,穩定帶有這些不成對電子的自由基,以減少自由基對 細胞的傷害 (Aberg et al., 1992)。

在動物體內的研究中亦已證實,在氧化壓力下局部組織會出現膽 綠素濃度上升的現象,高濃度的膽綠素會還原成膽紅素,除了膽紅素 結構可以結合不成對電子外,更可以將自體氧化為膽綠素,以還原親 脂性的活性氧 (附圖 7),藉此清除掉大量的過氧化脂質自由基,同時 也避免因高濃度膽紅素所造成的神經毒性,而這種體內膽汁色素轉換 的循環機制,可大幅提高膽汁色素對氧化自由基的清除能力 (Sedlak and Snyder, 2004)。

(38)

附圖7. 膽汁色素氧化還原循環。

(Sedlak and Snyder, 2004)

此外,膽綠素亦能支持維生素與輔酶的抗氧化系統,將已作用完 畢而具不成對電子的維生素,例如:氧化的α-生育醇 (α-tocopheroxyl) 與氧化維生素C 等,膽綠素會結合其不成對電子,使維生素或輔酶可 重複再利用 (附圖 8) (Stocker, 2004)。藉此方式,使膽綠素與其他膽 汁色素可以擁有更廣範圍的體內抗氧化能力,以防止細胞中DNA、

蛋白質與細胞膜脂質受到自由基傷害。因此膽綠素無論是在體內、體 外系統中,都是重要的抗氧化物質之ㄧ。

(39)

附圖8. 膽汁色素與 α-生育醇協同作用以預防細胞膜受到氧化傷害。

(Stocker, 2004)

(2.) 膽綠素具抗致突變物 (anti-mutagen) 能力

有許多存在於自然環境的化合物或是人造物質,在長時間或過 度暴露的情況下,會誘導動物體細胞產生突變,這樣的物質被稱之為 致突變物 (mutagen) (Kelloff et al., 1994a)。雖然在體內具有自我修復 或是將突變細胞進行自體凋亡進行的機制,但過度的突變將導致許多 臨床疾病的產生,同時也發現致突變物與癌症生成 (carcinogenesis) 有直接相關 (De Flora et al., 1996)。

因此降低致突變物質與致癌物質 (carcinogen) 所造成的傷害,成

(40)

為預防保健醫學的研究重點。De Flora (1998) 曾提出三種降低致突變 物傷害的模式:1. 避免與致突變物的接觸;2. 強化生理防禦系統;

3. 攝食化學預防物質 (chemoprevention)。化學預防物質即為抗突變 保護因子,這些保護因子可經由結構性或生理代謝性的方式去降低致 突變物所造成的傷害,以達到抗突變的效果。近年來化學預防物質的 開發與其安全性、機能性的評估越來越熱門,也逐漸受到臨床醫學與 保健食品業界的重視 (Kelloff et al., 1994b)。

已有研究報告指出:膽汁色素所屬的紫質家族分子,包含血基 質、膽綠素、膽紅素與葉綠素等,皆具有降低致突變物的能力,但隨 著致突變物的不同與使用的評估模式不同,使得這些紫質類物質的抗 突變能力有所變異性 (Tang and Edenharder, 1997)。

評估化學預防物質抗突變能力的方法眾多,其中以 Ames 所發 表的 S. typhimurium 回復突變分析法最常被使用 (Ames et al., 1975;

Mortelmans and Zeiger, 2000)。已有多篇報告利用此分析法,證實膽 綠素具有體外抗突變的能力,推測為膽綠素的吡咯環結構與致突變物 的苯環產生鍵結所致。此報告中指出:膽綠素在抑制突變物的能力上 並不及膽紅素有效,推測是膽綠素三度結構較為平面所致 (附圖 4 D)。但又特別指出:在體內酵素系統作用下,即在菌株試驗進行中加

(41)

入含有活性肝臟酵素的大鼠肝臟組織液,將使膽綠素抑制突變能力則 大幅提升,因此推測膽綠素於體內酵素系統中,更可以有效地抑制致 突變物 (Bulmer et al., 2008)。再者,於哺乳類細胞試驗中亦證實:膽 綠素可有效抑制含苯致突變物 Benzo[α]pyrene (B[α]P) 與

6-Sulfooxymethylbenzo[a]pyrene (SMBP) 所造成的成鼠肺臟纖維細胞 V79 突變,並加速致突變物的代謝作用 (Cho et al., 2000; Katoh et al., 1983)。

總結上述,膽綠素具有抗突變的能力,尤其在體內酵素系統之下 更具效力,因此學者推測膽綠素或許能發展成為抗突變或抗致癌物的 化學預防物質 (Bulmer et al., 2008)。基於上述論點,本論文將針對青 蛋殼中所含膽綠素的萃取液進行抗氧化與抗腫瘤能力之探討。

(42)

(3.) 膽綠素具抗發炎能力

發炎反應是體內的複雜防禦機制,當身體受到感染、化學刺激、

自體免疫損傷,或接觸無法排出的外源顆粒時,體內即會自行啟動發 炎機制以應對,然而過度活化或長時間的發炎反應將會造成許多臨床 疾病,甚至癌症的產生,例如幽門桿菌 (helicobacter pylori) 持續刺 激胃部發炎,易導致胃部產生潰瘍與癌症 (Farinati et al., 2003);而長 時間的紫外線照射,會使皮膚產生慢性或急性發炎,導致皮膚癌的產 生 (Sluyter and Halliday, 2001)。因此抗發炎物質的開發,在近年來亦 是熱門的研究主題。

當傷害發生時會啟動一連串的發炎反應 (附圖 9) (Huang et al., 2004),受傷組織會促進白血球、巨噬細胞等免疫性細胞的趨化作用,

使趨化的免疫細胞隨即釋放出促發炎細胞激素,例如:腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor, TNF-α)、干擾素 (Interferons, IFN-γ)、介白素 1 (interlukin-1, IL-1) 與介白素 6 (IL-6) 等,這些細胞激素會向上調節核 轉錄因子 (nuclear factor kappa B, NF-κB),而活化態的 NF-κB 會導致 發炎反應所需的蛋白質大量表現,包括促發炎細胞激素、細胞連結分 子 (cellular adhesion molecules, CAM)、花生四烯酸 (arachidonic acid) 代謝之酵素及催化ROS 產生之酵素等,並加速進行後續的免疫細胞

(43)

連結與呼吸爆炸 (respiration burst) 等步驟 (Bowie and O'Neill, 2000),因此 NF-κB 被視為是發炎過程的起始因子與增強物質,在發 炎反應中扮演著關鍵性的角色 (Pahl, 1999)。

已知 HO-1 蛋白質會在急性發炎反應中被大量表現,而 HO-1 的活化會降低 MAPK (mitogen-activated protein kinases) 與氧化酵素 的生成,並減少促發炎細胞激素分泌,進而降低發炎反應的強度與持 續時間 (Alam, 2002; Alcaraz et al., 2003);此外 HO-1 的催化產物:

膽綠素,也在近年的抗發炎研究中受到重視,在細胞培養實驗中添加 膽綠素,可以抑制 NF-κB 的活化 (Gibbs and Maines, 2007)。而以脂 多醣 (lipopolysaccharide, LPS) 所誘導的小鼠肝臟急性發炎動物模式 中,施打膽綠素,可以明顯降低發炎反應與肝臟細胞的壞死現象 (Sass et al., 2004)。近年來,有許多研究使用膽綠素注射,以降低因器官缺

血/再灌流後所產生的大量自由基傷害,可避免因劇烈發炎反應所造 成的器官移植失敗或死亡,例如:在大鼠肝臟異體移植之前使用,可 減低移植後的發炎反應 (Fondevila et al., 2004);在腎臟移植實驗上亦 是 (Li Volti et al., 2006);在小鼠進行心臟移植時,進行多次膽綠素靜 脈注射,膽綠素會經由抑制 NF-κB 與 減少 T 細胞活化核因子 (nuclear factor of activated T cell, NFAT),進而抑制促發炎激素與 T 細 胞免疫系統的活化,以達到降低發炎反應與細胞保護的效果

(44)

(Yamashita et al., 2004)。

由上述文獻得知,膽綠素為一有效抑制過度發炎反應的化合物,

其可具有抑制NF-κB、促發炎細胞激素、氧化酵素,與清除 ROS 等 能力,同時能中斷多個發炎反應的活化路徑 (附圖 10),可發展為體 內抗發炎與細胞保護的保健醫藥成分。

(45)

附圖9. 發炎引發慢性疾病的可能路徑。

(Huang et al., 2004)

(46)

附圖10. 膽綠素抑制過度發炎的反應路徑。 表示為促進路徑、 表示為抑制路徑。

(47)

4.膽綠素的其他生理功能

膽綠素除了具有上述抗氧化、抗突變與抗發炎等功能之外,也有 學者針對膽綠素進行其他生理功能之研究,例如:抗補體 (Nakagami et al., 1993)、抗病毒 (McPhee et al., 1996; Mori et al., 1991) 與促進特

定肝臟上皮細胞之增生 (Lafarge-Frayssinet et al., 1981, 1983) 等,然 而這些功能的研究報告較少,且尚有爭議存在,不若前述功能研究的 清楚透徹。

(48)

參、材料與方法

一、實驗大綱

本試驗目標有二,首先由菜鴨青蛋殼中萃取出具有生理活性之膽 綠素;由先前報告得知:青蛋殼中含有膽綠素成分,此成分已被證實 具有抗氧化、抗突變與抗發炎的生理活性,極具開發為高價值保健產 品之潛力,故本試驗以萃取出青蛋殼中具有生理活性的膽綠素為首要 目標。再者,本試驗更欲就民間流傳之青蛋殼具抗腫瘤能力之偏方進 行科學研究,以期使青蛋殼萃取物具有更高的經濟價值。

本論文之實驗架構如附圖 11 所示。首先以商業膽綠素建立一簡 易的膽綠素檢測指標,作為蛋殼萃取效率的初步評估工具,再將試驗 用菜鴨蛋殼經洗淨、蛋殼與殼膜分離、乾燥與均質等前處理後,進行 各種不同條件的分離與抽提。並使用上述建立的檢測指標訂定蛋殼最 佳的萃取方式,隨後將蛋殼抽提液 (crude extract of eggshell) 以高壓 液相層析儀 (HPLC) 等方式分析,以驗證是否具有膽綠素成分。再 進一步分析蛋殼萃取物是否具有清除自由基能力。繼之,為驗證加工 的活化蛋殼萃取物 (active extract of eggshell) 是否具有抗腫瘤能 力,故將蛋殼萃取物與腫瘤細胞株進行共培養試驗,觀察腫瘤細胞株 之型態與存活率之變化。

(49)

附圖 11. 本論文之實驗架構

(50)

二、蛋殼有效成分分離與萃取

附圖 12. 萃取流程之不同階段產物。

(一)、 樣品挑選:

本實驗選用的青殼蛋,為行政院農委會畜產試驗所宜蘭分所培育 的褐色菜鴨L 106 品系所生產之青殼鴨蛋,其蛋殼 A value (紅色度) 小於 -7,並以北京鴨生產之白殼蛋作為對照,分別依照下列步驟進 行保健成分之萃取:

(二)、 蛋殼前處理:

將蛋殼表面以軟海綿洗淨,去除內容物後,以 0.1M EDTA-2Na (日 本試藥級) 浸泡蛋殼 40 分鐘,有利於蛋殼膜之分離,其後於 37°C 烘 箱乾燥 24 小時去除水分,將乾燥蛋殼以均質機粉碎,冷藏於 4°C 冰 箱備用。

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(三)、 蛋殼酸解:

本試驗初期以多種溶液進行蛋殼分解,並比較各種溶劑對蛋殼中 膽綠素萃取效率的影響。依照初步實驗結果,訂定後續抗氧化、抗腫 瘤等試驗條件,取出上清液,稱為「蛋殼酸解液」,用於進行後續的 液相抽提。

(四)、 蛋殼酸解液之液相抽提:

本步驟初期同樣採用多種有機溶劑進行有機萃取,並比較各溶劑 間萃取效率的不同。最後採用的方法為:將上述步驟 (三) 所取得之 酸解液測量OD375 nm,進行保健成分純化與濃縮。

(五)、 真空減壓濃縮:

收集上述步驟 (四) 之有機層液體,以真空減壓濃縮機進行濃 縮,條件設定為:加熱溫度30℃、冷凝溫度 4℃、轉速 200 rpm,並 乾燥至有機溶劑完全揮發為止。將乾燥樣品冰存於4°C 冰箱待後續分 析。

(52)

(六)、 樣品測試:

樣品依實驗目的不同,樣品以不同方式回溶。使用於HPLC 與抗 氧化分析部分,真空減壓濃縮的乾燥樣品,直接以溶劑回溶,稱之為

「蛋殼抽提液」。

而使用於測試抗腫瘤細胞能力之樣品,則於真空減壓濃縮後,進 行回溶稀釋。稀釋完畢後以0.22 μm PTFE 材質濾膜進行無菌過濾,

保存於 -80℃ 冰箱等待分析,此溶液稱之為「活化靑蛋殼萃取物」。

(53)

三、青蛋殼抽提液之保健成分分析

(一)、 蛋殼抽提液可見光吸光值分析

將青蛋殼與白蛋殼抽提液,以分光光度計 (ThermoSpectronic GENESYSTM 10 Series Spectrophotometers) 測量其可見光吸光值,並 以2 mM 商業膽綠素 (MP, 194886) 作為標準品,測量可見光波長 330 nm 至 690 nm;將此結果作為青蛋殼抽提效率之初步判斷標準。

(二)、 蛋殼抽提液之高壓液相層析儀分析

以HPLC 進行蛋殼抽提液之膽綠素成分分析,並以商業販售膽綠素作 為標準品,並將抽提液進行全波長吸光值之掃描。HPLC 設定條件如 下,選用管柱:Hamiltion PRP-1 Reversed 250*4.1mm 10 μ1 – poly (styrene – diviny) benzene;樣本注射量:200 μl;標準品為 2 mM 商業 膽綠素:檢測波長:371 nm;移動相:A. 20% 乙腈與 80% 0.1 M 醋 酸銨 (ammonium acetate);B. 乙腈。以上 HPLC 條件設定後,將流 速設定為 2 ml/min,先以 100%移動相 A 流洗 2 分鐘,隨後 16 分鐘 中漸次將流動相A 依比例置換為流動相 B,最末再以 100% 流動相 B 流洗兩分鐘,總歷時20 分鐘。

(54)

四、青蛋殼抽提液之抗氧化能力測定

抗氧化試驗使用之蛋殼抽提液製備方式如下:將60 g 粉碎蛋殼 粉,經120 ml 之 70% 醋酸浸泡 24 小時,取其上層酸解液 60 ml,

混入等體積 (60 ml) 的醋酸乙酯,並以同體積 (60 ml) 0.1N NaOH 沖 提4 次,得到 25 ml 有機層液體,將有機層液體以真空減壓濃縮方式 乾燥,隨後將乾燥蛋殼樣品以原有機層1/10 體積 (2.5 ml) 之醋酸乙 酯回溶,並用 99% 酒精進行 5 倍稀釋,總計得到 7.5 ml 蛋殼抽提液。

此時以白蛋殼抽提液為對照組,測得青蛋殼抽提液之 OD375 nm 為 3.65,經膽綠素標準曲線換算出其中含膽綠素濃度為 6.19 μM。本抽 提液將用於後續所有抗氧化能力測定試驗中。

(一)、 清除 DPPH (a,a-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 能力之測定

參考 (Lissi et al., 1999) 之報告,其原理為:當物質提供氫質子,

使DPPH 產生還原反應而中斷氧化鏈鎖反應,因此物質供氫能力成為 抗氧化能力之重要指標。DPPH 在 OD517nm 會有ㄧ強吸光值,但當 DPPH 接受到氫質子後產生還原反應,造成 OD517 nm降低,藉由顏色 變化可判定物質的抗氧化能力。

其反應式如下:

DPPH‧ + AH → DPPH-H + A‧

(55)

實驗方法為:將4 ml 經 100 倍稀釋的蛋殼抽提液,與 1 ml 新 鮮配置的 10 mM DPPH 乙醇溶液混合均勻,於室溫下靜置 30 分鐘 後,測定其OD517 nm。並將4 ml 的 1 U/ml α-生育醇,以同樣方式進行 試驗,作為正對照組。

結果表示方法為:DPPH 清除能力 % =﹝ 1-(樣品 OD517 nm

nm)/(空白組 OD517 nm)﹞× 100%

(二)、 清除超氧陰離子 (superoxide anion) 能力測定

參照 (McCord and Fridovich, 1969) 方法進行測定,本方法利用 鄰苯三酚 (pyrogallol) 與 diethylenetriaminopenta acetic acid

(DETAPAC),混合後會產生超氧陰離子的自體氧化反應,並呈現微吸 光波峰為325 nm 的黃色溶液。

實驗方法為:於試管中加入4.5 ml pH 8.5 之 50 mM Tris buffer (含 1 mM DETAPAC),取 0.01 ml 的蛋殼抽提液與 0.01 ml 45 mM 鄰 苯三酚均勻震盪後,立即讀取OD325 nm,並測定 30 秒後數值變化,將 對照管之自體氧化速率調整為0.07 A/min,再進行樣品與對照管自體 氧化速率之比較,計算其活性,此活性值與SOD 標準品校對後,稱 之為 SOD-like activity (U/ml)。

計算公式為:SOD-like activity (U/ml) = (0.07-樣品 30 秒內數值

(56)

(三)、 抗脂質氧化能力測定 ─ 硫鐵法 (Ferric thiocyanate)

本方法乃利用脂肪氧化反應所產生的氫過氧化物,會將二價鐵 (Fe2+) 氧化成為三價鐵 (Fe3+),而 Fe3+ 會與SCN- 產生紅色的硫氰酸 鐵錯合物 (Fe(SCN)63-),藉由 OD500 nm測定氫過氧化物的生成量,近 一步推測樣品對抗脂質氧化之能力。

其反應式如下: ROOH + Fe2+ → ROH + HO‧+ Fe3+

Fe3+ + 6NH4SCN→ Fe(SCN)63- + 6NH4+

實驗方式:取0.1ml 之蛋殼抽提液或 BHA (60 mM),加入 2.4 ml 之 0.2 M KH2PO4 與 2.5 ml 之 0.2 M 亞麻油酸乳化液 (含 0.48%

linoleic acid 與 0.48% Tween-20 之 0.2 M KH2PO4 溶液),震盪均勻,

置於37℃培養 48 小時。隨後,取出上述混合液 0.1 ml,依序加入 4.7 ml 的 75%酒精、0.1 ml 30% ammonium thiocyant 與 0.1 mL 的 0.02 M Iron (II) chloride tetrahydrate (溶於 3.5% HCl),經震盪後避光靜置 3 分鐘,再測定其OD500 nm

結果表示方式為:抑制過氧化率(inhibition of peroxidation, IP %)

= (1-樣品 OD500 nm/控制組 OD500 nm) × 100。當 IP %愈大,表示樣品 對抗脂質氧化能力越強。

(57)

五、活化蛋殼萃取物抗腫瘤能力之測定

抗腫瘤能力測定所使用之活化靑蛋殼萃取物製備方式如下:將 60 g 粉碎蛋殼,經 120 ml 之 70% 醋酸浸泡 24 小時,取其上層酸解 液 60 ml,混入等體積 (60 ml) 的醋酸乙酯,並以同體積 (60 ml) 0.1N NaOH 沖提 4 次,得到 25 ml 有機層液體,將有機層液體以真空減壓 濃縮方式的乾燥,隨後回溶,總計得到7.5 ml 活化蛋殼萃取液。此活 化蛋殼萃取物將用於後續所有抗腫瘤能力之測定試驗中。

(58)

(一)、 細胞培養

本 實 驗 所 使 用 之 癌 細 胞 株 皆 來 自 生 物 資 源 保 存 暨 研 究 中 心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC),包括人類肝癌細 胞株 HepG2 與 huh 7、人類肺癌細胞株 A549、人類乳癌細胞株 (MCF 7) 及人類幹細胞株 Human bone marrow (HBM01)(來自於中研院李鴻 博士分讓);此外,取自懷孕 13.5 天母鼠之胎鼠,以初代培養方式培 養纖維母細胞 (mouse embrynic fibroblasts, MEF)。上述細胞皆以含有 10% 胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 及 1 % 抗生素 (Hy Q Antibiotic/Anti-mycotic solution) 之 DMEM (Gibico, 298221) 培養液 (含 3.7 g/L NaHCO3,25 mM HEPES,1 mM Sodium pyruvate) 進行繼 代培養,經培養 3 日後,以 PBS 進行清洗後,再以 trypsin-EDTA 懸 浮黏貼於培養皿之細胞,之後使用含血清的 DMEM 中止作用,於常 溫、500 G 條件下離心 5 分鐘,將上清液移除後,再以 DMEM 血清 培養液取代,並計數細胞數以進行繼代培養。

(59)

(二)、 細胞染色與型態觀測

1. 細胞影像擷取

將選用細胞經計數後置於 6 孔細胞培養盤中,使細胞數為 2 × 105個/2 ml/well,經 16 小時後細胞穩定貼附後,再依照各試驗設計進 行處置,處理完畢之細胞,將原培養液去除後以 PBS 洗滌 3 次,將 細胞保存於PBS 中,以倒立光學顯微鏡 (Axio Cam MRC, Axiovision 15, Zeiss, Germany ) 與其電腦軟體系統進行影像擷取。

2. PI (propidium iodide)染色

PI 染劑具有特異性嵌入雙股 DNA 鹼基對之特性,故以此染劑進 行細胞核的染色,以分析試驗處理對細胞核型態的影響,然而 PI 為 水溶性分子,無法進入細胞核中,故在染色之前,必須以溶劑先進行 固定。本試驗利用甲醇作為細胞固定溶劑,其處理步驟如下:將蓋玻 片置入 6 孔細胞培養盤中,放入細胞培養 16 小時,使細胞附著於蓋 玻片上,隨後予以活化蛋殼萃取物處理,處理完畢後將玻片以細鑷取 出,並以PBS 清洗 3 次。而後將蓋玻片浸泡於含有 50% 甲醇的 PBS 溶液中,於室溫下培養 30 分鐘,再移至 100% 甲醇溶液,於 -20℃ 條 件下放置2 小時,甲醇固定完畢後以 PBS 清洗 3 次,隨之以濃度 10 μg/ml 的 PI 染劑於避光環境下進行 30 分鐘染色,並進行影像截取。

(60)

(三)、 細胞存活率測試

本實驗採用MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide) 染色方式計算細胞存活比率,黃色的 MTT 會經由活細胞中粒線體還原酶 (mitochondrial reductase) 還原為 紫黑色結晶,以OD570 nm計算細胞存活率。

附圖 13. MTT 方法偵測細胞存活率原理圖述。

將細胞置於96 孔培養盤中培養,調整細胞濃度為 5 × 103個細胞 /100 μl/well,以含 10% 血清 DMEM 培養液培養 16 小時後,加入以 含有不同濃度活化蛋殼萃取物之培養液進行共培養,並測試不同培養 時間的影響。完成後,以PBS 清洗 3 次,加入 100 μl 含 500 μg/ml MTT 的含10% 血清 DMEM 培養液,培養 2 小時,隨後去除廢液並加入 100 μL DMSO 震盪溶解結晶一小時,待結晶完全溶解後讀取 OD570 nm

計算公式為:細胞存活率 (Cell viability %) = (樣品 OD570 nm -空 白組OD570 nm)/(無處理組 OD570 nm-空白組OD570 nm) × 100%。

(61)

(四)、 細胞自體凋亡測試

1. Annexin V 染色分析

採用Annexin V–FITC 配合 PI 雙染進行細胞凋亡偵測,實驗原 理為:細胞膜之雙層脂質結構,內外膜組成略有不同,磷脂質絲氨酸 (phosphotidyl serine, PS) 原為內膜構造,但在細胞凋亡早期細胞膜會 發生磷脂質不對稱性破壞,導致PS 翻轉至膜外。而 Annexin V 是鈣 依賴性的磷脂結合蛋白,會與PS 進行結合,而成為偵測凋亡的指標 之ㄧ。

然而,當細胞呈現Annexin V 染色時,並非全部皆由凋亡所造 成,當細胞在壞死後期,會出現細胞膜破裂,Annexin V 亦可結合上 細胞內膜的PS,故會造成誤判。因此本實驗搭配常用於判定細胞死 活的PI 染劑,將 Annexin V 與 PI 同時進行雙染,以排除破裂細胞所 造成的誤判。

附圖 14. Annxin V 測定法圖述。 (擷取自 http://www.bd.com/)

(62)

實驗方法:使用Annexin & PI 商業套組 (ApoScreen Annexin V Apoptosis Kit – FITC, Beckman Coulter, 731718),依據其說明步驟進 行,將細胞以trypisn 懸浮後,以冰冷的 PBS 清洗 3 次,每管放入 2 × 105個細胞,以500 g、5 min、4℃條件離心,將細胞團塊以 100 μl 1 × Binding Buffer 沖散,並加入 1 μl Annexin V 與 4 μl PI 混勻後,

於冰上避光作用15 min,隨後加入 400 μl 1 × Binding Buffer 中止反 應,於30 分鐘內以流式細胞儀 (Quanta SC flow cytometer, Beckman Coulter, Miami, FL) 進行偵測,使用激發光為 488 nm。

(63)

2. Caspase-3 活性分析

Caspase (Cysteine proteases) 家族是細胞凋亡過程中的重要路徑 之ㄧ。而Caspase-3 為 Caspase 家族下游的活化物,活化時導致細胞 死亡與型態改變,故 Caspase-3 常被作為偵測細胞凋亡的指標之一。

本試驗使用商業套組PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit (BD Biosciences, 550914) 進行細胞中 Caspase-3 活性分析,檢測方式如 下:首先將待測細胞計數調整為1 × 106個/管後,以冰冷的 PBS 清 洗兩次,再將細胞移至0.5 ml 的 Cytofix/CytopermTM溶液中,於冰上 靜置20 分鐘,去除溶液後,再以 Perm/WashTM溶液清洗 2 次,隨後 以0.1 ml Perm/WashTM沖散細胞,並加入20 μl 抗體,於室溫下作用 30 分鐘後,以 BD Perm/WashTM將抗體移除,以流式細胞移偵測紅螢 光 (FL-3 濾鏡)。

(64)

3. Caspase-9 活性分析

活化 Caspase-3 的上游訊號,目前主要有兩條路徑,分別為 Caspase-8 與 Caspase-9,本試驗挑選 Caspase-9 進行上游訊息測試。

以Western blot 方式進行細胞中 Caspase-9 活性的分析,將細胞經由 各試驗設計之處理方式後收集,先以Protein Assay Kit (Bio-Red) 進行 蛋白質定量,將蛋白質量調整成為 25 μg / lane 後以 SDS-page 電泳 方式進行蛋白質分離,隨後將膠片上蛋白質以半乾式電泳法轉漬到硝 化纖維膜上,將此轉漬膜先以Blocking Buffer (PBS + 0.05%

Tween-20 + 5%脫脂乳) 於室溫下培養 2 小時,隨後去除 Blocking Buffer 並與兔抗人類 Caspase-9 單株抗體 (human specific caspase-9 antibody) 於 4 ℃下共培養 16 小時,以 PBS-T (PBS + 0.05% Tween-20) 洗滌3 次,再以 HRP-結合山羊抗兔 IgG 抗體 (HRP-conjugated polyclonal goat anti-rabbit IgG antibody) 共培養 2 小時,隨後以 PBS-T 洗滌3 次,加入 1 ml 反應基質作用一分鐘後,以 BioSpectrum AC Imaging system. (Ultra-Violet Products Ltd.; Cambridge, UK) 進行冷光 偵測。

(65)

4. 粒線體功能分析

粒線體為重要的胞器與細胞的存亡息息相關,當細胞進行凋亡時 粒線體的功能喪失,與Caspase-9 的活化有直接關係。當粒線體正常 維持呼吸鏈運作時,會將化學能貯存於粒線體內膜上,使粒線體產生 內負外正的電位差,也因此當粒線體失去功能時,電位差會消失。於 是利用粒線體電位差的原理,以脂溶性可穿透細胞膜的正電分子 rhodamine 123 進行染色,rhodamine 便會與粒線體內膜結合。

rhodamine 123 與細胞於室溫下培養 15 分鐘後,以流式細胞儀偵測紅 螢光 (FL-3 濾鏡)。

六、統計分析

本研究之統計方法主要採用SigmaStat 3.1 軟體,使用one-way ANOVA (analysis of variance) 及LSD (least significant difference) 分 析各組間的差異性。並以p < 0.05為達顯著差異水準,p < 0.001為達極 顯著差異水準。所有結果皆以平均加減標準偏差(mean ± S.D.)表示。

(66)

肆、結果

一、靑蛋殼膽綠素萃取與分析

(一)、 建立膽綠素測定指標

為評估各種變因對於蛋殼中膽綠素萃取效率的影響,本實驗首先 建立一簡易的膽綠素吸光值偵測法。將商業膽綠素、青蛋殼酸解液與 白蛋殼酸解液進行全波長吸光值掃描 (圖 1),結果顯示:商業膽綠素

於波長OD375 nm 處具有一吸光波峰,而青蛋殼酸解液亦是,蛋白蛋殼

酸解液則較不明顯,因此判定OD375 nm 最適合做為青蛋殼中膽綠素含 量之測定指標。

(二)、 建立最佳之青蛋殼酸解方法

由於青蛋殼中膽綠素與蛋殼礦物質緊密結合,為取得蛋殼中膽 綠素成分,因而必須將蛋殼中礦物質進行分解,本實驗嘗試以乙二胺 四乙酸 (EDTA) 進行蛋殼中鈣離子之螯合,並與硫酸、鹽酸、醋酸 等酸液進行蛋殼分解,測試OD375 nm 測定,初步結果以醋酸浸泡較 佳,因此以醋酸作為酸解溶液,進而試驗最佳作用濃度與作用時間,

結果以醋酸作用最佳酸解效率,其酸解溶液外觀,如圖 2 A 所示。

(67)

(三)、 建立最佳之青蛋殼酸解方法

當蛋殼酸解完畢後,蛋殼中膽綠素等物質會溶解於其中,但其濃 度較低且酸度極高,因此必須發展出適當的萃取方式,才可使用於後 續的有效活性之研究。含有綠色色素之物質會懸浮於上方有機層中 (圖 2 B)。

(68)

(四)、 靑蛋殼抽提液之 HPLC 圖譜分析

為進一步確認抽提液是否具有膽綠素成分,本實驗以HPLC 進行 蛋殼抽提液分析。首先以商業膽綠素測試條件,在極性與非極性液體 濃度改變之下,C-18 管柱所結合的膽綠素約於滯留時間 (retention time, RT) 4.64 分鐘流出,為波長 371 nm 可見光所偵測 (圖 3 A),進 一步將此波峰進行一次的可見光全波長掃描,分別於371 nm 與 635 nm 呈現吸光波峰 (圖 3 B),此標準品測試結果與先前分光光度計所 分析之吸光波長相似。

將青殼蛋抽提液以同樣條件進行HPLC 分析,可見於 RT 1.33nim 與4.61 nim 處具有兩個主要波峰 (圖 4 A),且 RT 4.61 nim 波峰佔有 面積比率很高,進一步將波峰以全波長掃描,可見此波峰在371 nm 與635 nm 下具有最強吸光值 (圖 4 B),顯示膽綠素為青蛋殼抽提液 中的主要成分。而在白殼蛋抽提液的分析圖譜中,則僅餘RT 1.33 min 處有一主要波峰 (圖 5 A),雖在 RT 4.64 min 處亦有細碎波峰,但經 全波長掃描後,證實並非為膽綠素成分 (圖 5 B)。因此判定白殼蛋抽 提液中並不含或僅含少量膽綠素成分。

(69)

二、抗氧化能力測定

(一)、 清除 DPPH 能力之測定

無論是在白蛋殼或是青蛋殼抽提液中,都不具有還原DPPH 的 能力,其清除DPPH 的效率與溶劑組之間並無差異,然而正對照組 α-生育醇 (Vit E),具有極顯著的清除 DPPH 能力 (p < 0.001),結果 得知蛋殼抽提液不具有供氫還原自由基之能力 (圖 6)。

(二)、 清除超氧陰離子能力之測定

本試驗結果証實:青蛋殼與白蛋殼抽提液之清除超氧化陰離子能 力明顯高於溶劑組 (p < 0.001)。但青蛋殼與白蛋殼抽提液兩者之間 並無差異,由此可推測青蛋殼抽提液的清除超氧陰離子能力,並與 蛋殼顏色差異無關,亦非由膽綠素所致 (圖 7)。

(三)、 清除脂質過氧化物能力之測定

過氧化脂質會導致體內的游離金屬氧化,進一步造成後續體內 氧化反應,由圖 8 可知青蛋殼抽提液會明顯的抑制脂質氧化所造成 的過氧化物產生 (p < 0.001) ,而白蛋殼抽提液則不具有清除脂質過 氧化物的能力。比較商業上常使用的人工合成防腐劑丁基羥基甲氧

(70)

苯 (butylated hydroxyanisole, BHA),靑蛋殼抽提液中約有 60 mM BHA 的抗過氧化脂質能力,推測青蛋殼萃取物的抗脂質氧化能力來 自於蛋殼顏色差異造成,可能為膽綠素所致。

(71)

三、抗腫瘤能力之測定

(一)、 活化蛋殼萃取物抑制腫瘤細胞能力之研究

1. 濃度與處理時間對肝臟腫瘤細胞抑制能力的影響

對huh 7 細胞進行不同濃度與不同時間的活化青殼蛋萃取物處 理。結果顯示:huh 7 會隨著活化靑蛋殼萃取物處理濃度的上升與處 理時間的增加,而存活率隨之下降 (p < 0.001) (圖 9 A)。將白蛋殼以 相同方法製成活化白蛋殼萃取物,以同樣方式測試其對huh 7 細胞存 活率之影響,結果顯示:活化白蛋殼萃取物與靑蛋殼同樣具有抑制 huh 7 細胞存活之能力(圖 9 B)。

2. 對不同細胞株存活率之影響

比較活化青蛋殼萃取物對肝臟腫瘤細胞株Hep G2、huh 7、肺癌 細胞株 A549 與乳癌細胞株 MCF 7 等 4 株腫瘤細胞存活率之影響,

結果顯示以含4% 活化靑蛋殼萃取物的培養液處理,對肝臟腫瘤細胞 株huh 7 與 Hep G2 最具明顯的抑制效果。而小鼠胚胎纖維母細胞 MEF 與人類骨髓幹細胞株HBM 01 做為非腫瘤細胞之對照組,結果顯示:

活化靑蛋殼萃取物並不會對HBM 01 產生毒害;而在初代培養的 MEF 實驗中,以含4%活化靑蛋殼萃取物的培養液與細胞處理 48 小時後,

(72)

Hep G2 與 huh 7 明顯地減少 40% 與 50% 的毒殺效果 (p < 0.001)(圖 10)。結果推論:靑蛋殼萃取物具有選擇性抑制肝臟腫瘤細胞 Hep G2、

huh 7 的能力,而其中又以 huh 7 的感受性最強。

3. 對肝臟腫瘤細胞型態之影響

以光學顯微鏡觀察細胞型態,明顯地發現無論是Hep G2 或 huh 7 細胞經過靑蛋殼萃取物處理24 小時後,除了細胞數目減少之外,細 胞也會產生明顯的皺縮現象,在靑蛋殼處理組中的細胞體積甚至僅有 溶劑對照組的ㄧ半 (圖 11)。然而,觀察 MEF 在相同處理後,細胞數 目雖有減少,但在型態上並無皺縮情形,仍維持其正常細胞型態。

當以PI 進行細胞核染色時,也發現肝臟腫瘤 Hep G2 與 huh 7 細 胞在經過活化靑蛋殼萃取物處理過後,細胞亦有皺縮現象,而且細胞 核萎縮的比例較細胞型態皺縮的改變更大 (圖 12、13)。

數據

圖 1. 比較靑蛋殼醋酸水解液與商業膽綠素純化合物之吸光波峰值。  使用 2 mM 商用膽綠素化合物及與 70%  醋酸作用 24 小時的蛋殼酸解 液,進行可見光全波長  (330 nm – 700 nm)  之吸光值分析。 00.20.40.60.811.2330350370390410430450470490510530550570590610 630 650 670 690Wave length (nm)Absorbance (A)

圖 1.

比較靑蛋殼醋酸水解液與商業膽綠素純化合物之吸光波峰值。 使用 2 mM 商用膽綠素化合物及與 70% 醋酸作用 24 小時的蛋殼酸解 液,進行可見光全波長 (330 nm – 700 nm) 之吸光值分析。 00.20.40.60.811.2330350370390410430450470490510530550570590610 630 650 670 690Wave length (nm)Absorbance (A) p.90
圖 3.  比較不同酸解時間對青蛋殼膽綠素之溶解

圖 3.

比較不同酸解時間對青蛋殼膽綠素之溶解 p.91
圖 3.  商業膽綠素之 HPLC 圖譜。(A)  在波長 371 nm 下測得不同滯留時間之吸光圖譜,在 RT 4.64 min  有主要的波 峰; (B)  將 RT 4.64 min 波峰以全波長 UV 掃描,發現於 371 nm 與 635 nm 各具吸光波峰,確認其為膽綠素所特有。

圖 3.

商業膽綠素之 HPLC 圖譜。(A) 在波長 371 nm 下測得不同滯留時間之吸光圖譜,在 RT 4.64 min 有主要的波 峰; (B) 將 RT 4.64 min 波峰以全波長 UV 掃描,發現於 371 nm 與 635 nm 各具吸光波峰,確認其為膽綠素所特有。 p.92
圖 4.  青蛋殼抽提物之 HPLC 圖譜。(A)  在波長 371 nm 下測得不同滯留時間之吸光圖譜,在 RT 4.61 min 有主要的 波峰,(B)  將 RT 4.61 min 波峰以全波長 UV 掃描,發現此一物質於 371 nm 與 635 nm 各具吸光波峰,確認其為膽綠 素所特有。

圖 4.

青蛋殼抽提物之 HPLC 圖譜。(A) 在波長 371 nm 下測得不同滯留時間之吸光圖譜,在 RT 4.61 min 有主要的 波峰,(B) 將 RT 4.61 min 波峰以全波長 UV 掃描,發現此一物質於 371 nm 與 635 nm 各具吸光波峰,確認其為膽綠 素所特有。 p.93
圖 5.  白蛋殼抽提液之 HPLC 圖譜。在波長 371 nm 下測得不同滯留時間之吸光圖譜,白殼蛋抽提液於 RT 1.33min 後,即無較明顯吸光波峰的出現,(B)  將 RT 4.64 min 波峰以全波長 UV 掃描,發現此一物質不具膽綠素所特有吸光 波峰,其代表白殼蛋不具有或僅有極少量膽綠素。

圖 5.

白蛋殼抽提液之 HPLC 圖譜。在波長 371 nm 下測得不同滯留時間之吸光圖譜,白殼蛋抽提液於 RT 1.33min 後,即無較明顯吸光波峰的出現,(B) 將 RT 4.64 min 波峰以全波長 UV 掃描,發現此一物質不具膽綠素所特有吸光 波峰,其代表白殼蛋不具有或僅有極少量膽綠素。 p.94
圖 6.  蛋殼抽提液之清除 DPPH 能力。將靑蛋殼抽提液 (OD 375 nm  =  3.65;Biliverdin 6.19 μM )  或白蛋殼抽提液進行百倍稀釋,並與等體 積之 DPPH 乙醇溶液均勻混合,於室溫下作用 30 分鐘後,進行 OD 517  nm 測定。以 1 IU/ml  的 α-生育醇作為正對照。  *  表示與 Solvent 組及白蛋殼抽提液組間具有極顯著差異  (p &lt; 0.001) -20020406080100

圖 6.

蛋殼抽提液之清除 DPPH 能力。將靑蛋殼抽提液 (OD 375 nm = 3.65;Biliverdin 6.19 μM ) 或白蛋殼抽提液進行百倍稀釋,並與等體 積之 DPPH 乙醇溶液均勻混合,於室溫下作用 30 分鐘後,進行 OD 517 nm 測定。以 1 IU/ml 的 α-生育醇作為正對照。 * 表示與 Solvent 組及白蛋殼抽提液組間具有極顯著差異 (p &lt; 0.001) -20020406080100 p.95
圖 7.  蛋殼抽提液之清除超氧化物陰離子之能力。將靑蛋殼抽提液

圖 7.

蛋殼抽提液之清除超氧化物陰離子之能力。將靑蛋殼抽提液 p.96
圖 8. 蛋殼抽提液抑制脂質過氧化物之能力。將靑蛋殼抽提液 (OD 375

圖 8.

蛋殼抽提液抑制脂質過氧化物之能力。將靑蛋殼抽提液 (OD 375 p.97
圖 9.  活化蛋殼萃取物不同濃度與時間處理對 huh 7 細胞存活率之影響。 (A) 肝癌細胞 huh 7 與不同濃度活化靑蛋 殼萃取物之培養液處理 24 或 48 小時。(B)  以含不同濃度之活化白蛋殼萃取物之培養液處理 24 小時。以 MTT 方式 進行存活率分析。  *  表示與 0% 組之間具有極顯著差異  (p &lt; 0.001) 020406080100120 0% 1% 2% 3% 4%

圖 9.

活化蛋殼萃取物不同濃度與時間處理對 huh 7 細胞存活率之影響。 (A) 肝癌細胞 huh 7 與不同濃度活化靑蛋 殼萃取物之培養液處理 24 或 48 小時。(B) 以含不同濃度之活化白蛋殼萃取物之培養液處理 24 小時。以 MTT 方式 進行存活率分析。 * 表示與 0% 組之間具有極顯著差異 (p &lt; 0.001) 020406080100120 0% 1% 2% 3% 4% p.98
圖 10.活化青蛋殼萃取物對不同細胞株存活率之影響。小鼠初代纖維母細胞 MEF、人類幹細胞 HBM 01、肝癌細胞 huh  7 與 Hep G2、肺癌細胞 A549、乳癌細胞株 MCF7 等,分別與含 4%活化靑蛋殼萃取物之培養液處理 24 或 48 小時後, 以 MTT 方式進行存活率分析。  a, b, c, d 不同字母者表示具有極顯著差異  (p &lt; 0.001) 020406080100120

圖 10.活化青蛋殼萃取物對不同細胞株存活率之影響。小鼠初代纖維母細胞

MEF、人類幹細胞 HBM 01、肝癌細胞 huh 7 與 Hep G2、肺癌細胞 A549、乳癌細胞株 MCF7 等,分別與含 4%活化靑蛋殼萃取物之培養液處理 24 或 48 小時後, 以 MTT 方式進行存活率分析。 a, b, c, d 不同字母者表示具有極顯著差異 (p &lt; 0.001) 020406080100120 p.99
圖 14.活化靑蛋殼萃取物處理對肝臟腫瘤細胞 huh 7 自體凋亡率的影響。  huh 7  與含不同濃度之溶劑或活化青蛋殼萃取 物之培養液處理 12 小時後,經 Annexin V、PI  共同染色。(A)以流式細胞儀進行自體凋亡偵測。(B)自體凋亡比率值。

圖 14.活化靑蛋殼萃取物處理對肝臟腫瘤細胞

huh 7 自體凋亡率的影響。 huh 7 與含不同濃度之溶劑或活化青蛋殼萃取 物之培養液處理 12 小時後,經 Annexin V、PI 共同染色。(A)以流式細胞儀進行自體凋亡偵測。(B)自體凋亡比率值。 p.104
圖 15.活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞 Casepase-3  活化之 影響。huh 7  細胞經含 4%活化靑蛋殼萃取物之培養液處理不同時間 後,以兔抗人類活化 Caspase-3  抗體進行染色,配合流式細胞儀測量 含有活化 Caspase-3  的細胞族群比例。  a, b, c, d 不同字母者表示具有顯著差異  (p &lt; 0.05) *01020304050607080900 hr3 hr6 hr 12 hr 24 hr

圖 15.活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤

huh 7 細胞 Casepase-3 活化之 影響。huh 7 細胞經含 4%活化靑蛋殼萃取物之培養液處理不同時間 後,以兔抗人類活化 Caspase-3 抗體進行染色,配合流式細胞儀測量 含有活化 Caspase-3 的細胞族群比例。 a, b, c, d 不同字母者表示具有顯著差異 (p &lt; 0.05) *01020304050607080900 hr3 hr6 hr 12 hr 24 hr p.105
圖 16.活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞中 Caspase-9  活性之影響。(A) huh 7 細胞經含 4%活化靑蛋殼 萃取物之培養液處理不同時間後,以 Western blot 方式偵測細胞中 Caspase-9  活性。(B)  以影像處理軟體進行冷 光面積計算。

圖 16.活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤

huh 7 細胞中 Caspase-9 活性之影響。(A) huh 7 細胞經含 4%活化靑蛋殼 萃取物之培養液處理不同時間後,以 Western blot 方式偵測細胞中 Caspase-9 活性。(B) 以影像處理軟體進行冷 光面積計算。 p.106
圖 17.活化靑蛋殼萃取物對 huh 7 細胞粒線體功能之影響。  huh 7  細胞經含 4%活化靑蛋殼萃取物之培養液處理不同 時間後,以 rhodamine 123  進行染色,並以流式細胞儀進行粒線體功能分析,Mean 值代表 Rhodamine (+)  螢光強度 之平均值。

圖 17.活化靑蛋殼萃取物對

huh 7 細胞粒線體功能之影響。 huh 7 細胞經含 4%活化靑蛋殼萃取物之培養液處理不同 時間後,以 rhodamine 123 進行染色,並以流式細胞儀進行粒線體功能分析,Mean 值代表 Rhodamine (+) 螢光強度 之平均值。 p.107
表 4 活化靑蛋殼萃取物不同濃度與時間處理對 huh 7 存活率之影響。  處理  細胞存活率 (%)  平均 ± SD  樣品數 (n)  含 1%  活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時  92.03 ± 7.42  6  含 2%  活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時  78.36 ± 5.73 *  6  含 3%  活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時  56.92 ± 7.28 *  6  含 4%  活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時  17.20 ± 5.76 *  6  含 1

表 4

活化靑蛋殼萃取物不同濃度與時間處理對 huh 7 存活率之影響。 處理 細胞存活率 (%) 平均 ± SD 樣品數 (n) 含 1% 活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時 92.03 ± 7.42 6 含 2% 活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時 78.36 ± 5.73 * 6 含 3% 活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時 56.92 ± 7.28 * 6 含 4% 活化靑蛋殼萃取物培養液處理 24 小時 17.20 ± 5.76 * 6 含 1 p.109
表 6 活化青蛋殼萃取物處理對不同細胞株存活率之影響  細胞株  細胞存活率 (%)  平均± SD  樣品數  (n)  MEF 24 小時處理 83.9 ± 1.5 a 6  huh 7 24 小時處理 46.7 ± 2.37 b 6  MEF 48 小時處理  70.3 ± 4.38  a  6  HBM 01 48 小時處理  105.8 ± 2.05  b  4  huh 7 48 小時處理  19.7 ± 2.34  c  6  Hep G2 48 小時處理  27.55 ± 1.69  d

表 6

活化青蛋殼萃取物處理對不同細胞株存活率之影響 細胞株 細胞存活率 (%) 平均± SD 樣品數 (n) MEF 24 小時處理 83.9 ± 1.5 a 6 huh 7 24 小時處理 46.7 ± 2.37 b 6 MEF 48 小時處理 70.3 ± 4.38 a 6 HBM 01 48 小時處理 105.8 ± 2.05 b 4 huh 7 48 小時處理 19.7 ± 2.34 c 6 Hep G2 48 小時處理 27.55 ± 1.69 d p.110
表 8 活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞中 Casepase-3  活化之影響  活化靑蛋殼萃取物處 理時間  Caspase-3  活化細胞比率 (%)平均± SD  樣品數  (n)  0 hr  4.407 ± 4.27  a  4  3 hr  4.792 ± 1.15  a  4  6 hr  17.494 ± 7.52  b  4  12 hr  45.517 ± 9.82  c  4  24 hr  75.012 ± 6.68  d  4  a, b, c, d 不同字母者表示具有

表 8

活化靑蛋殼萃取物對肝臟腫瘤 huh 7 細胞中 Casepase-3 活化之影響 活化靑蛋殼萃取物處 理時間 Caspase-3 活化細胞比率 (%)平均± SD 樣品數 (n) 0 hr 4.407 ± 4.27 a 4 3 hr 4.792 ± 1.15 a 4 6 hr 17.494 ± 7.52 b 4 12 hr 45.517 ± 9.82 c 4 24 hr 75.012 ± 6.68 d 4 a, b, c, d 不同字母者表示具有 p.111

參考文獻

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