Inner Drum (Polycarbonate)
二、環型反應器
環型反應器(Mode 1120 Biofurface, USA)，其內容包含反應器底 座、轉子、生物膜片、內外圍玻璃，以及用來連接轉子的轉速馬達，
整組系統的材質，以聚碳酸酯(Polycarbonate)和不鏽鋼及玻璃組合而 成，其主要功能是利用轉速馬達(1120 Motor Controller)，連接內部轉 子，配套馬達的轉速(rpm)並對照 ARs 系統手冊末頁對照表，調整轉速 馬達 RPM 位置，可成功模擬配水系統中不同直徑(Inch)的管材之流水 速率，轉子上的可拆裝的生物膜片(Slide)共有二十組膜片，用來提供水 中微生物附著的生物膜片，每組附著生物膜片的表面積為 18.75 cm2， 膜片材質可依配水系統中輸送水道的管材而定。
ARs 系統本體運轉，利用水樣之進出流，提供生物膜片上微生物 的 附 著 來 源 ， 進 出 流 量 的 方 法 是 利 用 數 位 可 調 式 流 量 蠕 動 幫 浦 (Economy drive _A-07524- 40 )，經由已備妥之血清瓶(2L)作為循環水之 水源處，連接蠕動管直接進入 ARs 系統，再由系統中底部作為出流水 口處，並由出流水處與水源處做一循環的動作，即為模擬配水系統中 進出流水的行程，此時系統運轉時內部水樣之容積約為 880 mL。
圖 4 環型反應器(Annular Reactor system, ARs)系統圖
P
動幫浦
(一)系統本體組裝
ARs 系統內含轉子、生物膜片、內外圍玻璃以及底座，系統架設 之前，必須進行滅菌的動作，組裝過程，首先必須將生物膜片安裝於 轉子，全部共有二十組，並將此部分安置在底座上方，轉子與底座之 間以不鏽鋼滾珠銜接，之後並分別將內外圍玻璃安裝於底座之內外圍 O-Ring 的上方，以防止水樣滲出，之後並將上部裝置套住系統，鎖住 螺絲本體，即此安裝部分已逐步完成。
1.系統進流量與轉速控制
ARs 系統之進轉速、流量與控制，主要是利用轉速馬達連接內部 聚碳酸酯(Polycarbonate)材質所製成的圓柱體轉子，配合轉速馬達，以 轉動的方式模擬配水管網內，不同直徑管線之流水速度所造成的剪應 力，模擬配水系統中的流速，本實驗之設計，選定以三種轉速，分別 是 50、134、185 rpm，主要為模擬直徑為 100 mm 的管線，其流速為 36.6 、98.0 、135.6 cm/sec。而 ARs 系統中進流水量，是利用數位可調 式流量蠕動幫浦(Economy drive _A-07524- 40 )，連接蠕動管後，並經 由已配製之有機物當做營養源之供給處，直接進入 ARs 系統進行培養 運轉，出流水處於系統中底部，進入水源處做一循環的動作，即為模 擬配水系統中進出流水的行程。其為模擬水體處於配水管網中，停留 時間的長短，在此以三種流量模擬管網中的停留時間的長短，流量與 ARs 所模擬之水力停留時間分別為 4.0、9.0、20.0 mL/min；3.6 、1.6、
0.3 hr。
(二)生物膜片之材質選定
在 ARs 裡，轉子上可拆裝的墊片(Slide)，主要為提供水體中微生 物附著的部份，主要的功能，即為模擬管網中管壁的材質，因此墊片 材質可依配水系統中輸送水道的管材而設定，在本實驗設計主要以聚 碳酸酯(Polycarbonate)、聚氯乙烯(PVC)、不鏽鋼(Stainless Steel)及混凝 土(Concrete)四種材質，作為比較的對象，在此以 ARs 系統為主體的墊 片，其提供微生物膜形成的表面積約 18 cm2。
三、參數分析 (一)水質參數分析 1.pH 與導電度
欲進行實驗時，因本實驗性質主要以澄清湖原水之有機物質，提 供微生利用，以模擬管線生物膜的消長情況，故原水之基本性質必須 符合或適於微生物之生長要件，以免限制微生物的生長環境因子。故 在進行實驗前，水樣採集前，必注意當日或近期內天氣變化情況，以 免造成樣品本身是否具相當有效之代表性原則。pH 與導電度值之測 定 ， 本 實 驗 所 使 用 玻 璃 電 極 (glass electrode) ， 及 含 有 導 電 度 電 池 (conductivity cell)，並可測得水樣之溫度，具有三種可現場分析功能之 測定儀(HI 98129, HANNA, USA）(附錄 1、2)。
(二)溶解性有機碳
本實驗主要以總有機分析儀測定分析有機物含碳量，樣品測定之 前，必須以 KHP (C8H5KO4)配製成有機碳(Organic Carbon, OC)儲備溶 液，再以有機碳儲備溶液配製成ㄧ系列的檢量線濃度，製作完成檢量 線方可進行樣本分析(附錄 3)。
原水之採樣後，便立即以過濾方式去除水中的雜質，其步驟首先 以 934-AH 濾紙先行以 2.0 µm 之孔徑初濾，之後並分別以 0.45 及 0.20 µm (cellulose acetate, MFS, USA )細濾後，便立刻將樣本以超純氮氣加 以曝氣，直至 5~10 分鐘後，即可將水樣以人工方式放入 TOC 測定儀 (Multi N/C 3000, Analytik Jena AG, Germany)之吸取位置，水樣並經由吸 取器，注入裝填有高感度觸媒(Cerium Oxide, Merck, Germany)之高溫爐 中，在 850℃下與氧氣反應生成 CO2，並藉載流氣體攜帶 CO2 流經無 機碳反應器及除濕、降溫與乾燥，最後 CO2 送至非分散紅外線吸收偵 檢器(Non-dispersive Infrared Absorption Detector)中並配合由一系列適 當濃度之總碳(Total Carbon, TC)標準溶液所得之檢量線，而測定出水樣 之 TC 量，及為 NPDOC 值(mg/L)。
(三)螢光激發與發射光譜圖
本實驗進行之初，僅以澄清湖原水，做為培養生物膜之有機物的 碳來源，探討原水中有機物之性質，是否可足夠供給系統中，微生物 的利用，而往後之延續性探討不同性質有機物中，對於生物易分解性 之營養源，做更進一步之定性分析工作。
本研究利用螢光光譜儀（F-4500, Hitach, Japan）三度位向測量 EEFM（excitation emission Fluorescence Matrix）之功能特性，進行水 樣之螢光分析，偵測樣本進行螢光光譜分析時，其所產生波峰則為溶 解性有機物質之螢光波峰，該設備光源採用氙燈作為光源，功率為 150 W，偵測器為光電倍增管，其功能除了傳統單一波長掃描外，並具有 三度位向測量 EEFM（excitation emission Fluorescence Matrix）之功能，
藉此功能可將激發及發射波長分別繪製於 X 及 Y 軸上，並將螢光強度 顯示於 Z 軸，依光柵寬度設定，產生數百至數千筆之數據資料，儀器 附屬分析 FL Solutions 軟體進行 3-D 圖譜之繪製，爾後將其數據轉成 EXCEL.csv 檔後，使用本研究室請專人設計之數據整理軟體後另存成 EXCEL.csv 之檔案，使其讀入 SURFER 後可繪製出與 FL Solutions 軟 體相同的圖譜，最後將利用 SURFER 軟體將螢光圖譜呈現出來，但使 用 FL Solutions 軟體作為 EX/EM（excitation/emission）判讀效率較佳，
故繪圖與圖譜之判讀是採分開作業之方式。
進行水樣之螢光分析時，設定激發發射波長之全譜 3-D 掃描，使 用前將實驗室之超純水置於一公分之石英比色管中（四面透明），並置 入樣品槽掃描，作為空白 3-D 掃描，隨後約取八分滿之水樣於一公分 之石英比色管（四面透明）中，進行樣本 3-D 掃描，掃描後利用螢光 圖譜分析軟體本身的功能，將水樣圖譜與空白圖譜相減後，即可得到 樣本真實之螢光圖譜。螢光光譜儀(F-4500, HITACHI, Japan)之操作條 件，如表 5。
表 5 螢光光譜儀(F-4500, HITACHI, Japan)之操作條件 儀器名稱 HITACHI-Fluorescence
Spectrophotometer, Model F-4500
光源 氙燈
數據模式 Fluorescence
掃描種類 3-D Scan
EX ( nm )掃描範圍 200~800 EM ( nm )掃描範圍 200~800
光柵( nm ) 10
掃描速度( nm/min ) 30000
PMT Voltage（V） 700
(四)餘氯
淨水廠中最常見的消毒方法，即使用加氯的方式，而應符合法規 限制及對水中有機物造成其它消毒副產物問題下，在低氯量的情況之 下，並未能有效控制管網中微生物的再生長，故本實驗亦探討加氯處 理後，分布於系統內部或生物膜片上之菌相消長情況及細菌死活的判 斷。在此實驗中所選定之消毒劑以次氯酸鈉(NaOCl)及二氧化氯(ClO2) 為主，氯測定標定之方法，主要參考美國水及廢水之標準測定方法 (Standard Methods 4500-ClO2 B.Iodometric Method)標定氯離子濃 度 (ClO2/L)，作法取 100 mL 去離子水並植入 5 μL 二氧化氯，並加入 0.5 mL 醋酸，使水樣之 pH 值控制在 3~4 之間，上述步驟完成之後，並取約 0.5g 之碘化鉀(KI)加入水樣中，持續以磁石攪拌 5 分鐘後，直至水樣呈 現褐色時，利用 0.025 N 之硫代硫酸鈉(Na2S2O3)滴定至淺黃色，並加入 數滴澱粉指示劑使水樣呈深藍色，持續將水樣完成至滴定終點，並紀 錄滴定體積，此實驗方法中亦分析其空白實驗組，以計算其氯離子濃 度(附錄 4)。
(五)有機物分子量之分離與濃縮
因自然界中，用以提供微生物成長的要件有碳、氮、以及磷，然 而一般最佳比值為 100：10：1，而本實驗水樣來自於澄清湖中的原水，
模擬配水管網中的異營菌的生成(Chandy＆Angles, 2001 )，因此必須考 量存在於水中可被微生物分解的機質。在此並以水中溶解性有機碳作 為提供微生物分解的營養機質，且實驗設計並以不同濃度的溶解性有 機碳(DOC)分別是 1、2，4 mg-C/L，配合 UF 膜分離裝置(Amicon 8400.Millipor,USA)，以及分子濾膜 5 K、10K，及 30 K，以高壓力的氮 氣連接分子膜分離裝置，分離出不同分子量中不同的溶解性有機碳濃 度的水樣。
水樣來源主要以高雄澄清湖之原水作為水樣，採樣後立即測定水 樣中 DOC 的含量，以確保水樣中有足夠的機質提供生物膜的成長，若 水樣中有機物質濃度過低時，可利用減壓濃縮機(Heidolph Caborota 4000, Germany)濃縮水樣，提高水中溶解性有機碳量的濃度，並依實驗 試程條件以調整不同的 DOC 濃度，分別為 1、2 及 4 mg-DOC/L，作為 比較的對象，如此可判斷在短期之內，水中有機質濃度的高低，是否 影響 ARs 中生物膜形成的速率。
有機物之分離，主要使用 UF 膜分離裝置，其分離原理是通入高 壓氮氣，並藉由過濾時薄膜之分子量孔徑大小進行分離。分離裝置配 件包括：氣體通入管、上蓋（含壓力管及洩壓閥）、壓克力水樣容器、
壓力套、薄膜載器、攪拌器等器材所組成(如圖 5)。
有機物分離的作法，取不同分子量大小(5K、10K、30K)的分子濾 膜(Millpore, Corporation, Bedford, MA 01730, USA )，使用之前新濾膜先 置於 500 mL 燒杯，加入適量的蒸餾水，取出 UF 膜後，並將濾膜之光 滑面朝下平放，浸置於蒸餾水中 60 分鐘，並更換三次洗滌液。分離水 樣時，將濾膜之光滑面朝上並置入分離裝置(Ultrafiltration Cell )中，加 入蒸餾水並施以 55 psi 氮氣壓力進行至少五分鐘之加壓過濾，以去除 新濾膜內所含之甘油與疊氮化鈉。
N N
2 2
g g a a s s
Mix i n g
R o t o r
Filtrate B
C D A
E
F
圖 5 不同分子量有機物分離裝置 (Amicon 8400Millipore , USA）
(A=高純氮鋼瓶; B=轉速調節鈕; C=濾膜; D=水樣; E=洩壓閥; F=濾液) 濾膜之保養與冰存，使用完後之濾膜，其保存方法，主要先將濾 完後之濾膜，浸置於 0.1Ｎ-NaOH 中，並加入適量的次氯酸鈉(NaOCl)，
30 分鐘後，取出濾膜並以去離子水沖洗且可重複使用，而使用之前必 須在分離裝置內部，以蒸餾水先行加壓過濾後，即可開始分離水樣。
而保存方法，濾膜清洗過後，使用 10 % 乙醇冷藏(4℃)保存即可。
(六)生物性參數 1.生物膜採集方法
生物膜的取出方法，一般較為常見的有超音波震盪法、無菌刮刀 刮除法、棉花擦拭法(SWAB)。超音波震盪法，取出墊片後放置於 100 mL 量桶內並添加無菌水，置入超音波震盪器(5510 ,BRANSON, Taiwan)，
調整 47 kHz 以 20 °C 兩分鐘的條件之下，可將生物膜片上的細菌介由 無菌水及超音波震盪將細菌震盪取出，但此法容易導致細胞破裂，造 成本計數方法的誤差。另一種方法即為無菌刮刀，如滅菌後鐵氟龍刮 刀或手術用刀，刮除附著於墊片上的生物膜，此法較不適於使用，因 生物膜反應器中的生物膜片材質是以聚碳酸酯(Polycarbonate-PC)所製 成，如利用此法，刮除的過程會直接破壞其表面的結構。棉花擦拭法 (SWAB) ， 以 一 般 脫 酯 棉 花 棒 ， 經 過 高 溫 高 壓 滅 菌 釜 (Speed
Mixing Rotor
脫酯棉花棒，擦拭生物膜片，並將膜片上細菌擦拭於已備妥且裝有無 菌稀釋水的試管，連同脫酯棉與試管同置於均質器(Vortex)上，均勻的 將棉花上的細菌，以離心的方式將細菌均勻的取出於試管中。
本實驗中生物膜採集方式，主要參考 Gagnon and Slawson (1999) 方法，為了避免破壞微生物本體及墊片表面材質，故本實驗主要以棉 花擦拭法(SWAB)為主，其以脫脂棉所製成，主要材料配置，試管，無 菌稀釋水、Vortex 震盪離心機以及無菌操作台。無菌稀釋水的配製，
以磷酸二氫鉀溶液以及氯化鎂溶液配製而成，磷酸二氫鉀溶液取 3.4 g 磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶於 50 mL 的蒸餾水中，並以 1.0 M NaOH 溶液 調整其 pH 值為 7.2±0.5，然後加蒸餾水至全量為 100 mL，儲存於冰箱 中作為儲存液備用。氯化鎂溶液取 8.1 g 氯化鎂(MgCl2‧6H2O)先溶於 蒸餾水，完全溶解過後，再以蒸餾水定量到 100 mL，保存於冰箱中作 為儲存液備用。無菌稀釋水之配方，分別取 10 mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀溶液，再加入蒸餾水至全量為 2000 mL，混搖均勻 後，分裝於稀釋瓶中，經 121℃滅菌 15 分鐘，作為無菌稀釋液備用。
而樣本採集前，必須先利用無菌試管添加 10 mL 之無菌稀釋水，
並經由高溫高壓滅菌，冷卻後冰存。SWAB 必須先行以高溫高壓滅菌 釜進行滅菌，滅菌完成後並置於無菌操作台內，再利用 UV 光滅菌乾 燥，此後直接把 ARs 內之生物膜片取出，並以 SWAB 在墊片上擦拭 5~10 次，將墊片上所附著之微生物擦拭於試管中內部之無菌稀釋水，並利 用 Vortex 離心的效果，將微生物均勻的取出，最後再將 SWAB 擠壓於 試管的管壁，將菌液完全取出即可待測分析。
2.細菌之計數
以往總生菌數之計數是以平板技術法為主，塗抹在已配製好之營 養培養基上，提供微生物生長，因此法在本實驗進行中，過程較為繁 雜 且重複性 較差， 故本實驗 以 DAPI (4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Sigma, ref. D9542)染色劑，針對 ARs 培養後之水相，及 生物膜採集後之微生物，藉其與微生物中之 DNA 鍵結產生具有螢光特 性之機制，推算樣本之總菌落數(Kepner and Pratt, 1994)。其作法(Saby et al., 1997)，用利用水或者 Mcllvain’s pH 4 緩衝液稀釋至工作濃度為 10 μg/L，並取 1mL 之 DAPI 工作液於無菌培養皿中，並取適當水樣以黑 色的碳酸纖維膜過濾(DMF, ref. 111156, 孔徑 0.2 μm)，濾後取濾膜覆蓋 於已備妥之無菌培養皿內部 DAPI 染劑上，靜置培養 5~10 分鐘，使染 劑迅速進入細胞體之 DNA，並與 DNA 鍵結產生螢光的效果，之後並 取 出 濾 膜 至 於 載 玻 片 上 ， 再 配 合 螢 光 光 學 顯 微 鏡 (Fluorescence Microscope) (E-400, Nikon, Japan)，以濾光片(UV-2A, Nicon, Japan)觀察 螢光呈色反應，並透過 CCD 影像擷取器 (Evolution VF colled color, MediaCybernetics, USA)擷取目鏡視野中影像，利用處理軟體(Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA)來計算細菌數，因此在活體及已破 裂死亡的菌體，均可以此方法作為計數方法。
計數公式：
cells=CCD 擷取視野之總菌落數
162×121(μm)=CCD 擷取視野之面積(μm2)
9.6×108=樣本之過濾有效面積(μm2) X=過濾樣本菌液之體積
cells/mL=單位體積之總菌數
mL cells mL
X m m cells
/ 10
6 . ) 9 ( 121 162
8 2
2
除總菌數分析之外，在本研究中，亦有探討加氯效果對菌相活性 之比較，而 DAPI 目前僅供計數總菌的功能，非能更進ㄧ步對於細胞體 的死活做比較，如此經由消毒劑處裡後之樣本中，無法立即分析判別 微生物之存活與凋亡，故除以 DAPI 進行計數總菌之外，本實驗以 CTC (5-cyano-2,3-diolyl tetrazolium chloride) [Polysencieses, Inc. Germany ]，
(進行檢測具有呼吸活性的細菌，該試劑可與具活性的細胞體結合 (Cappelier et al., 1997)。其作法即取 100 μL 之 50 mM 之 CTC 染劑，添 加於 1.0 mL 水樣中，並持續以 200 rpm 於離心機中，運轉 60 分鐘後，
亦使用黑色的 0.2 μm 碳酸纖維膜過濾，並取得濾膜之後，以濾光片 (G-2A, Nicon, Japan)藍色光源下，配合顯微鏡的操作之下，觀察樣本中 菌相的死活情況。
本法利用螢光染色劑，及螢光顯微鏡的操作之下，DAPI 所呈現的 菌數為總聚落數，鏡檢之下呈現藍綠色；而 CTC 僅針對具有呼吸作用 的微生物，其反應後所呈現的光澤為紅色。(圖 6)
圖 6 DAPI 與 CTC 染色後之菌相之外觀變化(A 總菌; B 活菌)