大 仁 科 技 大 學

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大 仁 科 技 大 學

環境管理研究所 碩士學位論文

消毒對生物膜活性之影響

Effect of Disinfection on the Bioactivity of Biofilm

指 導 教 授:賴 文 亮 博士 研 究 生:楊 博 名

中 華 民 國 九十五 年 七 月

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摘要

配水管網生物之形成對飲用水質可能產生:(1)微生物擴大增殖其 它有機體;(2)飲用水中的混濁、味覺以及色度;(3)由鐵跟錳氧化管壁 及生物膜產生紅水及黑水;(4)高量的 HPC 菌易干擾大腸菌的計數;(5) 處於厭氣條件環境之下易產生硫化氫 H2S,而積聚依附過量生物膜導致 管璧的腐蝕;(6)壓力水頭損失,減少水流量;(7)影響加氯滅菌之效果;

(8)為防蝕控制添加磷所導致微生物的滋生;(9)當生物膜剝落進入配水 系統,導致民眾飲用水風險提高(如腸胃炎)。

由文獻中得知生物膜生長之控制,降低有機物含量及配合消毒劑 之使用應是可行之方式,然而對於管網系統中,消毒劑對水相及生物 膜之細菌活性之影響,許多研究者均以實驗室配製之有機物或植入單 一細菌進行生物膜生成之模擬,此與實際現況相去甚遠,結果之應用 亦是相對困難。環形反應器 (Annular Reactors system, ARs, Model 1120, Biosurface, USA)由於具動態模擬之功能,包括水力停留時間及轉速控 制,可模擬水流流經自來水管線之水力停留時間及剪應力對水相及生 物膜細菌分佈之影響,故本研究以其作為評估物理及化學參數對配水 管網生物膜消長之影響之工具。

研究結果顯示,對生物膜最佳形成量,以 DAPI 染劑進行染色計數 表示,當 ARs 系統控制水流量 20 mL/min 與轉速 134 rpm 最佳。此外 不同分子量有機物之生物分解性以實驗室建立之 BDOC 濾床進行比 較,發現大於 30 K Da 者低於 5K Da,且 5 天後在生物濾床之分解率前 者僅達 60%,後者則達 100%。至於消毒劑(二氧化氯)對 ARs 系統中水 相 及 生 物 膜 菌 相 活 性 之 影 響 , 本 研 究 利 用 DAPI(4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) 及 CTC (5-cyano-2,3-diolyl tetrazolium chloride)螢光染色計數進行判別外,另 ATP(腺核甘三磷酸)測定及配合 SEM(scanning Eleectron Microscopy)觀 測細菌外觀破壞之程度,發現細菌生長穩定後加入 1 mg/L 之二氧化氯 (ClO2)4 小時內,生物膜及水相中微生物之減少量明顯滅少,之後其變 化不大,此結果與 ATP 之偵測結果相近,而加氯後,從 SEM 觀測水相

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細菌之破壞較生物膜細菌之破壞較明顯,另水相及生物膜上細菌經 DAPI 及 CTC 染色後之強度明顯低未加消毒劑前,此結果均顯示加入 消毒劑對細菌均有某種之破壞程度。

關鍵詞:環型反應器(ARs);腺核甘三磷酸 (ATP);4’6-二月米基-2-苯基 引朵(DAPI);5’氰基-4’甲苯基-4’ 唑 (CTC);掃描式電子顯微 鏡(SEM)。

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Abstract

Biofilm formation in the distribution system may produce some problems in portable water quality including (1) the starting point of a trophic food web leading to the proliferation of higher organisms;(2) the generation of turbidity, taste, and odours ;(3) the production of red and black waters resulted from the activity of both manganese and iron oxidizing bacteria;(4) Higher HPC interfering with detection of coliforms or sanitary indicators;(5) the accumulation of attached biomass promoting corrosion, particularly under anaerobic conditions with the production of H2S;(6) the loss of pressure or the decrease of water flow;(7) the inhibition of disinfection efficiency of oxidant by biofilm;and (9) raising the risk of drinking for people owing to the biofilm peeling off in the distribution system .

Regarding to the control of biofims, decreasing the content of organic matter and adding suitable oxidant dosage are feasible ways suggested by many researchers. But for the effect of oxidant on bioactivities of planktonic bacteria and biofilm, pure compounds and single or mixed inoculum were always selected to evaluate in most experiments. Apperntly, it is diffcultly to simulate real situation owing to remakedly different water quality. Recentaly, the annular reactor system, with stimutaneously changing flow volume and flow velocity, was recognized a feasible tool to simulate hadraulic resident time and shear force produced from drinking water flowing through in the distribution system. Therefore, in this research, annular reactor (AR) system was selected to simulate the effect of both parameters such as physical and the chemical conditions on biofilm formation in the distribution system.

Up to date, some results were conducted. The optimal biofilm formation in ARs system, expressed by bacterial cells enumerated by

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staining of DAPI (4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride), can be reached in contion of 20 mL/min of flow rate and 134 rpm of the rotational speed. The biodegradability of two different properties of organic matter was passes through BDOC filter establislied in our laboratory, greater than 30 K Da was less than smaller than 5 K Da. After five days, only 60% can be utilized by BDOC filter for the former, whicl 100% was decomposed for the later.

The variations of bioactivities of planktonic bacteria and biofilm after dininfection by the oxidant (chlorine dioxide) can be judged by staining of CTC (5-cyano-2, 3-diolyl tetrazolium chloride) and DAPI. Also, using ATP measurement and the observation of bacteria by SEM (scanning Eleectron Microscopy) also can provide information of destructive degree in bacterial appearance. It found that bioactivity of bacterial cells, counted by CTC staining or measured by ATP, dropped to close valley about four hours. Of course, the appeartnece of planktonic bacteria by SEM showed more destroying than that of biofilm. Additionally, the intensity of fluorescence for both planktonic bacteria and biofilm after staining by DAPI and CTC, with disinfection became darker than without disinfection.

Key words:

ARs (Annular Reactors system);DAPI (4’6-Diamidino-2-phenylindole

dihydrochloride);CTC (5-cyano-2,3-diolyl tetrazolium chloride);ATP (Adenosine-5’-triphosphate bioluminescene technique);

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目錄

摘要 ... I Abstract ... III 圖目錄 ... IV

表目錄 ... 5

壹、前言 ... 1

一、研究緣起 ... 1

二、目的 ... 1

貳、文獻回顧 ... 3

一、生物膜的形成與菌相之分佈 ... 3

(一)生物膜之形成 ... 3

(二)管網生物膜菌相分佈 ... 6

(三)生物膜對配水系統水質之影響 ... 10

二、生物膜形成評估及影響參數 ... 10

(一)物理參數 ... 13

(二)化學參數 ... 16

(三)消毒劑 ... 18

參、研究流程實驗設備與分析方法 ... 21

一、研究流程架構 ... 21

二、環型反應器 ... 23

(一)系統本體組裝 ... 24

(二)生物膜片之材質選定 ... 24

三、參數分析 ... 25

(一)水質參數分析 ... 25

(二)溶解性有機碳 ... 25

(三)螢光激發與發射光譜圖 ... 26

(四)餘氯 ... 27

(五)有機物分子量之分離與濃縮 ... 28

(六)生物性參數 ... 29

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肆、結果討論 ... 36

一、水樣之基本性質及有機物之濃縮 ... 36

(一)水質基本參數 ... 36

(二)有機物之濃縮及性質 ... 36

二、水力操作參數對 ARs 系統生物膜生成之影響... 38

(一)流量 ... 40

(二)轉速 ... 41

三、有機物與墊片性質對系統生物膜生成之影響 ... 43

(一)有機物性質 ... 43

(二)墊片材質 ... 46

四、消毒對系統中水相及生物膜細菌活性之影響 ... 47

(一)消毒過程總菌數與活菌差異 ... 47

(二)電子顯微鏡菌相之觀測 ... 50

伍、結論 ... 53

參考文獻 ... 55

附錄 ... 62

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圖目錄

圖 1 生物膜形成階段 ... 4

圖 2 飲用水中管網生物膜生成與剝落示意圖 ... 5

圖 3 研究架構流程圖 ... 22

圖 4 環型反應器(Annular Reactor system, ARs)系統圖 ... 23

圖 5 不同分子量有機物分離裝置 ... 29

圖 6 DAPI 與 CTC 染色後之菌相之外觀變化 ... 32

圖 7 不同 ATP 濃度標準檢量線圖 ... 35

圖 8 兩種前處理方式對 ARs 系統中墊片附著微生物取出之影響 ... 38

圖 9 ARs 系統中水相與生物膜細菌生長曲線圖 ... 39

圖 10 進流水量對 ARs 墊片上附著總細菌數生長曲線之影響 ... 41

圖 11 轉速對 ARs 墊片上附著總細菌數之生長曲線之影響 ... 42

圖 12 不同性質有機物之生物分解性 ... 43

圖 13 有機物性質對 ARs 系統水相及生物膜菌數生長曲線之影響 ... 44

圖 14 有機物性質及濃度對 ARs 系統生物膜之總細菌生長之影響 ... 45

圖 15 不同墊片材質之對生物膜細菌生長曲線之影響 ... 46

圖 16 添加二氧化氯前與後生物膜細菌活性之變化 ... 47

圖 17 添加二氧化氯前與後水相菌活性之變化 ... 48

圖 18 添加二氧化氯水相及生物膜中 ATP 濃度變化 ... 49

圖 19 ARs 系統中水相及生物膜之菌相 ... 50

圖 20 ARs 不同生長階段及加氯消毒後菌相螢光強度變化 ... 52

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表目錄

表 1 不同處理程序下微生物族群之變化 ... 7

表 2 不同介質中常見之優勢菌相 ... 9

表 3 評估處理水質再生長潛能之方法 ...11

表 4 不同消毒劑應用於水中滅菌之優缺點比較 ... 19

表 5 螢光光譜儀(F-4500, HITACHI, Japan)之操作條件 ... 27

表 6 掃描式電子顯微鏡之操作條件 ... 33

表 7 民國 94 年 1~5 月澄清湖原水之基本參數 ... 37

表 8 不同分子量有機物之 SUVA 值 ... 38

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壹、前言

一、研究緣起

近年來大高雄水質問題,因「南化水庫至高屏堰聯通管路計畫」

與「高級淨水處理設備工程」運轉後,雖供水條件有某種程度之改變,

且水質均可控制於管制標準值內,但南部居民對高雄自來水質之適飲 性,仍存有相當高之疑問,此現象可由各地區加水站數量未見減少得 到證實。如上述情況所得知訊息結果,評估自來水處理後之水質,是 否受管網存在之問題造成二次污染所影響,應是值得深入探討之課題。

關於配水系統(distribution system)中自來水質的二次污染,主要為 存在管網中微生物的再生長作用(regrowth),此現象若發生,配水管網 水中微生物將迅速繁殖,並形成生物膜(biofilm),若生物膜剝落,除導 致飲用水質安全疑慮之外,加上自來水添加消毒劑其亦可能與剝落之 生物膜內有機物形成消毒副產物,等飲用水質問題。國外對於管線系 統生物膜之控制,以消毒劑與營養源之控制為主,在營養源之控制,

均認為低有機碳量可有效控制生物膜之形成,然有機物性質對於生物 膜形成之控制則少有文獻述及,對於生物膜之評估,許多研究者主要 以總生菌落數(CFU)進行,事實上,許多微生物無法在常用之培養基生 存,故導致微生物在配水管網系統之計數,有低估之疑,無法呈現實 際之狀況。氧化劑對配水系統中水相及生物膜之微生物之影響,亦是 值得探討之問題

二、目的

許多研究證實,以 ARs (Annular Reactor system)系統模擬配水管網 系統中,微生物形成之評估為一有效的工具,此應與該系統可採動態 化,包括變化水流速度與停留時間之操作相關。本研究,以澄清湖原 水,利用不同大小之分子濾膜分離水中有機物,並進行比較小於 5K 與 大於 30K 兩種有機物在 ARs 系統水相與生物膜菌數分佈之差異,其中 微生物之計量,以 DAPI(4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,

(11)

細菌計數,另消毒劑對 ARs 系統之水相及生物膜細菌活性之影響,則 利用 DPAI 與 CTC(5-cyano-2,3-diolyl tetrazolium chloride)染色技術,判 別樣本中總細菌數與具有活性之細菌數,藉此瞭解,消毒劑對水相與 生物膜細菌活性之差異性,另掃描式電子顯微鏡亦做為菌體表面破壞 研究之工具。

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貳、文獻回顧

一、生物膜的形成與菌相之分佈 (一)生物膜之形成

自來水處理廠中處理後之飲用水,藉由配水管網傳送過程之外,

水中微生物、有(無)機物及其他微生物的營養物質,亦可藉由管網系統 傳輸而移動,並造成微生物的迅速繁殖及再生長(Regrowth),進而形成 管線之表面上行成生物膜,在此針對當前配水管網再生長論點,可利 用下列方程式表示之(Morton et al., 2005):

此表示配水管網系統中,存在足夠有機物質營養源及微量元素,

再生長的問題即可發生,換言之,若限制管網中微生物可利用之營養 物質,或許可控制再生長的問題。而一般被提供異營性微生物利用的 營養鹽,以碳、氮、磷三種元素為主,比例為 100:10:1,其中以水 中碳的比例最為高,因此管網系統中之碳源對細菌的生存影響,最為 重要(Tsai, 2005;Chandy&Angles, 2001)。

生物膜,微生物聚集在管線內壁表面之現象,為提供微生物生長 及保護良好的棲地,其生物膜之構造可從散佈之單獨細菌行成單屬 (monolayer)至多屬,最後成為立體性結構之環境。研究指出,生物膜 具有異質性(hetergeneons)及非連續性( discontionus)之結構,其在管線 內表面展現出非均勻之分佈,在許多水渠道中生物膜之體積含 50%

(Massol et al., 1995)。

Stewart et al. (1995) 以 CLSM (Confocal Scanning Laser Microscopy ),進行兩種菌種包括 Pseusomonas aeruginosa 及 Klebsiella Peeumoniare ,於環型反應器(annular reactor)之生長結構與厚度等參數 之判斷,其發現墊片表面,部分未見生物附著,部分則見數百μm 厚度

有機質+氮+磷+微量元素 再生長

(13)

之生物膜,而墊片生物膜藉由 ethiaium bromide 及 calcofluor 染色以 CLSM 分別可判斷核酸 (nucleic acid)及多醣體 (polysaccharide)之差 別,並證實生物膜內含多醣體。

至於生物膜之形成機制,則如圖 1 所示(Percival et al., 2000)。由圖 中得知生物膜的形成之五大時期:(1)具備健康完整的表面薄膜;(2)薄 膜表層之有機體的傳輸;(3)微生物利用可逆及不可逆的方式附著於表 面薄層;(4)表層微生物對有機體的利用,使微生物大量繁殖,進而造 成生物膜的形成;(5)脫落分離,形成其他水相中浮游細菌,此五種程 序見圖 1。而 Chamberlain (1992)指出易使微生物附著,形成薄膜的方 法包括(1)修正附著表面結構的物化性質;(2)濃縮營養物質;(3)抑制金 屬物質所釋出的毒性;(4)吸附水體中之氧化劑;(5)供給為生物必須利 用之元素。但水體中之剪應力、氧化腐蝕亦會影響生物膜的剝落,其 結果則見 圖 2。

圖 1 生物膜形成階段 (Percival, et al., 2000)

Stewart et al. (1997)亦使用上述兩株菌屬進行菌相在生物膜空間分 佈 之 探 討 , 其 發 現 K. pneumoniae 在 水 相 之 生 長 速 度 雖 高 於 P.

aeruginosa 然在生物膜中之細菌數,前者並無法取代後者,且後者通 常附著於生物膜之底層,而前者反而生長在表層,並改變細菌之結構 差異性影響附著及脫附速度 (rate of attachment and detachment),以決

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定其在生物膜之分佈,且與基質溫度梯度變化無明顯相關。

圖 2 飲用水中管網生物膜生成與剝落示意圖

Characklis & Cooksey (1983)指出多醣體在生物膜中所提供優勢的 條件(1)生物膜內部的凝結力;(2)吸收結合有機與無機的營養物;(3)聚 合微生物及其副產物;(4)背景環境迅速的改變時可停止細胞流動;(5) 聚合環境中的重金屬物質;(6)聚合微粒無機材料;(7)提供細胞間交互 作用功能;(8)增加細胞體內基因傳輸。

(15)

(二)管網生物膜菌相分佈

生物膜存在之菌種,分佈管線的材質與水體間的性質,之交互作 用,提供微生物生長的最佳生長環境,並促使管網生物膜的形成。

Percival et al. (1997),其研究利用實驗室模擬配水系統,支配不同材質 之不鏽鋼材料,以 North West Water Ltd 處理後之清水,控制進流量 0.64 m/s 培養十二個月,發現二種材質之混和生物膜菌種,包含 Micrococcus spp. 、 Staphlococcus spp. 、 Acinetobacter spp., 、 Alcaligenes spp. 、 Flavobacterium spp.、Arthrobacter and Corynebacterium spp.。

另 Norton et al. (2000)利用模型試驗,將水源分別以傳統及生物處 理方法,分別控制水中生物可分解有機質(Biodegradable organic matter, BOM)濃度至高及低之水樣,分別進入配水管網系統,並藉由脂肪酸 (fatty acid analysis)分析方法,區別不同處理程序中,微生物族群之變化 ( 如 表 1) 表 中 顯 示 , 原 水 中 主 要 以 格 蘭 氏 陰 性 之 細 菌 為 主 , 其 中 Acinetobacter spp.、Pseudomonas spp.與 Klebsiella spp.佔優勢,而臭氧 後細菌屬則由原水中的 20 種,降至 13 種,並以 Pseudomonas spp.及 Rhodococcus spp.為主而經生物濾床並經由加氯後,主要出現之菌種為 Nocardia spp.。

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表 1 不同處理程序下微生物族群之變化

菌相

族群數目 原水中 臭氧

處理

過濾 出流水

配水系統 進流水樣

cPVC 管材 出流水樣

鑄鐵管材 出流水樣

Gram negative 2 4 7

Acidovorax spp.

29 6

Acinetobacter spp.

18

Agrobacterium spp.

12 2 1 12

Alcaligenes spp.

2

Alteromonas spp.

1 3

Comamonas spp.

2 5

Enterobacter spp.

2 5

Flavobacterium spp.

8 3 1

Hydrogenophaga spp.

10 1 3

Klebsiella spp.

1 2

Methylobacterium spp.

14 53 22 12

Pseudomonas spp.

2 1

Rhodobacter spp.

2 2 19

Sphingomonas spp.

2 1 2 6

Stenotrophomonas spp.

3

Xanthobacter spp.

2 1 5

Otherb Gram positive

Bacillus spp.

7 6 6

Micrococcus spp.

6

Nocardia spp.

1 3 7 53 46 82

Rhodococcus spp.

16 4

Staphylococcus spp.

1 1

Other 1 1 1

Unidentified 3 9 16 33 0 6

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經過濾處理之自來水在 20℃與 35℃之 HPC 值甚低,但在配水管網 系統所有採樣位置均發現再生長之現象,且在 20℃之 HPC 值範圍介於 106~107 CFU/L,細菌數目與水廠之距離增加而增加,且最常出現之菌 屬以 Bacillus. Flavobacterium 及 Pseudomonas (Payment et al., 1988)。

郭氏 (2001)利用 McCoy et al. (1981)及 Carter et al. (2000)模擬配水 管網系統(Robbins device)之作法,進行系統中安裝 PVC 材質之生物膜 片,水源則以台中豐原自來水廠之自來水為主,在經過 48 天培養過後 取出生物膜,經由菌種觀察及分離、純化及鑑定後,僅剩 7 株菌 (Achromobacter sp.、Pasteurella sp.兩株、Acinetobacter sp.、Sphingomonas sp. 、 Bordetella sp. 及 Acidovorax sp. , 並 表 示 Sphingomonas sp. 與 Acidovorax sp.為配水系統中存在的優勢菌種。

由上敘述得知,在不同的生長的環境背景,包括水質與管材管網 中再生長所衍生出的優勢菌,應有相當的差異。LeChevallier et al. (1987) 將水相、沖洗沉澱物管材表面出現菌相之差異性比較,發現管網生存 之微生物中,存在水相部份之微生物以 Pseudomonas vesicularis

Flavobacterium spp. 居 多 ; 鋅 膠 羽 (Zinn floc) 存 在 之 微 生 物 亦 以 Pseudomonas vesicularis 為主,而其他菌種則不存在;管網反沖洗之後 之 沉 澱 物 中 , 則 以 Arthrobacter spp. 居 多 ; 特 殊 鑄 鐵 材 料 中 , 以 Arthrobacter spp.為主; 存 在一 般管 線表 面 上 生 物 膜, 其優 勢 菌 為 Pseudomonas vesicularis

Flavobacterium spp.。

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表 2 不同介質中常見之優勢菌相 (LeChevallier et al., 1987)

水相

鋅膠羽

(Zine floc)

反洗 沉澱物

鐵突

Freric tubercle

管線表面

Pseudomonas vesicularis ++ ++ + ++

Flavobacterium spp. ++ + ++

Pseudomonas diminuta + +

Pseudomonas cepacia +

Pseudomonas pickettii +

Pseudomonas stutzeri + +

Pseudomonas fluorescens + +

Pseudomonas putida +

Pseudomonas paucimobilis + +

Pseudomonas maltophilia +

Alcaligenes spp. +

Acinetobacter spp. + +

Moraxell spp. + +

Agrobacterium radiobacter +

Arthrobacter spp. + ++ ++ +

Corynebacterium spp. + +

Bacillus spp. +

Yeasts +

CDC group II J +

Enterobacter agglomerans +

Micrococcus spp. +

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(三)生物膜對配水系統水質之影響

配水管網中存在生物膜時,因管壁上累積消長的生物膜,可能消 耗存在水中的溶氧,及消耗水中有無機碳源,產生硫化物質,並進而 形成為硫化氫氣體,影響水質之嗅度及色度,諸如此類的影響成因,

皆有可能由管網生物膜活動所造成。

傳統上表示生物膜可能衍生如下問題:(1)微生物利用水源之營養 物並擴大增殖其他有機體;(2)細菌生殖引起飲用水中的混濁、味覺以 及色度;(3)由鐵跟錳氧化管壁及生物膜產生紅水(兩株菌 Gallonaella and Leptothrix)及黑水;(4)高量的 HPC 菌易干擾大腸菌的計數;(5)處 於厭氣條件環境之下易產生硫化氫 H2S,而積聚依附過量生物膜導致管 璧的腐蝕;(6)壓力水頭損失,減少水流量;(7)影響加氯滅菌之效果;

(8)為防蝕控制,而添加磷所導致微生物的滋生;(9)當生物膜剝落進入 配水系統,導致民眾飲用水風險提高(如腸胃炎) (Fransolet et al., 1986;

Batt’e et al., 2003)。

二、生物膜形成評估及影響參數

在 19 世紀末已有學者開始進行飲用水中細菌滋生的研究,並發現 即使含碳量較表面水低之深井水,亦發現細菌的存在。在 1970 年時,

當臭氧活性碳程序之用於水處理廠進行水中生物可分解有機質之去 除,微生物再生長之現象,才再度受到重視。在 1982 年時,Van der kooij et al. (1982)進行處理水中異營性微生物成長潛能(heterotrophic growth potential)方法開發,接下 10 年在歐洲及美洲,許多評估再生長潛能之 替代方法相繼開發。此方法依測試參數及條件可歸類如下(Van der kooij, 2000)

(1) 化學參數(如 DOC,或生物性參數 Biomass) (2) 懸浮或固定式生物膜生長濾床

(3) 批次或柱狀流系統 (4) 短、中、長測試時間

(5) 生物質量特性(nature of biomass)

(20)

表 3 為常用測定參數之特性(Van der kooij, 2000),每種方法均有其 適應之條件,然而處理水中之生物穩定性之評估,能瞭解有多少的細 菌 質 量 進 入 配 水 管 網 系 統 , 故 觀 察 自 來 水 質 之 穩 定 除 測 定 AOC(assimilable organic carbon)外另 BFR(biofilm for ratio)亦需進行。

Griebe (2000)歸納影響生物膜形成之三種參數:(1)物理參數:管網 配置、流速、剪應力、溫度、材料表面屬性及特徵、水力停留時間(HRT);

(2)化學參數:機質成分及濃度、生物膜基底代謝物、氧化還原電位、

無機性離子、有(無)機微粒 ;(3)生物性參數:微生物種類(藻類,原生 動物,細菌,病毒、明確或非確定之菌種、混合或純化的培養),並針對上 述參數分別探討:

表 3 評估處理水質再生長潛能之方法

AG, attached growth (biofilm);(生物膜生成量)

AOC, assimilable organic carbon; (生物可利用有機碳) ATP, adenosinetriphosphate; (腺核甘三磷酸)

B, biomass-based parameter; (生物質量基本參數)

BDOC, biodegradable dissolved organic carbon; (生物可分解性有機碳) BFR, biofilm formation rate; (生物膜生成速率)

BGP, bacterial growth potential; (細菌生長潛能)

C, chemical parameter (organic carbon); 化學參數(有機碳) Method Characteristics Reference

AOC B, PC/HPC; SG/ST; L/MD/LD Van der Kooij et al., 1982,1984 B, MP/ATP; SG/ST; L/MD Stanfield and Jago, 1986 B, PC/ATP; SG/ST; L/MD LeChevallier et al., 1993 B, MP/TU; SG/ST; L/MD Werner, P. 1985

BGP B, MP/TDC; SG/ST, L/LD Servais, et al., 1987 BDOC C(DOC), MP; AG/ST; L/MD Joret and Levy, 1986

C(DOC), MP;AG/DT; IS/SD Lucena et al., 1990 BFR B, MP/ATP; AG/DT; IS/LD Van der Kooij et al., 1995

(21)

DT, dynamic (flow-through) test; (動力試驗) DOC, dissolved organic carbon; (溶解性有機碳) HPC, heterotrophic plate count; (異營菌平板計數) IS, in situ; (現場)

L, laboratory; (實驗室)

MP, mixed population (indigenous flora); (摻入混和菌或原生菌) PC, pure culture(s); (純化培養)

SG, suspended growth; (懸浮性生長)

SD, MD, LD, short (hours), medium (days), long (weeks) duration of test; (短中長期時 間持續試驗)

ST, static (批次)

TDC, total direct count; (直接計數 ) TU, turbidity. (濁度)

(22)

(一)物理參數 1.溫度與水力條件

水溫主要影響管網中微生物對於消耗氧氣的速率,水溫較高水中 溶氧會快速消耗,並加速管網生物膜的生成,導致生物膜量增加,造 成管壁的腐蝕。因此在夏季期間,配水系統之水溫較其他季節溫度高,

所以飲用水中微生物的污染情況,較為嚴重。Anon (1992)研究指出,

溫度不僅影響微生物生長速率(growth rates),亦影響消毒效果、消散水 中殘留餘氯、管壁的腐蝕、配水管網水力條件以及傳輸水流速度。

Tsai et al. (2004) 之研究顯示,當 ARs 系統(Biosurface technologies, Bozeman, Mont.) 轉 速 控 制 82 rpm , 水 流 速 度 為 60 cm/ssec(82×3.1416×14/60),剪應力為 0.288 N/m2,分別進行五種有機物 (sodium acetate、sodium benzoate、propionaldehyde、parahydroxybenzoic 與 ethanol),並比較水相及墊片上細菌數之差異性。實驗結果顯示,當 有機碳含量增至 1 mg/L 時,水相及墊片之菌數(以 HPC 表之)之微生物 數目有最大值,且其發現當有機碳量為 0.5mg/L 時在,墊片上細菌數 大量減少,但墊片上微生物之成長速率(growth rate)卻最大,亦即細菌 數滅少並不代表微生物之成長速率亦相對減少,且水相微生物之增加 明顯與墊片上細菌數相關。

Tsai (2005) 之研究顯示,當 ARs 系統(Biosurface technologies, Bozeman, Mont.) 轉 速 控 制 27 rpm , 水 流 速 度 為 20 cm/sec(27×3.1416×14/60),剪應力為 0.07 N/m2,分別進行五種有機物 (sodium acetate、sodium benzoate、propionaldehyde、parahydroxybenzoic 與 ethanol),並比較水相及墊片上細菌數之差異性。實驗結果顯示,水 相及墊片之菌數(以 HPC 表之)均符合微生物對數生長之模式,且有兩 相微生物之成長速率(growth rate)受有機物含量影響甚大,亦即有機物 含量高,微生物之成長速率愈大,且達到最大成長速率所需之時間與 有機碳含量之增加而減少,且本研究亦證實水相微生物之增加主要受 附著於墊片微生物脫落之影響,且並非來自水相微生物成長所致。

(23)

野 生 型 (wild-type) 之 Pseudomonas aeruginosa (PAO1) 及 突 變 種 PA01-JP1 於層流(laminar)及紊流(turbulent)之成長型態,Purevdorj et al.

(2002)曾以影響結構分析軟體(Image Structure Analyzer software )進行 外觀結構比較,其結果說明:

(1) 在層流時,24 小時內培養期間,PAO1 及 PAO1-JP1 之生物膜僅包 含少數的細菌,但在第 3 天時,兩種菌種則可見圓形菌落群的形成 之生物膜,其厚度初步估計約15μm,其表面覆蓋率達 100%。而至 第 6 天時 PAO1 及 PAO1-JP1 之生物膜厚度,分別為 17.5

0.7μm 與 19.6

7.7μm,表面覆蓋率前者降至 87.3

12.7%而後者仍維持 100

%,且生物膜之形狀以板型結構為主(ripple-like)。

(2) 在紊流(turbulent)時,第 6 天 PAO1 及 PAO1-JP1 之生物膜之覆蓋率 分別是 82.1

3.4%及 72.2

1.4%,然其厚度前者為 27.2

2.6 μm,

後者則是 21.7

15.8 μm,然就形狀而言,兩種菌主要以流線型 (streamlined)及細絲狀(filamentous)之外觀。

Melo and Vieira (1999)比較兩種水流速度 0.35 及 0.62 m/s 在相同基 質濃度下,生物膜厚度之差異,發現前者為 1.09 mm 後者則是 0.46 mm,且乾密度(densdy)分別為 14 與 28 kg/m3,高流速者乾密度愈高,

此表示生物膜對生物表面接觸之黏著力(cohesiveness)愈佳。

李氏 (2000)表示配水管網中水流速,亦會改變管網中消毒效果 中,餘氯量的變化,易造成再生長現象,導致自來水二次污染,如管 壁中的孔穴與管徑交會處,二者之間所產生的分離流薄膜處,此處會 降低餘氯的濃度,研究結果發現,生物膜在 40 小時至一星期內即可形 成。吳氏(2003)亦提出,雖然水力條件中之水流速度是影響生物膜形成 的因素之ㄧ,因高速所造成的高減應力,雖會阻斷高密度且濃厚的表 面生物膜,但生物膜即會於低流速的管壁生成。

(24)

2.管材

在飲用水的傳輸系統中,由於受限鋪設位置地形及特殊需求,故 配 水 管 網 之 管 線 材 質 具 有 多 樣 性 的 變 化 , 包 括 橡 膠 (rubber) 、 矽 (silicon)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PCV) 、聚乙烯(polyethylene, PE) 以及瀝青無煙煤材料(bituminous coatings)。Block et al. (1991)即利用四 種材質作為比較的對象,觀察三種生物膜材質對微生物附著形成生物 膜量多寡的比較,依序為鑄鐵材質(cast iron)、水泥材質(cenent)最後則 是不鏽鋼材質(stainless steel)。

Camper et al. (2003)研究中,並利用水體性質的差異性與不同生物 膜片材質,二種物化性質做為探討的對象,其利用 ARs (Annular reactor system)及四種不同材質之生物膜片,包含 Epoxy(環氧化物質)、PVC、

Cement(水泥膠結材料) and Iron(鑄鐵材料),其中碳源控制在 0.5~2.0 mg-C/L,在未添加消毒劑狀態下,生物膜之生長情況以 Iron(4.99 log- CFU /mL)較 Epoxy 及 PVC 為佳,但與 Cement(4.90 log-CFU/mL)無顯 著的差異性。Hallam et a. (2001)以 Seven Trent 水公司之配水系統進行 比較玻璃、混凝土、MDPE 與 PVC 四種材質,在餘氯控制小於 0.3 mg/L as Cl2,TOC 控制在 1.5~3.9 mg-C/L 時,生物膜之形成潛能 ATP(pg/cm2) 比較發現,PVC (509 pg-ATP/cm2)>MDPE (302 pg-ATP/cm2)> cement (212 pg-ATP/cm2)>glass(136 pg-ATP/cm2)。而 Percival et al. (1998)以 12 個月時間進行 2 種鋼材(304 及 316)建築物之配水系統形成生物膜之 比較,其研究發現在 304 之鋼材之細菌數為 2.8×103 CFU/cm2,而 306 鋼材則為 3.6×102 CFU/cm2且兩者之數量均較培養 4 個月及 8 個月之細 菌數為高。

Niquette et al. (2000)以 PVC、PE、cement steel、asbestos-cement、

cemented cast iron、tarred steel 及 gray iron 等 7 種材質置於不同水源(地 下水及地表水)其中 DOC 濃度控制在 0.8~1.2 mg/L,餘氯量控制 0~0.13 mg Cl2/L 結果發現塑膠材質(PE 及 PVC)其生物膜量最低,gray iron 較塑膠材質之生物膜量高於 10~45 倍,cement 材質之生物膜量屬中等,

而 cement 與 PVC 表面之生物膜量,在 15 個不同的採樣位置,顯示兩

(25)

者有明顯的相關性,而前者高於後者約 2.6 倍。Zacheus et al. (2000)以 有無臭氧之地下水,進行 PVC、PE、及 stainless steel,以總細菌數(total bacterial count)進行生物膜量之計數,發現,三者間無明顯的相關性,

而比較各研究單位之結果,有明顯的不同,此與研究者間水質、培養 系統及分析方法差異有關。

(二)化學參數

Lu and Chu (2005)利用兩種劑量之醋酸濃度(acetic acid 10 and 50 μg acetate eq-C L-1),探討水中之生物可分解性有機碳,對於添加不等 醋酸劑量後,是否對於管網系統中,飲用水內異營菌的再生長情形。

其作法利用連續式配水管線設備(Diagram of the loop system),內部以不 鏽鋼材質(stainless steel)作為生物膜片(表面積 20 cm2),將系統之流量控 制 1.9 L/min 相較於管線內部之水流速度 10 cm/sec,停留時間為 12 mins,以平板計數作為總菌數分析。其利用 10 與 30 μg acetate eq-C/mL 觀察管線生物膜生成之影響,結果顯示所有醋酸均可有效被分解並導 致管線生物膜量有增加之現象,且空白組、10 與 50 μg acetate eq-C/mL 之操作條件下,生物膜量以 HPC 計分別為 3.5×104、8.9×105與 2.9×107 CFU/cm2,然而水相之菌數則分別為 1.2×103、5×103、6.8×104 CFU/mL,

此表示醋酸鈉為管線微生物易利用之有機物。

Liu et al. (2002) 以大陸北方數個實廠之配水系統進行水中 AOC (assimilable organic carbon) 分析,發現 96 %之樣本均高於 100μg/L,甚 至 50%之樣本高於 200 μg/L,而管線內壁以 SEM (Scanning Electron Microscope) 進行觀測時,發現表面並非光滑,裂縫均有微生物滋生之 現象,故管線中 AOC 值之降低,與生物膜之存在相關。Boualam et al.

(2003) 以法國 Nancy 配水系統之清水 (餘氯小於 0.01 mg/L) 、暴雨經 過0.2 μm 濾膜過濾後之濾液及浮除藻類之濾液,植入原生菌與 10 種大 腸菌進行培養,其中有機碳量控制在 1.6-1.8 mg/L,結果飲用水植入之 細菌,2 天後即失去活性,然而藻液及暴雨之濾液,經過培養 28 天後,

細菌仍保有活性,此顯示不同有機物來源對細菌生存具有某種程度的 影響,且亦發現三種水源之生物可分解性有機碳佔總 DOC 之量,藻液

(26)

32 %、 河水 20 %,而飲用水僅有 6 %。Block et al. (1993) 建議水處 理廠將生物可分解之有機物去除後,可限制細菌在管線之再生長;

Servais et al. (1991) 指出將 BODC 值控制在小於 0.016 mg/L,配水管網 系統之水質則具有高生物穩定性。

Van der Kooij (1985,1992)亦提出自來水中在低劑量之餘氯下若限 制生物可利用碳(AOC)低於 10~15 µg/L,可有效控制配水管網之再生 長;HPC(Heterotrophic plate count)與 AOC 濃度二者互有相當的關連 性,當可利用營養源之 AOC 濃度控制在< 10μg-C/L,即可控制 HPC 菌 的成長。Chandy and Angles (2001)建立三種不同營養來源於環型反應器 中,觀察在限制低營養源,或有機無機營養物質時,對生物膜生成速 率的研究,以及探討加氯是否可抑制生物膜的形成,作法亦利用人工 配製營養物(Acetate-C 及 Phosphate-P),作為補充水之營養源,第一個 反應槽僅供給一般飲用水(RT1),第二個反應槽,添加醋酸鈉(0.50 mg/L) 和磷酸鉀(0.03 mg/L)並補充飲用水,第三個僅以磷酸鉀(0.03 mg/L)補充 飲 用 水 (RT3) , 作 法 取 上 述 人 工 配 製 液 , 進 流 速 控 制 3 mL/min (Hydraulic residence time, HRT=4.3h),並模擬直徑 150 mm 管徑中水流 速度 0.35m/sec,聚碳酸酯材質(PC)生物膜片,系統持續運轉 59 天,並 以第 14、30、45 及 59 天採樣分析生物膜之蛋白質及碳水化合物 (carbohydrate),由此可得知在微生物對於有機或無機營養源中,何者較 能有效控制生物之穩定性。

結果顯示,在第二個反應槽之環型反應器中(0.50 mg/L醋酸鈉和 0.0.3mg/L磷酸鉀補充飲用水),對於分析參數中,總蛋白質與碳水化合 物(total protein + carbohydrate total μg cm-2 )、氯氨衰退情況(Chloramine decay coefficient)、總有機碳消耗速率(Total organic carbon consumption rate -mg/L -hr)、總菌數(total cell counts)呈現結果,較其他二者來的顯 著。

(27)

(三)消毒劑

一般而言,水處理場最常見到的消毒方法即為加氯消毒,而常見 最基本的消毒種類有氯(Cholrine)、氯氨(Chloramines)、氧化氯(Chlorine dioxide)及臭氧(Ozone),而其他方法有碘(Bromine)、溴(Bromine)、高 錳酸鹽類(Permanganate)、過氧化氫(Hydrogen peroxide)、銀及銅離子 (Silver/ Copper)、紫外光 UV(Ultraviolet light)、以及銅銀離子等(Percival et al., 2000)。

Chen and Stewart (2000),即使用 ARs 培養穩定的生物膜量,並在 微生物生長之穩定期間,添加化學物質(Salts、 Surfactants、enzymes and Lysozyme)去除生物膜質量,其作法利用人工配製營養物,提供微生物 所需營養源,主要配方以 glucose - 40 mg/L、14.4 mg/L of NH4Cl、4.0 mg/L MgSO4_7H2O、382 mg/L of Na2HPO4、408 mg/ L of KH2PO4,初 始植菌數 1.0×108 cell/mL 以 P. aeruginosa and K. pneumoniae 兩株菌植 入系統,進流量控制 31 mL/min、轉速 100 min-1、聚碳酸酯(PC)生物膜 片材質,運轉 8~9 天時穩定時,再添加化學理劑,觀察出流水及生物 膜中二株菌量蛋白質量的變化,結果顯示微生物生長之穩定期與處理 後之去除率達 90%。

而(Chandy&Angles, 2001)指出加氯通常被廣泛應用於配水管網 中,抑制細菌的再生長作用,Siyuan et al., (2005)亦提出使用高劑量的 氯做消毒劑,即使水體中存在相當的可利用之營養物質,亦可抑制微 生物之再生長。並且淨水廠之消毒加氯程序,並未能有效控制微生物 的再生長,然而存在於管網中的微生物來源主要以原水所提供,其他 細菌、藻類、真菌、酵母菌及原生動物則主要存在於自來水中(郭氏, 2001)。Bitton (1994)及謝氏(2000)即針對飲用水之常見消毒劑種類,對 水中消毒優缺點之比較。

(28)

表 4 不同消毒劑應用於水中滅菌之優缺點比較 (Bitton , 1994; 謝氏, 2000)

種類 優點 缺點

1、效果佳且已被廣泛用。

2、應用面廣。

3、費用便宜。

4、可同時適用為主要與輔助的消 毒劑。

1、產生有害的消毒副產物。

2、做為輔助消毒劑時,其操作條件 和防止管材腐蝕而控制 pH 值互 相衝突。

二氧化氯

1、效果佳。

2、相對費用低。

3、通常不會產生 THMs。

1、會產生若干有害的副產物。

2、USEPA 之推薦劑量太低不具殺 菌力。

3、必須在現場製造。

氯胺

1、對細菌具輕度的去除效果且能 夠維持較長的殺菌力。

2、通常不會產生 THMs。

1、會產生若干有害的副產物。

2、對進行腎透析的患者具有毒性。

3、僅被推薦為輔助消毒劑。

臭氧

1、消毒效果佳。

2、最少的有害消毒副產物。

3、增加慢砂濾及 GAC 濾器的效果。

4、同時進行氧化及消化的功能。

1、需要輔助消毒劑。

2、相對費用較高。

3、因臭氧需在現場製造故需較複雜 的操作技術。

紫外光

1、對細菌及病毒的去除效果極佳 且反應較高。

2、不會產生有害的副產物。

3、操作及維護簡單。

1、不用於含有 Giardia Cyst、高懸浮 固體量、高色度、高濁度及溶解 性有機物之水。

2、需要輔助消毒劑。

Ven der Wende et al. (1989)曾利用二種不同的加氯劑量,分別取 0.8 及 0.2 mg/L,探討對生物膜及水相中浮游菌的控制成效,實驗結果發現,

系統中控制在低氯量 0.2 mg/L 時,對生物膜及水相中浮游菌成長的變化,

並無減少的顯著性,而在高劑量的範圍之下(0.8 mg/L),短時間之內即可 有效的控制微生物的繁殖生長。

(29)

Huang et al. (1995) 研究中,以添加 2 mg/L 氯氨(monochloramine) 於運轉培養 7~10 天之穩定的 ARs (Annular reactor system)生物膜系統 中,經由螢光染色後所呈現的色澤反應,觀察 Klebsiella pneumoniae (Kp1)、 Pseudomonas aeruginosa (ERC1) 二株菌附著於不鏽鋼材質 (stainless steel slides)之生物膜片,判斷添加消毒劑後兩小時內菌相的活 性狀況,結果顯示在加氯前之初始值總菌數為 9.13±0.15 log,Kp1 為 8.94±0.23 log 而 ERC1 為 8.22±0.05 log,兩小時後菌數的變化量分別為 0.3 log、1.3 log 及 1.1 log,發現在 120 分鐘之內,培養後的菌量總共被 削減了 1.3 log。

謝氏 (2000)利用自來水樣比較不同加氯劑量對不鏽鋼材質之生物 膜成長的影響,加氯劑量分別控制 1.28~1.47 mg/L,及 0.32~0.48 mg/L,

而細菌之變化,以平板計數、ATP 、大腸菌等方式表示,試驗結果發 現在不加氯的試程中,總菌落數為 8.7×105 CFU/cm2,ATP 即 325.2 pg ATP /cm2-day , 而 水 中 持 續 保 有 低 氯 量 的 試 程 ATP 為 159 ATP pg/cm2-day,高氯量時則 118.4 pg ATP /cm2-day;在大腸桿菌方面,加 氯試程並無明顯的控制效果。顯示出,不同消毒劑量,對於生物膜消 長的變化有顯著的之影響,但消毒程序對特定的菌種並無明顯的抑制 作用,可能對於長時間保有餘氯的環境之下,細菌自然對於消毒作用 的適應作用逐漸增大,導致高或低氯量之試程中,大腸菌仍持續繁殖。

(30)

參、研究流程實驗設備與分析方法

一、研究流程架構

系統中,微生物形成之評估為一有效的工具,此應與該系統可採 動態化,包括變化水流速度與停留時間之操作相關。本研究,以澄清 湖原水,利用不同大小之分子濾膜分離水中有機物,並進行比較小於 5K 與大於 30K 兩種有機物在 ARs 系統水相與生物膜菌數分佈之差異,

其 中 微 生 物 之 計 量 , 以 DAPI(4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Sigma, ref. D9542)染劑進行染色,藉由螢光顯微鏡下與 計數軟體進行總細菌計數,另消毒劑對 ARs 系統之水相及生物膜細菌 活性之影響,則利用 DPAI 與 CTC(5-cyano-2,3-diolyl tetrazolium chloride) 染色技術,判別樣本中總細菌數與具有活性之細菌數,藉此瞭解,消 毒劑對水相與生物膜細菌活性之差異性,另掃描式電子顯微鏡亦做為 菌體表面破壞研究之工具。而整個研究架構如圖 3 所示,研究主題則 如分述如下:

(1) ARs 系統最佳操作條件,主要探討環型反應器內之轉速(rpm)或進流 量(mL/min),對於附著於墊片上生物膜生量的影響。

(2) 不同分子量有機物性質之生物可分解性之差異,對 ARs 系統中水相 及生物膜細菌所利用之有機物。

(3) 消毒劑對 ARs 中水相及生物膜之細菌分布之影響,及菌相之死活判 別。

期間本研究中對於細菌計數,主要參考 Saby et al. (1997)之方法,

藉 由 DAPI 染 劑 與 細 菌 之 DNA 結 合 反 應 , 並 配 合 螢 光 顯 微 鏡 (Epoflorescent Microscopes E400, Nikon, Japan) 經由特定濾光鏡片進行 總細菌數之計算;另樣本之活菌計數則採 Cappelier et al. (1997)之研究 方式,其利用具有呼吸特性之細菌結合,可與 CTC 於細胞內形成 CTC-formazan 之結晶,並藉由螢光顯微鏡觀測計數。

(31)

圖 3 研究架構流程圖 文獻閱讀

分析問題

研究方向

消毒對 ARs 系統水相及生物膜菌數分佈之影響

分析方法確立

分析系統架設、BDOC column

有機物性質 ATP 測定 菌相死活判別 SEM 觀測

 操作參數對 ARs 生物膜穩定之影響

 以 ARs 生物膜菌相代謝有機物之分析

 ARs 系統之滅菌效果評估

(32)

P

2 5 2

恆溫水槽 5

Slide Removal Port

Reactor Slides (Polycarbonate)

進流水樣 轉速馬達

Mode 1120 Annular Reactor System, ARs

Inner Drum (Polycarbonate)

二、環型反應器

環型反應器(Mode 1120 Biofurface, USA),其內容包含反應器底 座、轉子、生物膜片、內外圍玻璃,以及用來連接轉子的轉速馬達,

整組系統的材質,以聚碳酸酯(Polycarbonate)和不鏽鋼及玻璃組合而 成,其主要功能是利用轉速馬達(1120 Motor Controller),連接內部轉 子,配套馬達的轉速(rpm)並對照 ARs 系統手冊末頁對照表,調整轉速 馬達 RPM 位置,可成功模擬配水系統中不同直徑(Inch)的管材之流水 速率,轉子上的可拆裝的生物膜片(Slide)共有二十組膜片,用來提供水 中微生物附著的生物膜片,每組附著生物膜片的表面積為 18.75 cm2, 膜片材質可依配水系統中輸送水道的管材而定。

ARs 系統本體運轉,利用水樣之進出流,提供生物膜片上微生物 的 附 著 來 源 , 進 出 流 量 的 方 法 是 利 用 數 位 可 調 式 流 量 蠕 動 幫 浦 (Economy drive _A-07524- 40 ),經由已備妥之血清瓶(2L)作為循環水之 水源處,連接蠕動管直接進入 ARs 系統,再由系統中底部作為出流水 口處,並由出流水處與水源處做一循環的動作,即為模擬配水系統中 進出流水的行程,此時系統運轉時內部水樣之容積約為 880 mL。

圖 4 環型反應器(Annular Reactor system, ARs)系統圖

P

動幫浦

(33)

(一)系統本體組裝

ARs 系統內含轉子、生物膜片、內外圍玻璃以及底座,系統架設 之前,必須進行滅菌的動作,組裝過程,首先必須將生物膜片安裝於 轉子,全部共有二十組,並將此部分安置在底座上方,轉子與底座之 間以不鏽鋼滾珠銜接,之後並分別將內外圍玻璃安裝於底座之內外圍 O-Ring 的上方,以防止水樣滲出,之後並將上部裝置套住系統,鎖住 螺絲本體,即此安裝部分已逐步完成。

1.系統進流量與轉速控制

ARs 系統之進轉速、流量與控制,主要是利用轉速馬達連接內部 聚碳酸酯(Polycarbonate)材質所製成的圓柱體轉子,配合轉速馬達,以 轉動的方式模擬配水管網內,不同直徑管線之流水速度所造成的剪應 力,模擬配水系統中的流速,本實驗之設計,選定以三種轉速,分別 是 50、134、185 rpm,主要為模擬直徑為 100 mm 的管線,其流速為 36.698.0135.6 cm/sec。而 ARs 系統中進流水量,是利用數位可調 式流量蠕動幫浦(Economy drive _A-07524- 40 ),連接蠕動管後,並經 由已配製之有機物當做營養源之供給處,直接進入 ARs 系統進行培養 運轉,出流水處於系統中底部,進入水源處做一循環的動作,即為模 擬配水系統中進出流水的行程。其為模擬水體處於配水管網中,停留 時間的長短,在此以三種流量模擬管網中的停留時間的長短,流量與 ARs 所模擬之水力停留時間分別為 4.0、9.0、20.0 mL/min;3.61.6、

0.3 hr。

(二)生物膜片之材質選定

在 ARs 裡,轉子上可拆裝的墊片(Slide),主要為提供水體中微生 物附著的部份,主要的功能,即為模擬管網中管壁的材質,因此墊片 材質可依配水系統中輸送水道的管材而設定,在本實驗設計主要以聚 碳酸酯(Polycarbonate)、聚氯乙烯(PVC)、不鏽鋼(Stainless Steel)及混凝 土(Concrete)四種材質,作為比較的對象,在此以 ARs 系統為主體的墊 片,其提供微生物膜形成的表面積約 18 cm2

(34)

三、參數分析 (一)水質參數分析 1.pH 與導電度

欲進行實驗時,因本實驗性質主要以澄清湖原水之有機物質,提 供微生利用,以模擬管線生物膜的消長情況,故原水之基本性質必須 符合或適於微生物之生長要件,以免限制微生物的生長環境因子。故 在進行實驗前,水樣採集前,必注意當日或近期內天氣變化情況,以 免造成樣品本身是否具相當有效之代表性原則。pH 與導電度值之測 定 , 本 實 驗 所 使 用 玻 璃 電 極 (glass electrode) , 及 含 有 導 電 度 電 池 (conductivity cell),並可測得水樣之溫度,具有三種可現場分析功能之 測定儀(HI 98129, HANNA, USA)(附錄 1、2)。

(二)溶解性有機碳

本實驗主要以總有機分析儀測定分析有機物含碳量,樣品測定之 前,必須以 KHP (C8H5KO4)配製成有機碳(Organic Carbon, OC)儲備溶 液,再以有機碳儲備溶液配製成ㄧ系列的檢量線濃度,製作完成檢量 線方可進行樣本分析(附錄 3)。

原水之採樣後,便立即以過濾方式去除水中的雜質,其步驟首先 以 934-AH 濾紙先行以 2.0 µm 之孔徑初濾,之後並分別以 0.45 及 0.20 µm (cellulose acetate, MFS, USA )細濾後,便立刻將樣本以超純氮氣加 以曝氣,直至 5~10 分鐘後,即可將水樣以人工方式放入 TOC 測定儀 (Multi N/C 3000, Analytik Jena AG, Germany)之吸取位置,水樣並經由吸 取器,注入裝填有高感度觸媒(Cerium Oxide, Merck, Germany)之高溫爐 中,在 850℃下與氧氣反應生成 CO2,並藉載流氣體攜帶 CO2 流經無 機碳反應器及除濕、降溫與乾燥,最後 CO2 送至非分散紅外線吸收偵 檢器(Non-dispersive Infrared Absorption Detector)中並配合由一系列適 當濃度之總碳(Total Carbon, TC)標準溶液所得之檢量線,而測定出水樣 之 TC 量,及為 NPDOC 值(mg/L)。

(35)

(三)螢光激發與發射光譜圖

本實驗進行之初,僅以澄清湖原水,做為培養生物膜之有機物的 碳來源,探討原水中有機物之性質,是否可足夠供給系統中,微生物 的利用,而往後之延續性探討不同性質有機物中,對於生物易分解性 之營養源,做更進一步之定性分析工作。

本研究利用螢光光譜儀(F-4500, Hitach, Japan)三度位向測量 EEFM(excitation emission Fluorescence Matrix)之功能特性,進行水 樣之螢光分析,偵測樣本進行螢光光譜分析時,其所產生波峰則為溶 解性有機物質之螢光波峰,該設備光源採用氙燈作為光源,功率為 150 W,偵測器為光電倍增管,其功能除了傳統單一波長掃描外,並具有 三度位向測量 EEFM(excitation emission Fluorescence Matrix)之功能,

藉此功能可將激發及發射波長分別繪製於 X 及 Y 軸上,並將螢光強度 顯示於 Z 軸,依光柵寬度設定,產生數百至數千筆之數據資料,儀器 附屬分析 FL Solutions 軟體進行 3-D 圖譜之繪製,爾後將其數據轉成 EXCEL.csv 檔後,使用本研究室請專人設計之數據整理軟體後另存成 EXCEL.csv 之檔案,使其讀入 SURFER 後可繪製出與 FL Solutions 軟 體相同的圖譜,最後將利用 SURFER 軟體將螢光圖譜呈現出來,但使 用 FL Solutions 軟體作為 EX/EM(excitation/emission)判讀效率較佳,

故繪圖與圖譜之判讀是採分開作業之方式。

進行水樣之螢光分析時,設定激發發射波長之全譜 3-D 掃描,使 用前將實驗室之超純水置於一公分之石英比色管中(四面透明),並置 入樣品槽掃描,作為空白 3-D 掃描,隨後約取八分滿之水樣於一公分 之石英比色管(四面透明)中,進行樣本 3-D 掃描,掃描後利用螢光 圖譜分析軟體本身的功能,將水樣圖譜與空白圖譜相減後,即可得到 樣本真實之螢光圖譜。螢光光譜儀(F-4500, HITACHI, Japan)之操作條 件,如表 5。

(36)

表 5 螢光光譜儀(F-4500, HITACHI, Japan)之操作條件 儀器名稱 HITACHI-Fluorescence

Spectrophotometer, Model F-4500

光源 氙燈

數據模式 Fluorescence

掃描種類 3-D Scan

EX ( nm )掃描範圍 200~800 EM ( nm )掃描範圍 200~800

光柵( nm ) 10

掃描速度( nm/min ) 30000

PMT Voltage(V) 700

(四)餘氯

淨水廠中最常見的消毒方法,即使用加氯的方式,而應符合法規 限制及對水中有機物造成其它消毒副產物問題下,在低氯量的情況之 下,並未能有效控制管網中微生物的再生長,故本實驗亦探討加氯處 理後,分布於系統內部或生物膜片上之菌相消長情況及細菌死活的判 斷。在此實驗中所選定之消毒劑以次氯酸鈉(NaOCl)及二氧化氯(ClO2) 為主,氯測定標定之方法,主要參考美國水及廢水之標準測定方法 (Standard Methods 4500-ClO2 B.Iodometric Method)標定氯離子濃 度 (ClO2/L),作法取 100 mL 去離子水並植入 5 μL 二氧化氯,並加入 0.5 mL 醋酸,使水樣之 pH 值控制在 3~4 之間,上述步驟完成之後,並取約 0.5g 之碘化鉀(KI)加入水樣中,持續以磁石攪拌 5 分鐘後,直至水樣呈 現褐色時,利用 0.025 N 之硫代硫酸鈉(Na2S2O3)滴定至淺黃色,並加入 數滴澱粉指示劑使水樣呈深藍色,持續將水樣完成至滴定終點,並紀 錄滴定體積,此實驗方法中亦分析其空白實驗組,以計算其氯離子濃 度(附錄 4)。

(37)

(五)有機物分子量之分離與濃縮

因自然界中,用以提供微生物成長的要件有碳、氮、以及磷,然 而一般最佳比值為 100:10:1,而本實驗水樣來自於澄清湖中的原水,

模擬配水管網中的異營菌的生成(Chandy&Angles, 2001 ),因此必須考 量存在於水中可被微生物分解的機質。在此並以水中溶解性有機碳作 為提供微生物分解的營養機質,且實驗設計並以不同濃度的溶解性有 機碳(DOC)分別是 1、2,4 mg-C/L,配合 UF 膜分離裝置(Amicon 8400.Millipor,USA),以及分子濾膜 5 K、10K,及 30 K,以高壓力的氮 氣連接分子膜分離裝置,分離出不同分子量中不同的溶解性有機碳濃 度的水樣。

水樣來源主要以高雄澄清湖之原水作為水樣,採樣後立即測定水 樣中 DOC 的含量,以確保水樣中有足夠的機質提供生物膜的成長,若 水樣中有機物質濃度過低時,可利用減壓濃縮機(Heidolph Caborota 4000, Germany)濃縮水樣,提高水中溶解性有機碳量的濃度,並依實驗 試程條件以調整不同的 DOC 濃度,分別為 1、2 及 4 mg-DOC/L,作為 比較的對象,如此可判斷在短期之內,水中有機質濃度的高低,是否 影響 ARs 中生物膜形成的速率。

有機物之分離,主要使用 UF 膜分離裝置,其分離原理是通入高 壓氮氣,並藉由過濾時薄膜之分子量孔徑大小進行分離。分離裝置配 件包括:氣體通入管、上蓋(含壓力管及洩壓閥)、壓克力水樣容器、

壓力套、薄膜載器、攪拌器等器材所組成(如圖 5)。

有機物分離的作法,取不同分子量大小(5K、10K、30K)的分子濾 膜(Millpore, Corporation, Bedford, MA 01730, USA ),使用之前新濾膜先 置於 500 mL 燒杯,加入適量的蒸餾水,取出 UF 膜後,並將濾膜之光 滑面朝下平放,浸置於蒸餾水中 60 分鐘,並更換三次洗滌液。分離水 樣時,將濾膜之光滑面朝上並置入分離裝置(Ultrafiltration Cell )中,加 入蒸餾水並施以 55 psi 氮氣壓力進行至少五分鐘之加壓過濾,以去除 新濾膜內所含之甘油與疊氮化鈉。

(38)

N N

2 2

g g a a s s

Mix i n g

R o t o r

Filtrate B

C D A

E

F

圖 5 不同分子量有機物分離裝置 (Amicon 8400Millipore , USA)

(A=高純氮鋼瓶; B=轉速調節鈕; C=濾膜; D=水樣; E=洩壓閥; F=濾液) 濾膜之保養與冰存,使用完後之濾膜,其保存方法,主要先將濾 完後之濾膜,浸置於 0.1N-NaOH 中,並加入適量的次氯酸鈉(NaOCl),

30 分鐘後,取出濾膜並以去離子水沖洗且可重複使用,而使用之前必 須在分離裝置內部,以蒸餾水先行加壓過濾後,即可開始分離水樣。

而保存方法,濾膜清洗過後,使用 10 % 乙醇冷藏(4℃)保存即可。

(六)生物性參數 1.生物膜採集方法

生物膜的取出方法,一般較為常見的有超音波震盪法、無菌刮刀 刮除法、棉花擦拭法(SWAB)。超音波震盪法,取出墊片後放置於 100 mL 量桶內並添加無菌水,置入超音波震盪器(5510 ,BRANSON, Taiwan),

調整 47 kHz 以 20 °C 兩分鐘的條件之下,可將生物膜片上的細菌介由 無菌水及超音波震盪將細菌震盪取出,但此法容易導致細胞破裂,造 成本計數方法的誤差。另一種方法即為無菌刮刀,如滅菌後鐵氟龍刮 刀或手術用刀,刮除附著於墊片上的生物膜,此法較不適於使用,因 生物膜反應器中的生物膜片材質是以聚碳酸酯(Polycarbonate-PC)所製 成,如利用此法,刮除的過程會直接破壞其表面的結構。棉花擦拭法 (SWAB) , 以 一 般 脫 酯 棉 花 棒 , 經 過 高 溫 高 壓 滅 菌 釜 (Speed

Mixing Rotor

(39)

脫酯棉花棒,擦拭生物膜片,並將膜片上細菌擦拭於已備妥且裝有無 菌稀釋水的試管,連同脫酯棉與試管同置於均質器(Vortex)上,均勻的 將棉花上的細菌,以離心的方式將細菌均勻的取出於試管中。

本實驗中生物膜採集方式,主要參考 Gagnon and Slawson (1999) 方法,為了避免破壞微生物本體及墊片表面材質,故本實驗主要以棉 花擦拭法(SWAB)為主,其以脫脂棉所製成,主要材料配置,試管,無 菌稀釋水、Vortex 震盪離心機以及無菌操作台。無菌稀釋水的配製,

以磷酸二氫鉀溶液以及氯化鎂溶液配製而成,磷酸二氫鉀溶液取 3.4 g 磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶於 50 mL 的蒸餾水中,並以 1.0 M NaOH 溶液 調整其 pH 值為 7.2±0.5,然後加蒸餾水至全量為 100 mL,儲存於冰箱 中作為儲存液備用。氯化鎂溶液取 8.1 g 氯化鎂(MgCl2‧6H2O)先溶於 蒸餾水,完全溶解過後,再以蒸餾水定量到 100 mL,保存於冰箱中作 為儲存液備用。無菌稀釋水之配方,分別取 10 mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀溶液,再加入蒸餾水至全量為 2000 mL,混搖均勻 後,分裝於稀釋瓶中,經 121℃滅菌 15 分鐘,作為無菌稀釋液備用。

而樣本採集前,必須先利用無菌試管添加 10 mL 之無菌稀釋水,

並經由高溫高壓滅菌,冷卻後冰存。SWAB 必須先行以高溫高壓滅菌 釜進行滅菌,滅菌完成後並置於無菌操作台內,再利用 UV 光滅菌乾 燥,此後直接把 ARs 內之生物膜片取出,並以 SWAB 在墊片上擦拭 5~10 次,將墊片上所附著之微生物擦拭於試管中內部之無菌稀釋水,並利 用 Vortex 離心的效果,將微生物均勻的取出,最後再將 SWAB 擠壓於 試管的管壁,將菌液完全取出即可待測分析。

(40)

2.細菌之計數

以往總生菌數之計數是以平板技術法為主,塗抹在已配製好之營 養培養基上,提供微生物生長,因此法在本實驗進行中,過程較為繁 雜 且重複性 較差, 故本實驗 以 DAPI (4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Sigma, ref. D9542)染色劑,針對 ARs 培養後之水相,及 生物膜採集後之微生物,藉其與微生物中之 DNA 鍵結產生具有螢光特 性之機制,推算樣本之總菌落數(Kepner and Pratt, 1994)。其作法(Saby et al., 1997),用利用水或者 Mcllvain’s pH 4 緩衝液稀釋至工作濃度為 10 μg/L,並取 1mL 之 DAPI 工作液於無菌培養皿中,並取適當水樣以黑 色的碳酸纖維膜過濾(DMF, ref. 111156, 孔徑 0.2 μm),濾後取濾膜覆蓋 於已備妥之無菌培養皿內部 DAPI 染劑上,靜置培養 5~10 分鐘,使染 劑迅速進入細胞體之 DNA,並與 DNA 鍵結產生螢光的效果,之後並 取 出 濾 膜 至 於 載 玻 片 上 , 再 配 合 螢 光 光 學 顯 微 鏡 (Fluorescence Microscope) (E-400, Nikon, Japan),以濾光片(UV-2A, Nicon, Japan)觀察 螢光呈色反應,並透過 CCD 影像擷取器 (Evolution VF colled color, MediaCybernetics, USA)擷取目鏡視野中影像,利用處理軟體(Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA)來計算細菌數,因此在活體及已破 裂死亡的菌體,均可以此方法作為計數方法。

計數公式:

cells=CCD 擷取視野之總菌落數

162×121(μm)=CCD 擷取視野之面積(μm2)

9.6×108=樣本之過濾有效面積(μm2) X=過濾樣本菌液之體積

cells/mL=單位體積之總菌數

mL cells mL

X m m cells

/ 10

6 . ) 9 ( 121 162

8 2

2

 

 

  

 

(41)

除總菌數分析之外,在本研究中,亦有探討加氯效果對菌相活性 之比較,而 DAPI 目前僅供計數總菌的功能,非能更進ㄧ步對於細胞體 的死活做比較,如此經由消毒劑處裡後之樣本中,無法立即分析判別 微生物之存活與凋亡,故除以 DAPI 進行計數總菌之外,本實驗以 CTC (5-cyano-2,3-diolyl tetrazolium chloride) [Polysencieses, Inc. Germany ],

(進行檢測具有呼吸活性的細菌,該試劑可與具活性的細胞體結合 (Cappelier et al., 1997)。其作法即取 100 μL 之 50 mM 之 CTC 染劑,添 加於 1.0 mL 水樣中,並持續以 200 rpm 於離心機中,運轉 60 分鐘後,

亦使用黑色的 0.2 μm 碳酸纖維膜過濾,並取得濾膜之後,以濾光片 (G-2A, Nicon, Japan)藍色光源下,配合顯微鏡的操作之下,觀察樣本中 菌相的死活情況。

本法利用螢光染色劑,及螢光顯微鏡的操作之下,DAPI 所呈現的 菌數為總聚落數,鏡檢之下呈現藍綠色;而 CTC 僅針對具有呼吸作用 的微生物,其反應後所呈現的光澤為紅色。(圖 6)

圖 6 DAPI 與 CTC 染色後之菌相之外觀變化(A 總菌; B 活菌)

A B

(42)

3.電子顯微鏡之觀測

利 用 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (S-2500 Scanning Electron Microscope, Hitachi, Japen)觀測細菌外觀的變化,其主要前處理方法:取適量藻液 以0.2 μm 之 Nylon 濾紙(Nylon membrane filters, whatman,England)進 行過濾,並將濾紙剪裁四等份,將過濾面朝內側,將兩面濾紙朝內側 方,並以銅鐶將濾紙夾緊,將夾緊後的銅鐶放入磷酸緩衝溶液中 ( pH=7.0)浸泡 10-15 分鐘,進行表面清洗,再放入 2.5 % 戊二醇 (Glutaldehyde Solution, Merck, Germany)固定液中,置於 4℃冰箱 12-16 小時進行固定之動作,固定完之菌相,再以磷酸緩衝溶液中( pH=7.0) 浸泡 10-15 分鐘進行清洗。並開始進行樣本之脫水程序,首先將酒精 (Ethanol absolute, Ferak Berlin GmbH, Germany)稀釋成 10、25、50、75、

90、95 %等不同濃度。取樣本浸入由低至高濃度之酒精,漸次遞增濃 度 10、25、50、75 %各浸泡一次,每次 10-15 分鐘,最後即以 90、95

%之酒精浸泡清洗一次,每次約 30 分鐘,最後以絕對酒精(酒精純度為 99.8 %)浸泡 3 次,每次 30 分鐘,完畢後將樣本置入乾燥器中保存。

掃描式電子顯微鏡其操作條件如表 6 所示:

表 6 掃描式電子顯微鏡之操作條件(S-2500, Hitachi, Japan)

項目 操作條件

解析力 1.5nm (15kV),5.0nm(1.0KV) 加速電壓 0.5kv to 30 kV (100V steps)

倍率 x 10 to x500,000

GUN 熱場效型 In-Lens Thermal

影像模式 SEI(二次電子影像)

BEI TOPO/COMP(背向電子影像) 樣品最大容許 150.0mm 直徑 X10mm 高

即時影像顯示 1280 x 1024 pixels

樣品台 Eccent ri c,X=70mm, Y=50mm , Z=3mm - 41mm , R=360°, T=-5-60°

(43)

4.BDOC(biodegradable organic carbon)測定

BDOC 的測定本法依林氏(2005)所建立的生物濾床管柱,本實驗設 計硼矽材質 (borosilicate)之層析管( ID = 60mm,h = 550mm,內部體積 為 1140 mL 及 ID = 50 mm,h = 360 mm,內部體積為 580 mL 等兩種層 析管尺寸),層析管其底部之支撐屬 PE (polyethylene)材質。層析管內則 以 2 mm 直徑之硼矽玻璃珠 (Beads clear 4508/01, 城國貿易, Taiwan)填 充,作為細菌生長之支撐材料。

測定方法,將水樣以 2 m (Nuclepore polycarbonate, Whatman, USA) 0.45m、0.2 m 之濾膜(Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA) 過濾,再添加適量之澄清湖之原生菌液混合於 2 公升水樣之收集瓶中,

將蠕動管(MASTERFLEX L/S16, Cole-Parmer Ins. Co., USA)延伸至液 面下,並以蠕動幫浦 (MASTERFLEX L/S, Cole-Parmer Ins. Co., USA) 以定速(2 mL/min)將水樣通入層析管中,並採向下重力流方式將水樣迴 流進入收集瓶中,於一段間隔時間取收集瓶之水樣進行 DOC 及總細菌 數之監測。而收集瓶與生物濾床則以黑色不透光之塑膠袋包藏,於暗 室下進行反應,如此可避免藻類之滋生。

5.ATP 測定

Greetham et al. (1995)以 ATP 試量測生物膜量之厚度,此法具有分 析 1 ng/L or 104 cell/mL 的靈敏度,之於 ATP 不同濃度計算,即藉由螢 光素、螢光試劑與不同 ATP 濃度,進行反應產生不同冷光強度值,將 此強度值與 ATP 濃度進行線性迴歸,以未知樣本與螢光試劑進行反應 產生之冷光強度後,則可藉由前述檢量線,換算出細菌之 ATP 量,其 反應方式為樣本加入螢光素後,啟發去氧核甘三磷酸(ATP),並進一步 分解成去氧核甘酸(AMP),AMP 並與氧化螢光素(Oxyluciferin)結合,產 生冷光。

Luciferin+Luciferase+ATP-Mg+2 (Luciferase+Luciferase-AMP)+Pyrophosphate

(Luciferin-Luciferase-AMP)-O

2 Oxyluciferin+Luciferase+CO2+AMP+Light

Figure

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