L2-N-3014 5`-GGCTTTGGTTTACTGGATTCTTTT-3`
5`-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3` 62℃
分鐘、52℃/1 分鐘、72℃/1 分鐘，最後再經 72℃/5 分鐘完成反應。將 PCR 增幅的產物，以 2% 的瓊脂電泳膠片進行電泳檢視。PCR 增幅出的產物送 至生技公司，利用自動定序儀 (ABI PRISMTM) 進行雙股定序。
1.序列之比對與排序
將 定 序 所 得 的 正 反 股 序 列 ， 利 用 GeneDoc 軟體進行序列校正，整合 成完整的正股序列。並使用 NCBI 網頁之 GenBank 中的 BLAST 功能進 行序列比對，再次確認生物小種。另外由 GenBank 下載，相關的 Q、B、
Ms 型 生 物 小 種 的 COI 序 列 ， 與 臺 灣 所 採 集 的 Q 型 生 物 小 種 COI 序 列，利用 Tsagkarakou et al. (2007) 建議使用的 Clustalx 1.81 軟體進行比 較分析。紫背草唇粉蝨 (Lipaleyrodes emiliae) COI 序列做為外群 (outgroup) (Hsieh et al., 2007)。
2.親緣關係樹之建立與信賴程度的統計檢驗
族群遺傳結構會受到突變 (mutation)、遺傳漂變 (genetic drift) 與選汰 (selection) 的作用而改變，並反映在分子的層次。族群內的遺傳變異度有 許 多 種 估 算 方 式 ， 如 基 因 多 樣 性 (gene diversity) 、 異 型 合 子 的 比 例 (heterozygosity)。採用粒線體 DNA COI 序列的基因多樣性，計算族群間的 遺傳變異度，由同一原始族群經相同演化歷史形成遺傳結構，中性的遺傳 變異受中性突變及隨機遺傳漂變之影響，因不受環境選汰作用而可用來推 測分歧時間。本研究利用距離方法 (distance matrix method) 建立親緣關係 樹，首先獲得所有分類群間的遺傳距離，親緣關係樹的建構則基於這些距 離值之間的關係。鄰接法 (Neighbor-joining method, NJ) 基於最小遺傳距離 原理，假設物種進化速率不一致 (Saito and Nei, 1987)。將所有樣本序列兩 兩比對，計算序列核苷酸位點替代數之實際值為遺傳距離值後，將序列間 之遺傳距離排列成矩陣，依照此矩陣建立一棵星狀樹。根據星狀樹，將所 有分類群做潛在的鄰聚分析，選出分枝總合最短的群聚。計算群聚所有分
類群之間的距離，將同一分類群鄰接在一起，將所有分類群聚合成一棵樹。
利用自展檢驗 (bootstrap test) 進行統計檢驗，由自展重複抽樣技術，計算 每個分枝 clade 之 bootstrap 值，評估信賴程度 (Felsenstein, 1985)。NJ tree 以 MEGA4 (Tamura et al., 2007) 軟體建構。
3.COI 序列在親緣地理學 (Phylogeography) 研究
親緣地理學為歷史性生物地理學 (Avise et al., 1987)，主要是在探討基 因 譜 系 與 地 理 分 布 以 及 與 時 間 的 關 聯 性 ， 尤 其 是 親 緣 關 係 接 近 的 物 種 (Avise, 2000)。製作最小跨度網狀圖 (Minimum Spanning Network)，將單倍 型間核苷酸突變數，由差異小至大，依序連接串聯成一網狀圖，並結合地 理分布資訊，可知單倍型關聯性與地理分布之關係。利用 Arlequin ver 2.0 軟體分析所得資訊，並使用繪圖軟體製作最小跨度網狀圖。
五、微衛星基因座的增幅與資料分析
微衛星 DNA 運用在族群遺傳的研究上，具有以下幾個特點：(一) 在 真 核 生 物 基 因 組 中 ， 存 在 大 量 的 微 衛 星 DNA 。 ( 二 ) 高 度 多 型 性 (Polymorphism) 且突變速率快，微衛星 DNA 基因座，同時包含數十個的 等位基因，這樣的多型性有利於進行演化與族群遺傳研究，特別是近期入 侵的生物 (Le Roux and Wieczorek, 2009)。(三) 突變速率快。微衛星 DNA 序列包含重複序列 (repeat sequences) 與兩端非重複序列 (flanking regions) 兩部分。重複序列多由 1~ 6bp 大小的重複單元，重複 5 次以上所組成，
且由於減數分裂期間，容易在 DNA 複製時出現滑動 (slippage) 現象，使 微衛星 DNA 序列的突變率比一般序列高，且不同基因型之間的差異，主 要來自重複序列的重複次數不同 (Goldatein and Schlotterer, 2000)。在突變 速率的差異上，酵母菌每一個基因座的每一次複製，其微衛星 DNA 的突 變率介於 10-4～10-5 之間 (Strand et al., 1993)，人類的微衛星 DNA 的突 變率約為 10-2 (Weber and Wong, 1993)，而昆蟲中的果蠅 (Drosophila) 的
突變率約為 6.3×10-6 (Schug et al., 1997)。在時間的尺度上，粒線體可以研 究 105～102 年之間的演化事件，相較於粒線體 DNA 無法有效區別的族 群，微衛星 DNA 可以研究的範圍約在 103～101 年之間的演化事件，在 時間尺度上具有較大的優勢 (Grant and Waples, 2000)。(四) 等位基因表現 出共顯性遺傳：微衛星 DNA 遵守孟德爾遺傳定律，來自於父方及母方的 微衛星 DNA 都可同時被偵測到 (Hearne et al., 1992)，所以可以做為親緣 分析的分子標誌。
根據 De Barro et al. (2003)、Tsagkarakou and Roditakis (2003)、Delatte et al. (2006) 以及 Tsagkarakou et al. (2007)，所使用之引子組，挑選出 12 組並分別標定 4 種不同的螢光 (Del-53、Bem15、BT-e49) FAM、(Bem6、
BT-b159、Bem23) NED、(Bem37、BT-83、Bem21) PET 和 (Bem31、BT-b155、
BT-4) VIC (表三)，進行 Multiplex PCR 增幅出微衛星 DNA 基因座。PCR 的 反 應 條 件 中 ， 包 含 DNA 萃 取 液 1μl ， 0.5U hot start Taq DNA polymerase，10X Taq buffer 1μl，2.5mM dNTP 1μl 及 10mM forward primer 2.4μl、10mM reverse primer 2.4μl，最後再加入 ddH2O，使總體積為 10μl。
Multiplex PCR 反 應 條 件 為 95℃/10 分 鐘 ， 然 後 進 行 35 個 循 環 之 95℃/40 秒、54℃/40 秒、72℃/40 秒，最後再經 72℃/30 分鐘完成反應。
Multiplex PCR 增幅的產物，以 2.5% 的瓊脂電泳膠片進行電泳檢視是否有 PCR 的增幅產物。Multiplex PCR 增幅的產物，送至生技公司，以 ABI3100 DNA 分析儀進行基因型判定 (genotyping)，檢視 12 個基因座長度大小。
本研究依序列長度挑選 12 組引子對，利用 4 種不同的螢光進行標記，使 基因座的增幅可使用 Multiplex PCR，基因型的判讀也可一次完成，降低實 驗的成本。判讀的方式利用 GENESCAN 3.1.2 軟體進行。
1.遺傳變異 (Genetic variation) 之分析
計算聖誕紅溫室族群在不同時期，以及各國樣本之間基因座上的對偶
基因頻率分布，並估算變異度；即對偶基因數 (number of alleles)、異型合 子比例 (heterozygosity)、以及基因歧異度 (gene diversity)。異型結合子的 比例計算分為異型合子觀測值 (HO, Observed heterozygosity) 以及異型合 子期望值 (HE, Expected heterozygosity) 的估算。觀測值可直接由樣本異型 合 子 比 例 算 出 。 異 型 合 子 期 望 值 則 採 用 Nei (1978) 所 提 出 的 無 偏 估 值 (Unbiased heterozygosity) 算出單一基因座異型合子期望值，再由各基因座 之異型合子期望值相加平均後，求得平均異型合子期望值。公式之計算以 GENEPOP Version 3.4 程式進行運算 (Yeh and Boyle, 1997)。單一基因座異 型合子期望值 (h) 之計算如下 :
n：樣本數；
Pi：族群內第 i 種等位基因型之頻率。
平均異型合子期望值 (HE) 之計算如下：
r：基因座總數；
hi：平均異型合子期望值。
此外，檢測各個基因座是否獨立於另一個基因座，避免不同基因座來 自相同染色體所產生的偏估，利用 GENEPOP Version 3.4 程式進行基因座 間連鎖不平衡 (linkage disequilibrium) 測試。
2.族群哈溫平衡 (Hardy-Weinberg equilibrium) 檢測
一個隨機交配的族群，除非有外力的作用，否則其等位基因出現的頻 h = 2n (1 – ∑ Pi2)
2n – 1
n i =1
∑ hi
r
r i =1
HE =
表三 供試之煙草粉蝨微衛星基因座之引子組
Table 3. Characteristics of microsatellite loci in biotype Q of Bemisia tabaci