molecular porous membrane tubing(Mn：12,000~14,000 及 Mn：50,000)
四、實驗步驟及方法
4-1 超順磁氧化鐵奈米粒子參雜錳(MnMEIO)之製備與合成(5)
為了應用於磁振造影之影像追蹤，本研究需要製備超順磁奈米粒子，
且有較高的磁緩率，因此奈米粒子設計合成參考自2004 年由 Shouheng Sun[81]團隊所合成設計的超順磁氧化鐵奈米粒子參雜錳離子的方式，其合成 方法為將將 Fe(acac)3 (4 mmol, 1.4g)、Mn(acac)2 (2 mmol, 0.51g)、oleic acid (6 mmol, 1.7g)、oleylamine (6 mmol, 1.6g)、1,2-Hexadecandiol (10 mmol, 2.58g) 和5 毫升的 benzyl ether 混合置於雙頸瓶中，並置入在高溫爐內。先加熱至 120℃約等待 15 分鐘左右，此步驟為除去多餘的水氣，接著開啟冷凝系統 並緩慢升溫至200℃ 後持續加熱二個小時使其融解並混合均勻，並加熱至 350℃，到達指定溫度並持續加熱一小時後降溫至室溫。隨後產物加入過量 的丙酮後以13,000 rpm 離心，並利用丙酮清洗，移除多餘的界面活性劑，
離心第二次之後將沉澱物溶於20 毫升的已烷中，加以溶解並離心第三次 (3000 rpm)，此次離心目的為去除部分聚集而不能均勻擴散在已烷之氧化鐵 粒子，收集上清液後，再次加入丙酮作最後一次離心(13,000 rpm)隨後的沉 澱物即為MnMEIO (MnFe2O4)，可溶於 chloroform、hexane 等溶劑保存。
反應藉由調整benzyl ether 的量改變金屬前驅物的濃度，藉以控制粒子粒徑，
並以穿透式電子顯微鏡觀察其粒徑及形狀。
4-2 mPEG-acrylate (mPEG-Ac)之合成(1)
將 mPEG-OH (M.W. = 2,000)(10 mmol, 20 g)加熱至 90-100℃抽真空以 除去mPEG 所包含的水份。抽真空 6 小時之後加入 dry dichloromethane (150 ml)與 TEA (30 mmol, 4.2 mL)，並且在 4ºC 下緩緩滴入 acryloyl chloride (30 mmol, 2.4 mL)，在室溫下反應 48 小時即完成反應。反應完成後加入碳酸鈉 移除acryloyl chloride 所產生的酸性副產物，抽氣過濾後隨後加熱抽真空以 除去未反應的TEA 與 acryloyl chloride，再用 tetrahydrfuran(THF)析出鹽類，
最後用已烷與乙醚以1：1 的比例作不同相純化，沉澱物即可得 mPEG-Ac，
利用 NMR 鑑定其結構(如圖四所示)。Yield：76 % (15.2 mmol, 31.9 g)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3, ): 3.37(s, 3H, CH3-O), 3.63(m, 104H, PEG chain protons), 4.30(t, J = 4.7 Hz, 2H, C-CH2-C=O), acryl group: 5.56 (1H), 6.15 (1H), 6.37 (1H).
4-3 N-acryl-(3-aminopropyl)triethoxy silane (APTES-Ac)之合成(2)
將 APTES(40 mmol, 9.33 mL)溶解在 dry chloroform(DCM, 200 mL)並且 加入TEA(80 mmol, 12.9 ml)後 4ºC 下加入 acryloyl chloride(50 mmol, 4.6 mL) 室溫下反應6 小時，然後利用 slica-gel chromatography (eluent：hexane/ethyl acetate = 1/1) 純化即可得 APTES-Ac，利用 NMR 鑑定其結構(如圖五所示)。
yield：71.71 % (28.7mmol, 7.9 g)。1H NMR (300 MHz, CDCl3, ): 0.66 (t, J =
7.1 Hz, 2H, C-CH2-Si), 1.19(q, J = 8.1 Hz, 9H, CH3-CH2-O), 1.65(m, J = 7.5 Hz, 2H, C-CH2-C), 3.32(t, J = 7.1 Hz, 2H, C-CH2-N), 3.81(q, J = 8.4 Hz, 6H,
C-CH2-O), acryl group: 5.61 (1H), 6.11 (1H), 6.21 (1H).
4-4 N,N’-APTES -N-Boc(ethylenediamine)-mPEG (mPEG-NBoc-silane)之合成 (3)
將 APTES-Ac (6.6 mmol, 1.8 g)、mPEG-Ac (6.6 mmol, 13.6 g) 與 N-Bocethylenediamine (7.0 mmol, 0.8 g) 置 入 雙 頸 瓶 中 並 溶 解 在 dry dichoromethane (DCM) (20 mL) 之內，隨後加入 TEA (5mmol, 0.8 mL)，於 40~45℃加熱迴流，在氮氣下反應 72 小時，即完成反應。反應完成後用減 壓濃縮機移除多餘的DCM，並加入 THF 析出反應中的 TEA 鹽類副產物，
抽氣過濾收集澄清液，隨後正己烷析出 mPEG-NBoc-silane，利用 NMR 鑑 定其結構(如圖六所示)。Yield：39.4 % (1.9 mmol, 4.5 g) 。1H-NMR (300 MHz, CDCl3, )：0.76 (t, 2H, Si-CH2-C, J = 4.2 Hz), 1.24(t, 9H, CH2-CH3, J = 2.4 Hz), 1.42(s, 9H, C-CH3), 2.48-2.67 (m, 2H, -C-CH2-(C=O)-N, 2H, -C-CH2-(C=O)-O), 2.82-2.98(m, 2H, N-CH2-C-(C=O)-O; 2H, N-CH2-C-(C=O)-N, 2H, N-CH2-C-N), 3.20(t, 2H, -C-CH2-NH-(C=O)), 3.27(s, 3H, -O-CH3), 3.54-3.70(m, ~190H, -(CH2-O-CH2)n-), 4.18(t, 2H, C-CH2-O-(C=O), J = 4.2 Hz).
4-5 N,N’-APTES -N-Boc(ethylenediamine)-mPEG(mPEG-NBoc-silane)的水解 (N,N’-APTES-ethylamine-mPEG) (4)
聚合物(3)的水解主要是為了移去胺基保護基，除此之外也會將silane上 的ethoxy進行酸水解而形成醇基，以trifluoroacetic acid (TFA) 跟DCM (TFA/DCM ＝ 1/1 20 mL) 並加入聚合物分子(3)，在氮氣下
進行反應，六小時後即完成水解。最後以乙醚與正己
烷 (ethyl ether / hexane＝1/1) 移除TFA 並清洗數次，隨後收集沉澱物真空 抽氣後可得mPEG-NH2-silane，利用NMR鑑定其結構(如圖七所示)。1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ)：2.54 (m, 2H, -C-CH2-(C=O)-N-, 2H, -C-CH2-(C=O)-O-), 2.67(m, 2H, N-CH2-C-(C=O)-N-, 2H, N-CH2-C-NH2), 2.86(m, 2H,
N-CH2-C-(C=O)-O-, 2H, N-C-CH2-NH2), 3.13(q, 2H, -C-CH2-NH-(C=O), 3.32(s, 3H, -O-CH3), 3.59-3.70(m, ~190H, -(CH2-O-CH2)n-), 4.22(t, 2H, C-CH2-O-(C=O), J = 7.8 Hz), 4.45(s, 3H, Si-OH).
4-6 近紅外光螢光團 CyTE777 之合成(7)
N N
Cl
O3S SO3
Na
N N
S
O3S SO3
Na CO2H
IR-783 CyTE-777
Scheme 1
此螢光團之設計合成主要在於可以利用近紅外光能穿透組織之特性用 來對活體進行螢光之追蹤。取 3-mercaptopropionic acid(0.467 mmol, 40.7 μL)
和triethylamine ( TEA ) (0.467 mmol, 65.3 μL) 溶於 DMF 10 mL 並置於圓 底燒瓶中，在室溫下攪拌20分鐘。秤取 IR-783(0.33 mmol, 250 mg)溶於 6 mL 的DMF，使vial瓶中的IR-783完全溶解(成綠色溶液) ，再將此溶液倒入 圓底燒瓶中攪拌反應約21小時(不加熱) ；利用HPLC判斷反應是否反應完全。
待反應結束，在圓底燒瓶中加入冰乙醚，將綠色固體沉澱出來，以抽氣過 濾收集固體，再以CH3OH洗入另一濃縮瓶抽乾，以HPLC分離(條件：CH3CN + 0.1 % TFA；水)，純化完將其凍乾，並放在低溫冷凍保存。得綠色棉絮狀 固體0.14克，產率：91.45 %，利用NMR鑑定其結構。1H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.89 (d, 2H, J = 14.2 Hz), 7.49 (d, 2H, J = 7.4 Hz), 7.41 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 7.34 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 7.25 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 6.32 (d, 2H, J = 14.3 Hz), 4.19 (t, 4H, J = 6.7 Hz), 3.06 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 2.90-2.87 (m, 4H), 2.70 (t, 4H, J = 5.9 Hz), 2.56 (t, 2H, J = 6.9 Hz) 2.00-1.92 (m, 10H), 1.76 (s, 12H).
HRMS-ESI [M]- m/z calcd for C41H51N2O8S3 795.2959, found 795.5.
4-7 近紅外光螢光團 CyTE777-NHS ester 之合成(8)
N N
S
O3S SO3
Na
N N
S
O3S SO3
Na
CyTE-777
Scheme 2
CO2H
O O
N O O
官能基為羧基酸的螢光基團對於合成氧化鐵需要縮合試劑進行反應，其 過程較為複雜，為此把CyTE777 修飾成 CyTE777-NHS 較易與奈米粒子上 的胺基進行反應。取CyTE-777 之羧基化合物溶入 500 μl 除水過的 DMF，
隨後加入Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (1.1 mmol, 220.1 mg)以及催化劑 4-(Dimethylamino)pyridine (DMAP) (1.1 mmol, 134.4 mg)反應 12 小時，保持 在避光且氮氣下攪拌。過程由HPLC 觀測反應是否完全，反應後的產物由 冰乙醚沉澱，隨後加入甲醇清洗後凍乾，產物不再用HPLC 作純化。
4-8 NSMP (N-succinimidyl-3-maleimidopropionate) linker 之合成(10)
為了使氧化鐵奈米表面帶有maleimide的官能基，須先合成NSMP (N-succinimidyl-3-maleimidopropionate) linker 之交聯化合物，此化合物能與 超順磁氧化鐵表面胺基進行SN2離去基反應，使得氧化鐵表面能帶有
maleimide官能基，此官能基能與抗體或是胜肽上的硫基作鍵結。取maleic anhydride (10 mmol, 1g)溶於無水的DMF中，隨後加入β-Alanine (10 mmol, 0.91 g)，保持在氮氣的環境攪拌1小時，接著緩慢加入DCC(20 mmol, 4.12 g) 反應overnight，攪拌均勻直到maleimide官能基的形成，加入
N-hydroxysuccinimide (12.5 mmol, 1.4 g)室溫下攪拌4-6小時，接著將溶液抽 氣過濾，移除DCU等副產物，濾液加入5倍體積的二次水，並用100 mL 之 二氯甲烷個別萃取兩次，以無水硫酸鎂除水並過濾，減壓濃縮後可得黃白
色沉澱物，接著將產物溶到適量的DCM中，緩慢加入已烷作再結晶析出，
所得白色粉末產物即為NSMP。利用NMR鑑定其結構(如圖八所示)。1H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 6.74 (s, 2H, -CH=CH-), 3.93 (t, 2H, -CH2-), 2.96 (t, 2H, -CH2-), 2.82(t, 4H, -CH2
-CH
2-). HRMS-ESI [M]+m/z calcd for C
11H10N2O6 266.2, found 289.1 [Na]+.4-9 超順磁氧化鐵-錳奈米粒子(MnMEIO)表面修飾 PEG 聚分子(6)
高溫裂解的磁性奈米粒子其反應為高沸點之有機溶劑，其核外為oleic acid 和oleylamine包覆之疏水性基團，此基團不能應用在生物實驗上，因此 參考自Randy De Palma 所發表在Chemical Materials的方法，其原理為溶膠-凝膠聚合法(so-gel reaction)。首先將溶在氯仿的超順磁氧化鐵-錳奈米粒子 取1 mL，用真空抽氣移去氯仿，隨後加入20 mL甲苯(toluene)，由超音波機 震盪10分鐘，接著取聚合物分子(4)以重量比1：20 的方式加到甲苯裡與磁 性奈米粒子進行配位子互換，此過程在60℃下反應，持續震盪8小時後，加 入過量的已烷促使水溶性的磁性奈米粒子沉澱，接著用已烷清洗數次，再 用真空抽氣移除多餘的已烷，加入適量的去離子水後，將水溶液的磁性奈 米粒子通過0.22 μm 的過濾膜，並用分子量為50,000透析膜以去離子水透析 24小時， 即可得到水溶性超順磁氧化鐵-錳奈米粒子。
4-10 水溶性超順磁氧化鐵-錳奈米粒子之表面胺基測定
為了能夠與CyTE777-NHS ester(8)、NSMP化合物(10)鍵結，首先須要 了解磁性奈米粒子上有多少胺基數量，此胺基能與NSMP還有CyTE777上的 NHS進行離去基取代反應，本研究利用OPA檢測法(spectrophotometric OPA assay method)，作為磁性奈米粒子表面胺基的檢測方法，o-phthaldialdehyde (OPA)會與一級胺反應，其反應快速、靈敏度高。其作用原理為利用磁性奈 米粒子上其水溶性PEG內側之胺基官能基與o-phthaldialdehyde(OPA)反應，
然後利用甘氨酸與未反應的OPA作用，利用UV/VIS在波長340 nm 定量未反 應之OPA，並以OPA濃度檢量線標準樣品推測奈米粒子上胺基的濃度。
(1) OPA檢測配製：
試劑A - 將OPA溶於乙醇溶液中(0.25M)，以及β-mercaptoethanol溶於0.1 M 的Na2B4O7 (pH=9.5)使其濃度為 4 %。取300μl的0.25 M之OPA乙醇水溶液 與300μl之4 %的β-mercaptoethanol 之Na2B4O7水溶液混合均勻，用去離子水 稀釋至總體積為50 mL。(OPA濃度為1.5 × 10-3 M)。
試劑B – 將glycine溶於0.1 M Na2B4O7 中，其濃度為0.06 M，以及
β-mercaptoethanol溶於0.1 M的Na2B4O7 (pH = 9.5)使其濃度為0.5 %。取500 μL之0.006 M 之glycine溶液與500 μL之0.5 % β-mercaptoethanol混合均勻後，
用去離子水稀釋至30 mL。(glycine的濃度為1.0 × 10-3 M)。
OPA標準溶液配製 – 在試管中分別加入2 ml之0.1 M Na2B4O7和100 μL
之試劑B，再配製1.5 mM、1 mM、0.5 mM、0.1 mM、0 mM不同濃度的試 劑A，取50 μL 加入其中，混合均勻後，反應兩分鐘隨後以UV/Vis光譜儀測 定340波長之吸收，得到OPA之濃度檢量線。
以OPA檢測表面胺基時，取2 mL 之試劑A於試管中，加入50μL的磁 性奈米粒子混合均勻後，反應五分鐘，以高速離心機13,000 rpm離心20分鐘，
取50 μL 未反應之OPA上清液加入含有2 ml之0.1 M Na2B4O7 和100 μL 之 試劑B的試管內，同時測量340波長處之吸光度，推算磁性奈米表面胺基數 量。
4-11 近紅外光螢光基團鍵結至磁性奈米粒子上 MnMEIO(NH2)-Cy777-mPEG 之合成(9)
由OPA檢測法可推知在10 mg/mL的磁性奈米粒子的水溶液中，其胺基 的濃度為16 mM，以此為依據，將CyTE777-NHS ester (0.002 mmol, 2mg)溶 入磁性奈米水溶液中，在4℃下反應overnight，接著將反應的溶液以分子量 50,000的透析膜透析24小時，移除未反應之螢光團。
4-12 MnMEIO-linker-Cy777-mPEG 之合成(11)
取MnMEIO(NH2)-Cy777-mPEG水溶液 9 mL (-NH2, 16 mM)，加入
NSM
3 Anti-MU
抗體的修
tock soluti 2個硫基。
ation buffe Traut’s age
至抗體溶液 Traut’s age 上與抗體反
在4℃下反 時，移除未
基之合成
hen O’Brie t’s agent與 鍵在水相進 M, 150mM 成stock solu 在室溫下反
echbiel[83]
可與磁性
4-14
4 Anti-MU
-14.1 實驗
i-MUC4 a (400 μg)
y Dispersiv
料以及元素
ve Spectro
素鑑定，其
oscopy, ED
其原理為當
層電子很快的遷降至內層電子的空穴並釋放出兩能階差之能量。被釋放出 的能量可以X光的形式釋出，不同原子特性的能量會以不同X光散出，因此 此特性X光可以鑑定試片的各個組成元素。將有機相之磁性奈米粒子在丙酮 的環境下震盪，去除高沸點之長碳鏈分子，獲得粉狀的磁性奈米粒子，將 此粒子均勻的放置載體上以20 keV的電子伏特進行元素分析。
4-17 超導量子干涉磁量儀(SQUID)磁性之測定
其樣品配置與EDS相似，將磁性奈米粒子外層有機層利用丙酮沖洗後獲得 粉末狀的磁性奈米晶體，把粉狀奈米粒子取1-2 mg 放入樣品管中，並置入 在震盪桿下方，使樣品維持在兩磁場間，偵測由外加磁場-10 kOe到10 kOe 之間的磁矩變化量，此資訊可提供所合成出的磁性奈米粒子之飽和磁化率，
並可推測此奈米粒子是否為超順磁性質。
4-18 X 繞射光譜儀 (power X-ray diffraction, XRD)之晶體鑑定
X光進入晶體時，會被原子所組成的晶片反射，假設晶面距離為d，入射 光與晶面夾角為θ，其為繞射角度，當入射光被相鄰的晶面反射時，兩反 射光束會有一行差距為2 d sinθ，若此行剛好等於光波波長λ之整數倍，會 產生建設性干涉。滿足此條件可產生繞射，以此訂為布拉格定律。
Bragg’s law：2 d sinθ= nλ
將磁性奈米氧化鐵之乾燥後粉末放置在XRD的載體上，其掃描為每分 鐘4度，2θ為20 ~ 80度。
4-19 核磁共振光譜儀( NMR)之鑑定
化學合成的 PEG 聚合物以及 silane 衍生物分子可藉由核磁共振光譜儀 測定，其原理為偵測氫原子自旋方式在外加磁場下，其內的核磁距與磁場 交互作用而吸收無線電波，因此氫原子核內自旋電子由滴能階要遷至高能 階，此時不穩態的能量會以光或電磁波的方式再次釋放出去(即 relaxation)，
化學合成的 PEG 聚合物以及 silane 衍生物分子可藉由核磁共振光譜儀 測定，其原理為偵測氫原子自旋方式在外加磁場下，其內的核磁距與磁場 交互作用而吸收無線電波，因此氫原子核內自旋電子由滴能階要遷至高能 階，此時不穩態的能量會以光或電磁波的方式再次釋放出去(即 relaxation)，