第三章、 材料與方法
第二節、 尿中 1-OHP、2-NP 的分析方法
1.藥品
z hyproxypyrene, 98％ （Aldrich）
z naphthol, （Sigma）
z β-glucuronidase/sulfatase （100000 unit, Sigma）
z Methanol （MERCK, HPLC 級）
z Acetonitrile （MERCK, HPLC 級）
z Sodium acetate （Sigma）
2.儀器設備
z 高效能液相層析儀（Shimadzu LC-20A）
（1） 樣品自動注射器（SIL-20A）
（2） 系統自動控制器（SCL-20A）
（3） 恆溫槽（CTO-6A）
z 螢光偵測器（Shimadzu RF-10AXL）
z 訊華數據處理系統
z 層吸管柱（TSK-GEL ODS-80Tm, iD 4.6mm×250mm 之不鏽鋼管柱）
z 37℃恆溫培養箱 z 超音波震盪器
(二)尿中 1-OHP 分析步驟及條件
人體中Pyrene 代謝物 1-OHP 的分析方法係參考 Tguchi（1993）等人(84) 的分析方法略加修改，採用高效能液相層析儀連接螢光偵測器分析尿液 中1-羥基芘(1-OHP)濃度。
分析步驟：
取研究對象尿液樣本1mL
加入1mL 0.2M 醋酸鈉(pH=5)為緩衝溶液
加入500µL β-glucuronidase/sulfatase(100000U) 均勻混合
置入37℃恆溫水浴槽培養 16 小時
加入 2.5mL acetonitrile
振盪 1 分鐘均勻混合
離心5000 rpm 15 分鐘
取上層液1 mL
以HPLC-Fluorescence 分析
z 分析條件
column ：SUPELCO516C-18, id 4.6mm*250mm, 5μm flow rate ： 1 mL/min
oven temp. ： 40℃
inject volume ： 20 μL
mobile phase ： acetonitrile：water=60：40（v/v）
wavelength ： Ex：348nm，Em：388nm
z 品質管制：
檢量線：配置儲備溶液(stock solution)，加入 0.01 g 1-OHP 於定量瓶中，
再以甲醇定量至100 mL，即配製成 100 ppm 的儲備溶液，在稀釋成濃度 範圍為0.005 ng/mL- 0.5 ng/mL，其 r 値均大於 0.995。由於一般民眾 1-OHP 濃度較低，若以尿液添加法做檢量線及水溶液1-OHP 作檢量線，兩者檢 量線之斜率相似，顯示分析尿中1-OHP 較不受基質差異之影響。1-OHP 檢量線圖譜如圖3-3。
偵測極限：此研究中的偵測極限是以檢量線的最低濃度重複分析7 次，
可得7 次積分面積，求其平均值及標準差，取 3 倍標準差，即可求得此 方法之偵測極限為0.002ppb。
儀器再現性：配置標準容液，分別重複分析7 次，可得 7 次的滯留時間 及積分面積，求算其平均值及標準差，以標準差除以平均值即可得變異 係數(CV %)，其變異係數介於 1-2%之間，以確保儀器分析的穩定性。
尿液樣本之添加回收率：在混和尿液(pooled urine)中添加 0.5ng、2.5 ng 及10ng 兩種濃度，計算其添加回收率，其值均介於 90-110 %之間。
圖 3-3 1-OHP 檢量線 y = 1852151.4033 x - 7723.3145
R2 = 0.9997
0 500000 1000000 1500000 2000000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
(三)尿中 2-NP 分析步驟及條件
人體中Naphthalene 代謝物 2-NP 的分析方法係參考 Kim（1999）等人(85) 之分析方法略加修改後，採用高效能液相層析儀連接螢光偵測器分析尿 液中2-奈酚(2-NP)的濃度。
分析步驟：
取研究對象尿液樣本3 mL
加入500µL 2M (pH=5)醋酸鈉為緩衝溶液
加入50µL β-glucuronidase/sulfatase(100000U)
置入37℃恆溫水浴槽培養 16 小時
加入5 mL acetonitrile
振盪 1 分鐘均勻混合
離心1000rpm 15 分鐘
取上層液1 mL
以HPLC-Fluorescence 分析
z 分析條件：
column ：SUPELCO516C-18, id 4.6mm*250mm, 5μm flow rate ： 1 mL/min
oven temp. ： 40℃
inject volume ： 20 μL
mobile phase ： acetonitrile：water=60：40（v/v）
wavelength ： Ex：227nm，Em：382nm z 品質管制：
檢量線：配置儲備溶液(stock solution)，加入 0.01 g 2-NP 於定量瓶中，再 以甲醇定量至100 mL，即配製成 100 ppm 的儲備溶液，在稀釋成濃度範
偵測極限：此研究中的偵測極限是以檢量線的最低濃度重複分析7 次，
可得7 次積分面積，求其平均值及標準差，取 3 倍標準差，即可求得此 方法之偵測極限為0.04ppb。
儀器再現性：配置標準容液，分別重複分析7 次，可得 7 次的滯留時間 及積分面積，求算其平均值及標準差，以標準差除以平均值即可得變異 係數(CV %)，其變異係數均介於 1-2%之間，以確保儀器分析的穩定性。
尿液樣本之添加回收率：在混和尿液中添加2.5ng、12.5 ng 及 50ng 兩種 濃度，計算其添加回收率，其值均介於90-110 %之間。
第三節 呼吸症狀及肺功能量測
由 ATS 問卷量表測量受試者是否有慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺 病、咳嗽、咳痰、喘鳴、呼吸短促、感冒與胸部疾病等症狀。在問卷使 用自覺症狀及既往病例中的大二大題有關「痰的症狀」等七題問題來判 斷受試者是否有慢性支氣管炎。在慢性阻塞行肺病則是由問卷中第35 題 來判斷，慢性支氣管炎及慢性阻塞行肺病變項均以「有」與「無」來呈 現。咳嗽症狀則由問卷中「咳嗽」等六小題來測試，受試者的咳嗽症狀 分為五的等級，在本研究變項中則分為有與無兩項，無咳嗽症狀為0 級，
有咳嗽症狀為1-4 級。咳痰症狀由問卷中第 26-32 題分為五級，喘鳴則由 35-36 題分為五級，呼吸短促變項則由 44-48 題分為六級，而感
冒與胸部疾病由問卷中50-53 題分為四級，以上變項在此研究中均分為有 與無症狀，第0 級為無呼吸道症狀，第 1 級以上則為有呼吸道症狀。各 呼吸道症狀之詳細分級請參考附件二。
受測居民除進行問卷訪視外，並同時執行肺功能量測，以攜帶型肺 活量測定器CHEST HI-801 量測，每次測量前由經過訓練人員以校正器(容 量1 公升)，進行至少 4 次以上之肺容積校正，直至畫面顯示 OK 止。受 測者進行量測前，由受過訓練人員進行解說及親自示範。肺功能計輸出 肺功能參數包括以下五種：
(1)用力呼氣肺活量(Forcd vital capacity, FVC)
受測者用力吸飽氣候，快速將一口氣吐出的總吐氣量。FVC 大小是 決定於肺的彈性、呼吸道的口徑大小及其阻抗。數值會因性別、年齡、
身高、體重、人種和胸廓的大小而不同。
(2)用力一秒吐氣量(Forced Expiratory Volume in 1 second, FEV1)
受試者在盡力吸飽氣後，快速將一口氣吐出的第一秒的吐氣量，即 FVC 的第一秒吐氣量。FEV1數值若在正常範圍，則阻塞型或局限型的通 氣障礙可排除。若呈現異常值，則兩者都有可能。
(3)一秒率(FEV1 %)
FEV1%為 FEV 與 FVC 之比值。正常 FEV1%介於 75-85%之間，此值 可較敏感的顯示氣體阻塞的程度，通常可視為阻塞性肺部疾病的指標。
若FEV1與FVC 的比值明顯下降時，即表示受測者患有阻塞性肺病（例 如氣喘），可能是因病人呼吸道的狹窄導致較慢的呼出率。如果FVC 和 FEV1兩個數值皆下降，則病人可能患有限制性肺病，即肺容量受到限制，
但其呼吸道卻呈現正常現象。
(4)FEF25-75%
吸飽氣時用力吐氣直到將氣吐光為止的過程中，介於 25%與 75%間 的流量，主要來自末端支氣管，又稱小氣管(small airway)的氣，單位為升 /秒(L/s)，而當吐氣從 25%切點至 75%切點時，無論病患有沒有用力吐氣，
吐氣的流速都一樣，故對於裝病或不用力吐氣的受測者可輕易被辨識。
阻塞性肺部疾病早期有病變時就是在末端支氣管，所以當FEV1及FEV%
還在正常範圍內時，此指標即已經出現異常現象，故其比FEV1更能當作 小支氣管病變的早期指標。
(5) COPD 定義
慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一 種呼氣氣流受阻，而且無法以藥物完全恢復之疾病。由於肺臟對有害微 粒或氣體的不正常發炎反應所造成，通常是漸進式惡化。如有慢性咳嗽、
咳痰、呼吸困難及曾暴露在危險因子的病史時，都需考慮COPD 之診斷。
本研究藉由肺量計(spirometry)做為診斷 COPD 之參考，其數值為
FEV1/FVC < 75 %，則判定為 COPD (American Thoracic Society, ATS, 1986 Criteria)。COPD 可分為 0-4 級，即正常、輕症、中症、重症與嚴重症等 五級，由於呼吸道症狀各等級人數不多，故將不同等級之COPD 者合併 為ㄧ組再與正常者比較之。在生活環境中有暴露到職業性粉塵或化學物 質、廚房油煙、熱燃油及本身有吸菸的習慣，均是造成COPD 的危險因 子。
第四節 資料整理與統計分析
個人問卷資料及尿液 PAHs 代謝物分析結果均以 Excel 建檔，並以 SPSS12.0 版進行統計分析。將個人基本資料、個人健康行為及呼吸道症 狀等變項，使用百分比分佈做初步分析，之後再依資料分佈情形及各變 項特性選擇適合之統計分析方法。一般民眾體尿中 1-OHP 及 2-NP 濃度 在三年間及暴露程度之變化，以平均數及標準差表示。比較尿中 1-OHP 及2-NP 濃度高低與呼吸道症狀異常比例之危險比，則運用邏輯式迴歸分 析。並使用線性迴歸模式比較三個年度間呼吸道症狀之差異性。
第四章 研究結果
第一節 中科園區附近居民問卷調查及生物偵測
三年期間共收集 824 份問卷，包括中科園區週界居民有 696 份，對 照組新社鄉居民則有128 份。比較三年之人口基本資料，表一結果顯示 年齡、教育程度、吸菸習慣、服用維他命、居住在馬路旁及拜拜習慣在 三年間均有顯著性差異，其中民眾服用維他命及拜拜習慣有逐年增加的 趨勢，p 值分別為 0.004 及 0.01。表二為比較暴露組民眾之三年基本資料 之比較，結果顯示年齡、BMI、服用維他命、住在馬路旁及拜拜習慣在 三年期間均有顯著性差異，其中民眾服用維他命及拜拜習慣的比例，隨 著年度的增加而有上升的現象，p 值分別為 0.005 及 0.024。
表三結果顯示暴露組與對照組之間比較，其中在年度、年齡、教育 程度、吸菸習慣、家中有鋪地毯、家中有使用空氣清淨機、有拜拜習慣 及家中有使用蚊香等變項兩組均有顯著性差異。其中以對照組之年齡分 佈以大於70 歲者比例最大占 77%，而暴露組則以 40-70 歲的比例最大占 43.7%。在教育程度變項中，對照組的教育程度以國(初)中以下的比例最 大為91.0%。有吸菸習慣的比例中以暴露組的 19.2%明顯高於對照組占 9.0%，其 p 值為 0.007。家中有鋪地毯的比例以對照組占 11.8%明顯高於
暴露組為5.8%，p 值為 0.017。暴露組居民家中有使用空氣清淨機的比例 為17.7%明顯高於對照組 8.3%，其 p 值為 0.01。在家中有拜拜的習慣以 對照組85.1%明顯高於暴露 56.0%，其 p 值小於 0.001。以暴露組居民家 中有使用蚊香的比例為36.7%高於對照組 27.3%。
由表四至表六結果顯示三個年度間暴露組與對照組居民的時間活動 量表之比較，其結果顯示以對照組居民待在室內家中及室內工作的時間 均高於暴露組居民，其中以96 年兩組居民待在室內家中有明顯之差異，
對照居民在室內家中的時間為19.3 小時明顯高於暴露組居民在室內家中 的時間為17.6 小時，p 值為 0.009。以暴露組待在室外的時間為 5-6 小時 略高於對照組為4-5 小時，但無顯著性差異。雖然兩組居民假日在室內外 時間無統計上差異，但以對照組居民待在室內的時間為19.9 小時略高於 暴露組的居民待在室內的時間為19.2 小時。在三年間無論是暴露組或是 對照組的居民之活動量表均無顯著性差異。
尿中 1-OHP 及 2-NP 濃度與各變項之單變量分析，表七結果顯示尿
尿中 1-OHP 及 2-NP 濃度與各變項之單變量分析，表七結果顯示尿