PHF6 與白血病發生中其他遺傳變異的相互作用

3.4.1.1 Phf6 缺失降低了 NOTCH1 誘導的白血病的閾值

本論文試圖看看 Phf6 缺失是否在淋巴細胞譜系的白血病發生中起到致癌輔助作用。

NOTCH1 是人類 T-ALL 中最常見的突變基因。ICN1 的過表達可在小鼠細胞中誘導 T-ALL。

本論文將 WT+ICN1 或 Phf6 KO+ICN1 的骨髓前驅細胞移植到 8 至 12 週齡的受體小鼠中，

本論文發現 Phf6 KO+ICN1 小鼠比 WT+ICN1 小鼠具有更具嚴重的表型，包括較低的血紅素 水平 (p=0.0353) (圖 11a)，以及 WBC 和中性粒細胞計數升高、血小板計數降低和乳酸脫氫 酶 (LDH) 水平升高的趨勢。 WT+ICN1 和 Phf6 KO+ICN1 受體的白血病骨髓主要是

CD4⁺CD8⁺細胞，但本論文注意到 Phf6 KO+ICN1 受體的 CD4 單陽性白血病細胞百分比較高

（p=0.0325）(圖 11b)。 WT+ICN1 和 Phf6 KO+ICN1 受體的胸腺大小相似，但受體 Phf6 KO+ICN1 細胞的胸腺腫瘤負荷較重。 Phf6 KO+ICN1 小鼠的脾臟更大(圖 11c)，總生存期 顯著縮短（p<0.0001）(圖 11d)。

使用來自這些小鼠的稀釋劑量的白血病細胞進行二次移植到 8 至 12 週齡的受體中，本 論文證實 Phf6 剔除降低了 ICN1 誘導轉化的閾值：所有 WT+ICN1 小鼠存活，但幾乎所有 Phf6 KO +ICN1 小鼠在最低劑量（1000 個細胞/小鼠）下也會死亡(圖 11e)。通過 FACS 分 析，本論文證實 Phf6 KO+ICN1 小鼠的骨髓中有更高百分比的白血病起始細胞

(leukemia-initiating cells , LIC) (CD4^-CD8^-CD25⁺CD127⁺) (p=0.0438) (圖 11f)。ELDA webtool 還表明 Phf6 KO+ICN1 小鼠具有明顯更多的 LIC；WT+ICN1 和 Phf6 KO+ICN1 骨 髓細胞中估計的 LIC 頻率分別為 1/8960 和 1/576(圖 11g)。

3.4.1.2 細胞週期和致癌功能的表達增加，是改變誘導白血病途徑中的關鍵因 素

為了探究 Phf6 缺陷型 HSC 的不同表型背後的可能分子機制，本論文分析了小鼠 HSC 高度受限(highly restricted)、罕見的亞群(rare subpopulation)的轉錄組。本論文從 Phf6 剔除 或野生型動物中分選了 100 到 200 個 LT-HSC、MPP2 和 MPP3 細胞用於轉錄組測序。野生 型和 Phf6 剔除細胞之間的差異表達基因，在與細胞週期(cell cycle)、白血球細胞分化

(leukocyte differentiation)和幹細胞分化(stem cell differentiation)相關的基因中顯著富集 (significantly enriched)，這與本論文的小鼠表型分析一致(圖 12a)。且與細胞週期功能相關 的基因特徵(gene signatures)，在 Phf6 剔除的 HSPC 中，所有三個亞群中都得到了增強(圖 12b，僅顯示了 MPP3)；包括 Dna2、Gtse1、Hras、Plk1 和 Zwilch 在內的已知促進細胞 分裂的領頭基因(leading edge genes)，在 Phf6 剔除細胞中上調，與本論文的觀察結果一致。

Phf6 的腫瘤抑制功能，經由 Phf6 剔除 HSPC 中的致癌功能有關的基因增強(enrichment)得 到證實(圖 12c)；被認為增強幹細胞增殖的 E2F1、MYC 和 MTOR 功能在 Phf6 無效 HSC 的 所有三個亞群中都上調(圖 12d，僅顯示了 LT-HSC)。

3.4.2 Phf6^KO與 Idh2^R172K的交互作用 3.4.2.1 培育 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠

小鼠 Phf6 基因有 11 個外顯子，編碼一個 364 個胺基酸的蛋白質，包含兩個 ZaP 結構 域。它位於小鼠染色體 X 上，29.28 cM，細胞帶 A4

(http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:1918248)。該基因中有五個轉錄本

（www.ensembl.org）。如前所述，本論文通過 CRISPR/Cas9 基因組編輯策略生成了 Phf6 條件性剔除小鼠(Hsu, Chen et al. 2019)。為了進一步研究 Phf6 和 Idh2^R172K的相互作用，將 Phf6 條件性剔除小鼠 Idh2^R172K置入(knock-in)小鼠配種，具條件式 Phf6 KO 和 Idh2^R172K (Phf6^KOIdh2 ^R172K)的小鼠可存活。子代的比例，包括野生型（Phf6^f/f 和 Phf6^f/Y）、Phf6^KO

（Vav1-cre；Phf6^f/f 和 Vav1-cre；Phf6^f/Y）、Idh2^R172K（Idh2 ^R172K；Phf6^f/f 和 Idh2 ^R172K ;Phf6^f/Y) 和 Phf6^KOIdh2 ^R172K (Vav1-cre;Idh2 ^R172K;Phf6^f/f 和 Vav1-cre;Idh2 ^R172K ;Phf6^f/Y) 與預期的 孟德爾比率一致(圖 13A)。小鼠在 3-4 週齡斷奶，並通過 PCR 對從尾夾(tail clips)製備的基 因組 DNA 進行基因分型(圖 13B)。

3.4.2.2 在年輕時，Phf6^KOIdh2^R172K小鼠在年輕時外週血中有明顯的白細胞減 少和貧血

為了研究 Phf6 和 IDH2^R172K在造血中的交互作用，分析了 8~12 週大的 Phf6^KOIdh2 ^R172K 小鼠及其同窩對照小鼠的 CBC/DC，其中包括 Phf6^KO、Idh2 ^R172K或野生型小鼠。發現 Phf6^KOIdh2 ^R172K小鼠的 WBC 和淋巴細胞顯著低於野生型和 Idh2 ^R172K小鼠(圖 14A 和 C)。Phf6^KOIdh2 ^R172K小鼠的血色素水平和網織紅細胞(reticulocyte)計數也顯著低於 Idh2 ^R172K 小鼠。然而，這四種基因型之間的嗜中性白血球細胞計數和血小板計數沒有顯著差異。

3.4.2.3 在年輕時，Phf6^KOIdh2^R172K小鼠週邊血中 B220⁺、CD4⁺ 和 CD8⁺細胞顯

著減少

進一步用流式細胞儀分析了 8~12 週齡小鼠外週血中的白血球亞群。具有 B220、CD4、

CD8、CD11b 和 Gr.1 的表面標記用於表徵不同的子集。Phf6^KOIdh2 ^R172K小鼠通過前言散射 (foreword scatter)和其他小鼠的側向散射(side scatter)在 FACS 分析中顯示出不同的細胞分 佈(圖 15)。初步分析，Phf6^KOIdh2 ^R172K小鼠中 B220⁺和 CD4⁺細胞的百分比顯著低於野生型 小鼠(圖 16A 和 C)。Phf6^KOIdh2 ^R172K小鼠中 B220^+、CD8⁺ 和 CD4⁺細胞的絕對計數也顯著 低於野生型小鼠(圖 16A、B 和 C)。雖然 CD11b⁺Gr.1⁺和 CD11b⁺Gr.1^- 亞群的百分比在 Phf6^KOIdh2 ^R172K小鼠中較高，但四種基因型的絕對計數相當(圖 16D 和 E)。

3.4.2.4 在年輕時，Phf6^KOIdh2^R172K小鼠罹患了慢性骨髓單核細胞白血病樣疾 病(chronic myelomonocytic leukemia-like disease)

年輕的 8~12 週齡 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠脾臟明顯增大(圖 17h)。Phf6^KOIdh2^R172K小鼠的 BM 塗片顯示有發育不良的紅血球母細胞(dysplastic erythroid precursors)、小巨核細胞(small megakaryocytes)或具有多個離散核的巨核細胞(megakaryocytes with multiple discrete nuclei)以及具有精細染色質和核仁的原始細胞增加(increased blast cells with fine chromatin and nucleoli) (圖 17i)。用 CD11b、Gr.1、CD4、CD8、B220 和 Ter119 的譜系標記透過流 式細胞術分析了 BM 細胞。在 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠中，CD11b⁺Gr.1^- 單核球細胞(monocytes) 的比例顯著增加，CD11b⁺Gr.1⁺ 粒細胞(granulocytes)的比例降低(圖 17j，k)。在

Phf6^KOIdh2^R172K小鼠中，不表達譜系標記(Lin negative)的 BM 細胞，包括未成熟細胞，顯著

增加(圖 17 l)。在 Phf6^KOIdh2^R172K BM 中 CD4⁺細胞減少，但 CD8⁺、B220⁺ 和 Ter119⁺細 胞在四種基因型小鼠中是相當的(圖 18 a-f)。

Phf6^KOIdh2^R172K小鼠脾臟腫大的組織學檢查顯示紅髓中的髓外造血增強，紅血球母細胞

(precursor erythroid)和骨髓細胞(myeloid cells)顯著增加(圖 19a，b)。免疫組織化學(IHC) 染色也注意到 CD117⁺未成熟骨髓細胞增加(圖 19c)。流式細胞學檢查分析，揭示了

Phf6^KOIdh2^R172K脾臟中 CD11b⁺Gr.1^-單核細胞、Ter119⁺紅血球母細胞和譜系標記陰性(Lin negative)細胞的比例顯著增加，B220⁺細胞比例降低(圖 19d)。

總而言之，Phf6^KOIdh2^R172K小鼠在 8~12 週齡時出現全血細胞減少，嗜中性白血球保留，

單核細胞(monocytes)和原始細胞(blasts)增加，以及顯著的髓外造血和骨髓發育異常特徵。

這些表型讓人聯想到人類慢性骨髓單核細胞白血病(chronic meylomonocytic leukemia)。這些 發現表明正常造血功能受到破壞，並且 8~12 週齡的 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠有白血病狀態的趨 勢。

3.4.2.5. 在小鼠體內，Phf6^KO和 Idh2^R172K協同驅動早期致癌轉化

為了測試 PHF6 和 IDH2 突變是否對白血病發生具有協同作用，本論文追蹤觀察了一組 WT、Phf6^KO、Idh2^R172K和 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠的存活率。在中位追蹤 363 天後，

Phf6^KOIdh2^R172K小鼠 (N=9) 的生存期顯著縮短，而其他小鼠仍然都保持健康(圖 20a)。在因

得病犧牲時，Phf6^KOIdh2^R172K 小鼠出現貧血(圖 20b)和血小板計數減少(圖 20c)。所有 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠都表現出脾腫大(圖 20d)。9 隻 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠中有 5 隻胸腺腫 大，2 隻淋巴結腫大(圖 21 5a，b)。犧牲達到早期終點小鼠的，收集其脾臟、胸腺和淋巴結 腫大進行病理學檢查，發現腫瘤細胞浸潤增加，且具有細小的染色質和核仁(圖 20e 和圖 21 5c，d)。脾臟的 IHC 染色顯示，9 隻小鼠中有 5 隻顯著浸潤 CD117 陽性髓細胞(圖 20f)，與 急性骨髓性白血病的特徵一致。透過流式細胞術對脾臟的進一步分析顯示，T 細胞淋巴樣腫 瘤，由 CD4/CD8 雙陽性異常所定義，在 9 隻小鼠中有 5 隻(圖 20g)，和具有 CD19^-/B220^dim+

異常的 B 細胞腫瘤，在 9 隻小鼠中有 4 隻(圖 20h)。胸腺腫瘤和腫大淋巴結的流式細胞術也 分別顯示具有 T 和 B 細胞譜系的腫瘤細胞(圖 21c、d)，其中有 4 隻垂死的小鼠同時出現 AML 以及 T 和/或 B 細胞腫瘤(圖 21e)。

為了測試早期致癌轉化是否可經由骨髓移植轉移至接受骨髓的小鼠，接續進行了競爭性 再增殖單位測定(圖 22a)。本論文發現 Phf6^KO和 Phf6^KOIdh2^R172K小鼠骨髓細胞能夠勝過 WT

骨髓細胞，達到較高的宿主嵌合比例 (Chimerism) (圖 20i)。移植後八週，移植了

Phf6^KOIdh2^R172K 骨髓細胞的受體小鼠的血像顯示顯著貧血、單核細胞增多症(圖 22b)和骨髓

分化偏向(圖 22c)。中位追蹤時間為 239 天時，移植了 Phf6^KOIdh2^R172K骨髓細胞的受體小鼠 存活時間顯著縮短，並發展為 CD117 陽性細胞增加的髓系腫瘤 (Myeloid neoplasm) (圖 20j 和圖 22d)。這些結果顯示，同時發生的 Phf6 和 Idh2 突變協同驅動體內早期發病的現象是可 移植的，並且足以導致致命的造血系統惡性腫瘤。