國立臺灣大學醫學院臨床醫學研究所 博士論文
Graduate Institute of Clinical Medicine College of Medicine
National Taiwan University Doctoral Dissertation
PHF6 在正常和惡性造血中的作用
The roles of PHF6 in normal and malignant hematopoiesis
陳聰智
Tsung-Chih Chen
指導教授：周文堅教授,林淑華教授
Advisor: Wen-Chien Chou, MD, Ph.D., Shu-Wha Lin, Ph.D.
中華民國 112 年 02 月
Febuary 2023
誌謝
在過去的幾年裡，我很榮幸有機會參與這個項研究主題。我要感謝我的臨床指導導師周 文堅教授及田蕙芬教授，還有基礎指導導師林淑華教授，為我提供了這個機會，感謝他們在 我的整個博士生涯中給予我的支持，並感謝他們花很多時間討論我的計畫。他們對工作的奉 精神確實令人鼓舞。我還要感謝我的博士論文委員會的成員，感謝劉俊煌老師、張原翊老師 、 黃凱文老師及林家齊老師，在討會和會議上的出色建議和反饋。
我要感謝田教授及周教授實驗室的成員，在我剛加入實驗室時歡迎我進入實驗室；侯信 安老師、郭遠燁老師、李一泓博士、徐悅淳博士、林建嶔博士、陳昱任研究助理、高千珺研 究助理、袁章祖醫師、姚啟元醫師和莊博涵博士生。謝謝你們傳授你們的智慧，教我技巧，
感謝你們長久的友誼。我要感謝臺中榮總血液腫瘤科團隊，支持我持續在職研究進修，給我 巨大的幫助。
我要感謝感謝科技部國家生物技術核心設施計劃轉基因小鼠模型核心設施、國立台灣大 學基因組與精準醫學中心動物資源實驗室、國立台灣代謝組學核心實驗室提供的技術服務大 學基因組醫學中心和國家基因組醫學中心。本論文感謝中央研究院分子生物學研究所基因組 學核心設施的技術幫助。本論文要感謝台大醫院流式細胞儀分析和分類核心設施和台大醫學
院第一核心實驗室提供的服務。我的研究得到了台中榮總院內研究資助 (TCVGH-1093702B、TCVGH-1103701B)，台灣科技部研究資助（MOST
106-2314-B-002-224-MY3、MOST 106-2314-B-002-152-、MOST
107-2314-B-075A-010- 、MOST 108-2314-B-075A-007-、MOST 109-2314-B-002 -221 -), 和衛生和福利部(MOHW109-TDU-B-211 -134009)等研究資助。
最後，我要感謝我的家人。特別是我的太太，悉心照顧小孩和家庭。感謝我的父母和兄 弟；感謝你們無條件的愛和支持！感謝我博士期間的同學及好友，感謝你們的友誼和支持。
中文摘要
人類 PHF6 基因位於 X 染色體上，和轉譯調控與染色質重塑相關。它在人類和小鼠 的 中樞神經系統、B 和 T 細胞中都有很高的表現量。遺傳性的 PHF6 突變會導致一 種罕見的 X-染色體相關的萊曼綜合症(BFLS)。這個症狀的表現包括特殊的臉部特徵和智能低下。依目 前文獻顯示 BFLS 可能是一個容易產生癌症的症狀。同時，體細胞的 PHF6 的突變也在成人 急性 T 淋巴芽細胞白血病(T-ALL)中被發現，發生率大約有 11%到 39.5%。大部分的 PHF6 突變包含缺失、遺傳密碼位移突變、無譯或錯譯突變，因此 PHF6 突變被認為會造成基因失 效。PHF6 突變也在其他腫瘤中被發 現，例如急性骨髓性白血病、骨髓分化不良症侯群、肝 細胞癌等，然而突變的比例 很少。目前 PHF6 在活體內的病理生理學角色仍尚待研究。
在一個藉由 shRNA 基因抑制的研究中發現，PHF6 在 T-ALL 中是扮演抑癌基因的角色，
而在急性 B 淋巴芽細胞白血病(B-ALL)中是致癌基因。在 B-ALL 細胞中剔除 Phf6，會導致與 正常 B 細胞發育和功能相關的基因表現下降，而與 T 細胞信息傳 導相關的基因表現上升。
這些結果顯示 Phf6 的功能是情境依賴式的(context- dependent)。基於有很高比例的 T-ALL 病人有 PHF6 突變，所以本論文假設 PHF6 會影響 T 細胞的發育、分化與功能活化及可在血 液腫瘤生成中扮演腫瘤抑制基因的角色。這個研究最大的限制是缺乏 Phf6 突變的小鼠模型。
為了解決這個問題，本論文以 CRISPR/cas9 system 研發了一個新創的條件式 Phf6 剔 除的小鼠。本論文研究結果顯示，與野生型同窩小鼠相比，8 週齡的 Phf6 剔除小鼠外週血中 CD4+和 CD8+ T 細胞的數量減少。在 8 週至 12 週齡的 Phf6 剔除小鼠的骨髓中，骨髓單核細 胞前驅細胞(granulocyte-monocytic progenitors)減少，但 Lin-c-Kit+Sca-1+細胞增加。功能研 究，包括競爭性再增殖單元和連續移植試驗，揭示了 Phf6 剔除的造血幹細胞(HSC)有增強重 建和自我更新能力。18 個月大的 Phf6 基因剔除小鼠表現出類似骨髓分化不良症候群，包括 血小板計數減少、巨核細胞發育不良和與髓外造血相關的脾臟腫大。此外，本論文發現 Phf6 缺失至少部分通過增加白血病起始細胞，降低了 NOTCH1 誘導的白血病轉化的閾值。對骨髓 造血幹細胞(hematopoietic stem cells) 亞群的轉錄組分析揭示了上調的細胞週期和致癌功 能，以及這些途徑中關鍵基因表達的改變。綜上，本論文的研究表明 Phf6 在生理和惡性造血 中的體內關鍵作用。
本論文研究結果顯示條件式 Phf6 剔除小鼠，在 18 個月大時，並不會產生白血病，因此 假設需要第二個突變才會導致白血病。急性白血病的發病機制涉及遺傳改變之間的相互作
用。IDH1/2 和 PHF6 的突變在一些造血系統惡性腫瘤患者中很常見並且共存，但它們的協同 作用仍未得到探索。本論文進一步繁殖出同時具有 PHF6 和 IDH2R172K突變的小鼠來探討此 問題。結果發現共同突變的 Phf6KOIdh2R172K小鼠表現出偏向骨髓譜系的造血分化(biased hematopoietic differentiation toward myeloid lineages)，並減少了長期造血幹細胞(long-term hematopoietic stem cells)。與單突變和野生型小鼠相比，它們迅速發展出骨髓性和淋巴性相 關的腫瘤，存活時間縮短許多。與攜帶 Idh2R172K的小鼠相比，共同突變的小鼠其骨髓和脾細 胞產生的 2-羥基戊二酸量(2-hydroxyglutarate)顯著增加。單細胞 RNA 測序揭示了來自共同 突變小鼠的造血幹/前驅細胞轉錄組的不同模式，包括代謝酶的異常表達、幾種癌基因的表達 增加和 DNA 修復受損，本論文透過骨髓和脾細胞中增強的γH2AX 表達證實 DNA 修復受損，
且 Idh2 和 Phf6 突變在白血病發生中具有協同作用，至少通過 2-羥基戊二酸的過量產生和 DNA 修復受損。
總結來說，在我的博士班研究中，我發現了 PHF6 的許多功能，這些功能對其在血液惡 性腫瘤中的作用很重要，包括它作為 HSC 和前驅細胞增殖的負調節劑的作用以及它作為腫瘤 抑制物的作用。
關鍵字：PHF6 突變，T 淋巴芽細胞白血病，腫瘤抑制基因，小鼠模型
英文摘要
Human PHF6 (plant homeodomain (PHD) finger 6), located in X chromosome, is involved in transcriptional regulation and chromatin remodeling. It is highly expressed in the central nervous system as well as B- and T-lymphoid cells in human and mice, involved in multiple physiological pathways through chromatin regulation by interaction with the nucleosome remodeling and deacetylation (NuRD) complex. Germline mutations of PHF6 lead to Borjeson-Forssman- Lehmann syndrome (BFLS), which is a rare X-linked disorder with distinctive facial features and mental retardation. Although less than 30 cases of BFLS with PHF6 mutations have been reported, two patients with BFLS developed T-cell acute lymphoblastic lymphoma (T-ALL) and Hodgkin lymphoma, respectively. These observations indicate that BFLS may be a cancer predisposition syndrome. Meanwhile, the somatic PHF6 mutations were found in adult T-ALL patients with an incidence from 11% to 39.5%. The mutations mainly consist of deletions,
frameshifts, nonsense mutations, or missense mutations, indicating a loss of function. The PHF6 mutations were also reported in other neoplasms, such as acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, myelodysplastic syndromes, and hepatocellular carcinoma, albeit with much lower incidences. However, the functions of PHF6 in physiological hematopoiesis and leukemogenesis remain incompletely defined.
To address this problem, this study developed a novel conditional Phf6 knock out mouse model through CRISPR/cas9 system. This study knocked out Phf6 specifically in hematopoietic cells. This study found that Phf6 knockout mice at 8 weeks of age had reduced numbers of CD4+ and CD8+ T cells in the peripheral blood compared with the wild-type littermates. There were decreased granulocyte-monocytic progenitors but increased Lin–c-Kit+Sca-1+ cells in the marrow of young Phf6 knockout mice. Functional studies, including competitive repopulation unit and serial transplantation assays, revealed an enhanced reconstitution and self-renewal capacity in Phf6 knockout hematopoietic stem cells (HSCs). Aged Phf6 knockout mice had myelodysplasia-like presentations, including decreased platelet counts, megakaryocyte dysplasia, and enlarged spleen related to extramedullary hematopoiesis. Moreover, this study found that Phf6 loss lowered the threshold of NOTCH1-induced leukemic transformation at least partially through increased leukemia-initiating cells. Transcriptome analysis on the restrictive rare HSC subpopulations revealed upregulated cell cycling and oncogenic functions, with
alteration of key gene expression in those pathways. In summary, our studies show the in vivo crucial roles of Phf6 in physiological and malignant hematopoiesis.
The pathogenesis of acute leukemia involves interaction among genetic alterations.
Mutations of IDH1/2 and PHF6 are common and co-exist in some patients of
hematopoietic malignancies, but their cooperative effects remain unexplored. As a result, this study addressed the question by characterizing the hematopoietic phenotypes of mice harboring neither, Phf6 knockout, Idh2 R172K, or combined mutations. This study found that the combined Phf6KOIdh2R172K mice showed biased hematopoietic differentiation toward myeloid lineages and reduced long-term hematopoietic stem cells. They rapidly developed neoplasms of myeloid and lymphoid lineages, with much shorter survival compared with single mutated and wild-type mice. The marrow and spleen cells of the combined mutated mice produced a drastically increased amount of 2-hydroxyglutarate compared with mice harboring Idh2 R172K. Single cell RNA sequencing revealed distinct patterns of transcriptome of the hematopoietic stem/progenitor cells from the combined mutated mice, including aberrant expression of metabolic enzymes, increased expression of several oncogenes, and impairment of DNA repairs, as confirmed by the enhanced γH2AX expression in the marrow and spleen cells. These results conclude that Idh2 and Phf6 mutations are synergistic in leukemogenesis, at least through overproduction of 2-hydroxyglutarate and impairment of DNA repairs.
In conclusion, during my PhD projects I have discovered a number of functions of PHF6 that are important for its role in hematological malignancies, including its role as a negative regulator of HSC and progenitor proliferation and its function as a tumor
suppressor.
Key words : PHF6 mutation, T-cell lymphoblastic leukemia, tumor suppressor gene, mouse model
目 錄
口試委員會審定書………..………….…………...i
誌謝………..………ii
中文摘要……….………iii
英文摘要……….……….v
第一章 緒論(Introduction).………..……….1
1.1 前言………..………1
1.2 文獻回顧………..……….…...2
1.2.1 PHF6的細胞功能………...………...2
1.2.2 PHF6基因剔除小鼠動物模型………...………...3
1.2.3 IDH2和PHF6突變的關聯………...………..3
1.2.4 與IDH2和PHF6相關的急性骨髓性白血病(AML)發病機制………...…...4
1.3 研究的問題及其重要性………...……….………5
1.3.1 PHF6 對正常造血的作用……….………..5
1.3.2 PHF6 在惡性造血中的作用………6
1.4 研究的假說與特定目的………..…..6
1.4.1 假說 1：PHF6 在正常造血系統的作用……….………..6
1.4.1.1 探索 Phf6 對正常造血的作用………..………..……6
1.4.1.2 研究 Phf6 在造血系統功能挑戰中的作用………7
1.4.2 假說 2：PHF6 在惡性造血中起作用……….………..7
1.4.2.1 通過觀察小鼠的長期表型來測試 PHF6 在惡性造血中的作用….…..…..8
1.4.2.2 通 ICN 的逆轉錄病毒表達測試 PHF6 和細胞內 ICN1 的相互作用……...8
1.4.3 假說 3：PHF6 突變與 IDH2R172K突變協同誘導白血病發生……...8
1.4.3.1 觀察紀錄 PHF6 突變加 IDH2R172K突變對正常造血功能的影響.…….….9
1.4.3.2 觀察紀錄 PHF6 突變加 IDH2R172K突變對惡性造血功能的影響….…..…9
1.4.4 假說 4：PHF6 突變加 IDH2R172K突變協同誘導腫瘤發生的分子機制………....…9
1.4.4.1 檢查血清代謝物以探索造血系統惡性腫瘤早發的基礎機制……….…...9
1.4.4.2 進行單細胞 RNA 測序(scRNA-seq)………...…9
1.4.4.3 測試骨髓細胞中與 DNA 穩定性有關的機制………....……9
第二章 材料與方法(Materials and methods)……….………10
2.1 動物模型………...……….…10
2.1.1 骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結的單細胞懸液製備………10
2.1.2 小鼠細胞流式細胞儀分析……….……...10
2.1.3 精緻骨髓細胞的流式細胞儀分析………..…….10
2.1.4 精緻 T 細胞的流式細胞儀分析………...………11
2.1.5 小鼠血液和組織採集………..……….12
2.2 骨髓移植和競爭性骨髓移植試驗(Competitive repopulation unit assay)……...…….12
2.3 系列骨髓移植試驗(Serial transplantation assay)………..…..12
2.4 組織學和病理學分析………..………12
2.5 細胞內 NOTCH1(ICN1)的逆轉錄病毒轉導………13
2.6 白血病起始細胞(leukemia initiating cells, LIC)的有限稀釋分析………13
2.7 Immunoblotting 和 immunohistochemistry……….………13
2.8 RT-qPCR 分析……….………14
2.9 RNA 測序和分析...………...………..14
2.10 質譜儀(Mass spectrometry)分析……….…...14
2.11 單細胞測序分析(Single cell sequencing analysis)……….………..15
2.12 10x Genomics 單細胞 RNA 測序數據預處理和分析………..………15
2.13 統計分析……….……….16
第三章 結果(Results).………17
3.1 培育 Phf6 條件性剔除小鼠……….….………..17
3.2 PHF6 對正常造血的作用………..…….17
3.2.1 Phf6 條件性剔除(KO)在穩態下會增加造血幹細胞和前驅細胞………17
3.2.2 Phf6 KO 小鼠週邊血細胞的淋巴細胞生成存在顯著偏差……….……….17
3.2.3 Phf6 KO 干擾體內 T 細胞發育………...18
3.2.4 Phf6 在造血系統功能挑戰中的作用……….……….18
3.3 PHF6 在惡性造血中的作用……….……..18
3.3.1 在老年 Phf6KO小鼠中發現脾臟腫大並伴有明顯的淋巴細胞減少和血小板減少 ………..…18
3.3.2 老年 Phf6KO小鼠無明顯血液腫瘤，但有骨髓分化不良的症狀………….…….19
3.4 PHF6 與白血病發生中其他遺傳變異的相互作用………..19
3.4.1 與細胞內 NOTCH1 (ICN1)的相互作用………..…………..19
3.4.1.1 Phf6 缺失降低了 NOTCH1 誘導的白血病的閾值……….…………19
3.4.1.2 細胞週期和致癌功能的表達增加，是改變誘導白血病途徑中的關鍵因素….20 3.4.2 Phf6KO與 Idh2R172K的交互作用………..………20
3.4.2.1 培育 Phf6KOIdh2R172K小鼠………..………..…………..20
3.4.2.2 Phf6KOIdh2R172K小鼠在年輕時外周血中有明顯的白細胞減少和貧血..21
3.4.2.3 Phf6KOIdh2R172K小鼠週邊血中 B220+、CD4+和 CD8+細胞顯著減少….21 3.4.2.4 在年輕時，Phf6KOIdh2R172K小鼠罹患了慢性骨髓單核細胞白血病樣疾病 (chronic myelomonocytic leukemia-like disease)………...…..21
3.4.2.5 在小鼠體內，Phf6KO和 Idh2R172K協同驅動早期致癌轉化…………....22
3.5 Phf6KO和 Idh2R172K聯合突變誘導腫瘤發生的分子機制………..……..…..23
3.5.1 在 Phf6KOIdh2R172K小鼠中 2-HG 的顯著增加，是透過 Idh2R172K mRNA 和蛋白質表達增加 ………..………23
3.5.2 單細胞 RNA 測序揭示了 Phf6KOIdh2R172K小鼠異常的血球生成和代謝酶基因 表達改變………...………..23
3.5.3 Phf6KOIdh2R172K小鼠的骨髓前驅細胞中，有高表達關鍵致癌基因………….25
3.5.4 Phf6KOIdh2R172K小鼠的骨髓 HSPC 中，DNA 修復受損……….…..25
第四章 討論(Discussion).………...………..….27
4.1 建立獨特造血細胞特異性 Phf6 剔除小鼠………..…..27
4.2 Phf6 缺失的 HSC 與野生型 HSC 相比具有更強的重建能力………..………27
4.3 Phf6 缺失的 HSC 可以加快引起 NOTCH1 誘導的轉化……….…….27
4.4 Phf6 缺失造成差異表達基因與 HSPCs 生物學功能之間的關聯………...…………28
4.5 Phf6 功能喪失和新形態 Idh2 突變協同作用產生造血惡性腫瘤………..…..28
4.6 IDH2 突變和 PHF6 功能喪失突變的協同效應是透過大幅增加 2-HG 和 DNA 修復受損.29 4.7 PHF6 的缺失與突變 IDH2 相互作用，通過改變基因表達來加速腫瘤發生………...29
第五章 展望(Perspectives).………...………31
5.1 PHF6 缺失引起的再增殖潛力增強的意義……….………..31
5.2 透過移植評估 HSC 功能的局限性………..………..31
5.3 PHF6 在調控免疫反應中的潛在作用………...………32
5.4 PHF6 缺失引起的造血變化如何導致白血病易感性………..……….32 5.5 PHF6 突變在腫瘤維持中的作用………..…….33
圖目錄
圖 1：PHF6 基因和蛋白質結構域結構………..………..34
圖 2：使用 CRISPR/Cas9 基因組編輯策略，培育 Phf6 floxed 小鼠………... 35
圖 3：西方墨點法(Western blotting)顯示 Phf6KO小鼠的骨髓、胸腺和脾臟中幾乎完全缺失 Phf6 蛋白………...……….……….…….37
圖 4：Phf6 條件性剔除(KO)導致 8 至 10 週小鼠的淋巴生成異常………..………..38
圖 5：在基礎狀態下，8-10 週小鼠造血幹細胞和前驅細胞組成………..…..39
圖 6：Phf6 剔除導致淋巴球比例異常………..40
圖 7：Phf6KO小鼠胸腺中 CD4 和 CD8 雙陰性(DN)細胞的比例………43
圖 8：骨髓移植測定(Bone marrow transplantation assay)結果……….44
圖 9：老年的的 Phf6KO和野生型小鼠血像圖……….……….………45
圖 10：老年的 Phf6KO和野生型小鼠病理分析……….………..……….47
圖 11：Phf6 缺失和 ICN1 過表達的協同作用………..………49
圖 12：Phf6 缺失增強了 HSPC 的分化和細胞週期相關功能………..………..51
圖 13：培育 Phf6KOIdh2R172K小鼠和基因分型……….53
圖 14：在 8 週至 12 週齡時，Phf6KOIdh2R172K、Phf6KO、Idh2R172K和野生型小鼠週邊血中血 像圖和網織紅細胞(reticulocyte)計數………..……..……..54
圖 15：在 8 週至 12 週齡時，Phf6KOIdh2R172K、Phf6KO、Idh2R172K和野生型小鼠週邊血中流 式細胞儀分析圖………...………..…………55
圖 16：在 8 週至 12 週齡時，Phf6KOIdh2R172K小鼠週邊血中 B220+、CD4+和 CD8+細胞減 少………..……….…..56
圖 17：Phf6KO和 Idh2R172K的組合導致在 8 至 12 週時，小鼠產生慢性骨髓單核細胞白血病 樣表型………..……….………..………57
圖 18：Phf6KOIdh2R172K小鼠骨髓病理分析……….59
圖 19：脾臟組織學和流式細胞學分析……….……….………61
圖 20：Phf6KOIdh2R172K小鼠早期發生血液腫瘤……….…63
圖 21：罹患腫瘤小鼠的病理分析……….……….…………65
圖 22：正常小鼠接受 Phf6KOIdh2R172K小鼠骨髓移植後，骨髓分化異常且發展為急性髓性白 血病……….………67 圖 23：Phf6KOIdh2R172K小鼠中 Idh2R172K mRNA 和蛋白質的高表達導致癌代謝物 2-HG 急劇
升高………..……….………..……69
圖 24：單細胞 RNA 定序實驗工作流程………...…………..………..71
圖 25：四種基因型小鼠的單細胞轉錄組分析顯示造血功能和代謝酶表達變化……….73
圖 26：四種基因型小鼠的 Lin-c-Kit+細胞中代謝酶表達量分析…...75
圖 27：與野生型小鼠相比，Phf6KOIDH2R172K小鼠中的 HSC/MPP 細胞群具不同轉錄模式..77
圖 28：Phf6KOIDH2R172K小鼠中的致癌基因表達增加且 Trp53 表達降低………79
圖 29：年輕的 Phf6KOIDH2R172K小鼠細胞中γH2AX 增加………..………80
參考文獻(References)……….……...………81
附錄：個人在修業期間所發表之論文清冊……….………90
第一章、緒論(Introduction) 1.1 前言
Plant homeodomain (PHD)(Affolter, Schier et al. 1990) finger 6 (PHF6)基因的種系突 變(germline mutation)是與 Börjeson-Forssman-Lehmann 綜合症(BFLS), (Lower, Turner et al. 2002)相關罕見的 X 連鎖疾病(X-linked disorder)。BFLS 的表型包括中度至重度智力低下、
癲癇、性腺機能減退、代謝減退、伴有明顯男性乳房發育的肥胖、面部皮下組織腫脹、瞼裂 狹窄和大但不變形的耳朵(Borjeson, Forssman et al. 1962)。根據文獻報導，有一個 9 歲 BFLS 的男孩，他在 2010 年發展為 T-細胞急性淋巴性白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)(Chao, Todd et al. 2010)。另一個 16 歲的 BFLS 男性青少年，發展為霍奇金淋巴瘤 (Hodgkin lymphoma)(Carter, Picketts et al. 2009)。雖然文獻中報導的具有 PHF6 突變的 BFLS 病例不到 30 例，但這些觀察結果顯示 BFLS 是一種癌症易感綜合症。同時，最近在兒 童和成人 T-ALL 中發現了 PHF6 的體細胞突變(somatic mutations)，發病率分別為 16% 和 38% (Van Vlierberghe, Palomero et al. 2010)。隨後在其他的報導中，陸續報導了成人 T-ALL 中的 PHF6 突變，發生率從 11% 到 39.5%不等(Holmfeldt and Mullighan 2010, Wang, Qiu et al. 2011, Yoo, Kim et al. 2012, Grossmann, Haferlach et al. 2013, Huh, Lee et al. 2013, Neumann, Vosberg et al. 2015, Li, Xiao et al. 2016, Zhou, Gu et al. 2017)。其他腫瘤中，如 急性髓性白血病(Van Vlierberghe, Patel et al. 2011)，慢性骨髓細胞白血病(Li, Yao et al.
2013)，骨髓分化異常症候群(Myelodysplastic syndrome)(Kunze, Gamerdinger et al. 2014) 和肝細胞癌(Yoo, Kim et al. 2012)，也都具有 PHF6 突變，儘管頻率低得多。突變模式是多 樣性的，包括：整個編碼序列的點突變(point mutations throughout the coding sequence)、
缺失(deletion)和插入(insertion)，顯示基因功能喪失。因此，Phf6 可視為抑癌基因。
PHF6 蛋白包含具有兩個 ZaP 結構域的“非典型 PHD”指：胺基酸 14-134 中的 ZaP1 和 胺基酸 209-332 中的 ZaP2(Todd and Picketts 2012)。ZaP 是一種蛋白質結構域，由一個鋅 指關節和一個非典型 PHD 組成領域。它源自 PZP 基序，該基序由一個 PHD 結構域、一個 鋅指節(zinc knuckle)和一個非典型 PHD 結構域組成(Perry 2006)。所有含有 PZP 基序的蛋 白質都與組蛋白甲基化和/或基因沉默有關(Perry 2006)。PHF6 的每個鋅指結構域都是這種結 構的簡併版本，因為它們僅由 C2HC 鋅指和 C4HC2H 非典型 PHD 結構域(ZaP)組成(Todd and Picketts 2012)。PHF6 蛋白也有兩個核定位信號(NLS1: aa 13-16; NLS2: aa 129-133) 和一個核仁定位序列 (NoLS: 157-169)(圖 1)(Kent, Sugnet et al. 2002, Todd, Ivanochko et
al. 2015)。根據蛋白質的這些特定成分，推測 PHF6 蛋白的功能是與轉錄調控(transcriptional regulation)和染色質重塑(chromatin remodeling)有相關(Lower, Turner et al. 2002, Voss, Gamble et al. 2007)。
1.2 文獻回顧(Literature review) 1.2.1 PHF6 的細胞功能
PHF6在小鼠胚胎發育過程中在整個中樞神經系統會高度表達，並且在人類成人B和T淋 巴細胞中也有發現(Todd, Ivanochko et al. 2015)。最近的幾項研究揭示了PHF6蛋白的分子機 制，發現PHF6蛋白可能有助於神經發生和造血的發育過程(Ferrando, Neuberg et al. 2002, Van Vlierberghe, Palomero et al. 2010, Van Vlierberghe, Patel et al. 2011, Zhang, Mejia et al. 2013)。
在最近對人類細胞株的功能分析中，PHF6 ZaP2結構域被證明能夠以與序列無關的方式 結合雙鏈DNA模板(Liu, Qin et al. 2012)。Todd等人證明PHF6蛋白可以與核小體重塑和去乙 酰 化(NuRD)複合物(CHD4、HDAC1和RBBP4)的多種成分共同純化(Todd and Picketts 2012)，它是一種轉錄調節因子，具有影響胚胎發生的幾個基因靶點、腫瘤發生、神經發生和 造血。與NuRD 的關聯表明PHF6在染色質調節中起作用。王等人發現PHF6定位於核仁，直 接與上游結合因子(UBF)相互作用，並通過影響UBF的蛋白質水平抑制核醣體RNA (rRNA)轉 錄(Wang, Leung et al. 2013)。此外，PHF6缺乏導致受損細胞增殖、細胞週期停滯在G2/M 期及rDNA基因座處的DNA 損傷增加。此外，張等人發現Phf6的剔除嚴重損害了體內小鼠大 腦皮層的神經元遷移，導致白質異位和神經元過度興奮的形成(Zhang, Mejia et al. 2013)。該 團隊還發現Phf6與RNA聚合酶 II相關轉錄延伸複合物中的因子1(PAF1)相關(Zhang, Mejia et al. 2013)。總之，PHF6是一種高度動態的染色質銜接蛋白，包含兩個促進其與核酸相互作用 的ZaP結構域和越來越多的相互作用夥伴(NuRD、PAF1、UBF)來調節轉錄(Zhang, Mejia et al.
2013)。這些現象需要進一步的研究來闡明含有PHF6的複合物的複雜轉錄作用。
在一項在小鼠 B 細胞白血病模型中對調節劑進行基因組規模小髮夾 RNA (shRNA) 篩查 的研究表明，抑制 Phf6 實際上減緩了體內環境中 B 細胞 ALL 的疾病進展(Meacham, Lawton et al. 2015)。其他研究表明，在 T-ALL 中靶向 PHF6 的 microRNA 可加速小鼠模型和人類 T-ALL 細胞系中 T-ALL 的進展(Mavrakis, Van Der Meulen et al. 2011, Mets, Van Peer et al.
2014)。因此，PHF6 被認為是一種“譜系特異性(lineage-specific) ”的抑癌基因，在發育不同
的造血系統惡性腫瘤中起相反的作用。此外，文獻顯示(Soto-Feliciano, Bartlebaugh et al.
2017)，小鼠 B 細胞白血病中 Phf6 缺失也會導致參與正常 B 細胞發育和功能的基因顯著下 調，而上調參與 T 細胞信號傳導相關基因的調節，並在體內引起混合譜系淋巴瘤
(mixed-lineage lymphoma)。該團隊證明，基因表達的系統性變化是由 B 細胞白血病中 Phf6 的缺失引起的，這改變了 B 細胞和 T 細胞特異性因子轉錄起始位點的染色質架構(chromatin landscape)。
1.2.2 PHF6基因剔除小鼠動物模型
為了解決白血病中 PHF6 突變的發病機制，一些研究團隊透過 CRISPR/Cas9 基因編輯 生成了一些條件性 Phf6 剔除(KO)小鼠模型。Phf6 基因在造血細胞中被特異性剔除的小鼠是 通過將兩側帶有 loxP 位點的 Phf6 基因（雌性小鼠中的 Phf6f / f和雄性小鼠中的 Phf6f / Y）與 Cre 轉基因小鼠配種而產生的。該團隊透過移植試驗發現，與野生型 HSC 相比，Phf6 缺失 的造血幹細胞(HSC) 具有更強的重建能力(McRae, Garnham et al. 2019, Miyagi,
Sroczynska et al. 2019, Wendorff, Quinn et al. 2019)。在 Wendorff 等人(Wendorff, Quinn et al. 2019)和 Miyagi 等人(Miyagi, Sroczynska et al. 2019)的研究中，Phf6 剔除增強了 HSC 的 自我更新能力。此外，McRae 等人 (McRae, Garnham et al. 2019)發現 Phf6 缺失影響早期 T 細胞分化，但對發育中的 B 細胞數量沒有影響細胞或骨髓細胞或成熟血細胞群。然而，本 論文在 2016 年透過 CRISPR/Cas9 基因編輯製造出條件 Phf6 剔除(KO)小鼠模型，與前面提 到的模型相比，採用不同的策略(Hsu, Chen et al. 2019)。本論文主要將 Phf6 基因之外顯子 2 到外顯子 11 兩側嵌入 loxP 序列(雌性小鼠的 Phf6f/f和雄性小鼠的 Phf6f/Y)，隨後與 Vav1-cre 轉基因小鼠配種繁殖，從而在造血細胞中特異性剔除 Phf6 基因。本論文利用這種新模型來研 究 PHF6 在正常和惡性造血中的作用。
1.2.3 IDH2和PHF6突變的關聯
急性髓性白血病(AML)的發病機制涉及複雜且相互作用的基因改變。白血病發病之前通 常會在白血病前造血幹細胞和祖細胞(HSPC)中積累體細胞突變，這些突變會經歷克隆擴增並 獲得額外的突變。(Corces-Zimmerman, Hong et al. 2014, Shlush, Zandi et al. 2014)在白血 病發生改變的基因中，PHF6 被稱為腫瘤抑制基因，在成人 T 淋巴細胞白血病中具有
18.6%~38%的功能喪失突變(Holmfeldt and Mullighan 2010, Van Vlierberghe, Palomero et
al. 2010, Wang, Qiu et al. 2011)，2.8%~3.2% 在原發性 AML (Van Vlierberghe, Patel et al.
2011, Patel, Gonen et al. 2012, de Rooij, van den Heuvel-Eibrink et al. 2016, Mori, Nagata et al. 2016)，在伴有骨髓增生異常相關變化的 AML 中高達 15.4% (Mori, Nagata et al. 2016)。
急性白血病的發病機制涉及遺傳改變之間的相互作用。IDH1/2 和 PHF6 的突變在一些造 血系統惡性腫瘤患者中很常見並且共存。AML 病例的發病通常先於經歷克隆擴增(clonal expansion)的白血病前造血幹細胞和祖細胞 (HSPC) 中體細胞突變的積累
(Corces-Zimmerman, Hong et al. 2014, Shlush, Zandi et al. 2014)。在最近的大型縱向世代 研究中，已知 PHF6 突變和 IDH1/2 突變存在於白血病前期的 HSPC 中(Abelson, Collord et al.
2018, Desai, Mencia-Trinchant et al. 2018, Hartmann and Metzeler 2019)。在一項研究中，
所有參與者只要具有 TP53 (n=21 out of 21)、IDH1 或 IDH2 (n=15 out of 15)或 RUNX1 伴隨 PHF6 (n=3，共 3)，在中位追蹤 9.6 年後，最終皆發展為 AML(Desai, Mencia-Trinchant et al. 2018)。然而，PHF6 突變與其他突變在白血病發生中是否存在協同作用仍有待確定。
1.2.4 與IDH2和PHF6相關的急性骨髓性白血病(AML)發病機制
IDH1 和 IDH2 是檸檬酸循環中的關鍵代謝酶。它們分別在細胞質中和線粒體中催化異檸 檬酸轉化為α-酮戊二酸(αKG)(Dang, Yen et al. 2016)。它們還在表觀遺傳調控、氧化還原狀 態和 DNA 修復中發揮重要作用(Kirkman, Rolfo et al. 1999, Biaglow and Miller 2005, Aykin-Burns, Ahmad et al. 2009, Molenaar, Maciejewski et al. 2018)。IDH1/2 突變在各種惡 性腫瘤中被發現，包括膠質瘤、膽管癌、軟骨肉瘤、AML 和其他骨髓腫瘤(Mardis, Ding et al.
2009, Kosmider, Gelsi-Boyer et al. 2010, Chou, Lei et al. 2011, Cairns and Mak 2013, Lemonnier, Cairns et al. 2016)。 IDH1 活性殘基突變（active residues，即 IDH1R132、
IDH2R140 或 IDH2R172）導致正常酶功能喪失並獲得源自αKG 的致癌代謝物 D-2-羥基戊二酸
(2-HG)的新形態活性(Dang, White et al. 2009, Ward, Patel et al. 2010)。隨後 2- HG 通過抑 制αKG 依賴性雙加氧酶（包括組蛋白和 DNA 去甲基化酶）導致表觀遺傳失調，DNA 高甲 基化和細胞分化受阻(Xu, Yang et al. 2011, Koivunen, Lee et al. 2012)。此外，癌細胞中 IDH1/2 功能喪失或減少可通過氧化還原狀態擾動的間接影響和抑制參與 DNA 修復的αKG 依賴性雙加氧酶的直接影響，導致 DNA 損傷和基因組不穩定(Mallette, Mattiroli et al. 2012, Young, McDonald et al. 2013, Wang, Wu et al. 2015, Chen, Bian et al. 2017, Sulkowski, Corso et al. 2017, Molenaar, Maciejewski et al. 2018)。例如，癌代謝物 2-HG 直接抑制 DNA
修復酶 alkB 同源物(ALKBH)(Wang, Wu et al. 2015, Chen, Bian et al. 2017) ，和 DNA 損傷 反應(DDR)蛋白賴胺酸特異性去甲基化酶 4A/B (KDN4A/B)(Mallette, Mattiroli et al. 2012, Young, McDonald et al. 2013, Sulkowski, Corso et al. 2017)，並抑制 DNA 損傷反應蛋白 ATM 的表達(Sulkowski, Corso et al. 2017)。基於這些缺失，已經開發出具有潛在益處的新 治療方式，包括 IDH1/2 抑制劑和 DDR 抑制劑(Molenaar, Maciejewski et al. 2018)。FDA 已 批准用於患者的 IDH1/2 抑制劑復發/難治性 AML 攜帶突變，一些臨床前試驗也顯示 DDR 通 路抑制劑在治療中的合成致死作用治療 IDH1/2 突變腫瘤(Sulkowski, Corso et al. 2017, Molenaar, Radivoyevitch et al. 2018)。
文獻上已有幾種基因編輯小鼠模型主導在造血組織中表達 IDH1R132H 或
IDH2R140Q/R172K。這些原癌基因突變與其他突變一起或與其他突變結合表達，例如 FMS 樣酪
胺酸激酶 3 內部串聯重複(Flt3-ITD)和 Nras，足以引發血液系統惡性腫瘤(Sasaki, Knobbe et al. 2012, Chen, Liu et al. 2013, Kats, Reschke et al. 2014)。然而，在單獨 IDH1/2 突變的模 型中，腫瘤的長潛伏期和不完全外顯率，表明需要二次突變來驅動腫瘤進展(Sasaki, Knobbe et al. 2012, Chen, Liu et al. 2013, Kats, Reschke et al. 2014)。
PHF6 突變在白血病發生中的機制及其在 DNA 損傷修復中的潛在治療脆弱性仍然未知。
PHF6 蛋白已知是 DNA 損傷後 ATM 和 ATR 激酶的下游靶標(Matsuoka, Ballif et al. 2007)。
在 HEK293T 細胞和 HeLa 細胞中 PHF6 的短髮夾 RNA 弱化，可導致γH2AX 的積累，表明 雙鏈 DNA 損傷(Van Vlierberghe, Palomero et al. 2010, Wang, Leung et al. 2013)。IDH1/2 和 PHF6 突變在骨髓腫瘤中具有顯著關聯，並且具有增加 DNA 損傷的常見細胞後果。此外，
IDH2R172K與 PFH6 突變一樣，在骨髓和淋巴腫瘤中均有報導。然而，尚未報導 Phf6 和 IDH2
突變(IDH2R172K)在白血病發生中的合作及其在靶向 DNA 損傷修復途徑的治療策略中的作用。
1.3 研究的問題及其重要性
1.3.1 PHF6 對正常造血的作用
在 2016 年，尚無 Phf6 突變的小鼠體內模型探索其正常造血的生理作用。為了解決這個 問題，本論文通過 CRRISPR/cas9 方法通過 LoxP 和 Cre 重組酶生成了一種新的條件 Phf6 剔除(KO) 小鼠模型。本論文的研究目的是通過生成造血細胞特異性 Phf6 剔除小鼠來闡明
PHF6 在造血中的生物學功能。本論文的模型是一個表徵 PHF6 對體內正常造血作用的新模 型。
1.3.2 PHF6在惡性造血中的作用
人類植物同源域(PHD)(Affolter, Schier et al. 1990)手指 6(PHF6)基因的種系突變與 Börjeson-Forssman-Lehmann 症候群(BFLS)相關，(Lower, Turner et al. 2002)一種罕見的 X 染色體連鎖疾病。儘管文獻中報導的 BFLS 病例不到 30 例，但兩名 BFLS 患者分別在 9 歲 和 16 歲時患上了 T 細胞急性淋巴淋巴瘤(T-ALL)和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin
lymphoma)(Carter, Picketts et al. 2009, Chao, Todd et al. 2010)。這些觀察結果暗示 BFLS 是一種癌症易感綜合症。同時，在兒童和成人 T-ALL 也發現體細胞 PHF6 突變(Holmfeldt and Mullighan 2010, Van Vlierberghe, Palomero et al. 2010, Wang, Qiu et al. 2011, Yoo, Kim et al. 2012, Grossmann, Haferlach et al. 2013, Huh, Lee et al. 2013, Neumann, Vosberg et al. 2015, Li, Xiao et al. 2016, Zhou, Gu et al. 2017, Yeh, Liang et al. 2019)。在急性髓性 白血病(AML)(Van Vlierberghe, Patel et al. 2011, Patel, Gonen et al. 2012, Przychodzen, Gu et al. 2015, de Rooij, van den Heuvel-Eibrink et al. 2016, Mori, Nagata et al. 2016)，慢 性粒細胞白血病(Li, Yao et al. 2013)和骨髓增生異常綜合徵(MDS)(Kunze, Gamerdinger et al. 2014) ，也有發現 PHF6 突變。突變模式包括貫穿整個編碼序列的點突變、缺失和插入，
皆為功能喪失突變。因此，由於失活突變，PHF6 被認為是人類 T 和髓系白血病中的抑癌基 因(tumor suppressor gene)。
為了解決白血病中 PHF6 突變的發病機制，本論文通過 CRISPR/Cas9 基因編輯生成了 第一個條件式 Phf6 剔除(cKO)小鼠模型。使用小鼠模型，本論文可以觀察活體的致白血病潛 力。此外，本論文也可用此小鼠模型測試與其他癌基因或抑癌基因的相互作用。
1.4 研究假說與特定目的
1.4.1. 假說 1：PHF6 在正常造血系統的作用
1.4.1.1 探索 Phf6 對正常造血的作用
Phf6 在 T 細胞發育和功能中的作用目前尚不清楚。由於本論文已經生成第一個條件式 Phf6 剔除小鼠模型，初步數據顯示突變型和野生型小鼠外周血中的淋巴細胞成分存在顯著差 異，本論文進一步探索 Phf6 如何調節淋巴細胞的發育和功能。先前結果發現突變型和野生型 小鼠外週血中 CD4+、CD8+和 CD220+細胞的百分比存在顯著差異，本論文將完成對 T 細胞 組成的分析，這些組成由更多標記物定義，包括 CD69、CD44、CD25 , PD-1 等。
自早期胚胎發生以來，T 細胞發育是一個連續的過程，因此，很難在體內從造血幹細胞 階段一直牽引 T 細胞發育。本論文對胸腺細胞的初步分析顯示，Phf6 KO 小鼠在 DN 階段胸 腺細胞發育顯著延遲。
本論文亦檢查 12 週和 18 個月大的 Phf6KO和野生型小鼠的淋巴器官的組織學，包括骨 髓 (BM)、胸腺、脾臟和淋巴結 (LN)。
1.4.1.2 研究 Phf6 在造血系統功能挑戰中的作用
為了評估 PHF6 在造血系統功能中的作用，本論文進一步測試 Phf6 缺失和對照組造血 細胞對功能挑戰的反應，本論文使用骨髓移植測試。可了解 1）PHF6 對各種造血群體功能 的影響，2）PHF6 在應激造血 (stress haematopoiesis) 中的作用，以及 3）能夠觀察到可 能在穩定狀態下隱藏的缺陷結果通過穩態機制進行補償。
1.4.2 假說2：PHF6在惡性造血中起作用
PHF6 失活突變是白血病的常見事件；發生在 30%的 T-ALL，3%的 AML 和 2.5%的 CML。
在 20%的混合表型急性白血病(MPAL)中也報告了 PHF6 突變。高頻率的突變顯示 PHF6 可 能在造血系統中充當抑癌因子。然而，此推測需要 PHF6 的遺傳損失實驗證明。
儘管文獻中報導的 BFLS 病例不到 30 例，但兩名 BFLS 患者分別在 9 歲和 16 歲時患上 了 T 細胞急性淋巴細胞淋巴瘤(T-ALL)和霍奇金淋巴瘤(Carter, Picketts et al. 2009, Chao, Todd et al. 2010)。這些觀察結果暗示 BFLS 是一種癌症易感綜合徵。雖然數字太低，無法推 斷 BFLS 是否是癌症易感綜合徵，但數據表明，有許多 PHF6 突變的人沒有發生血液系統惡 性腫瘤，這引發對 PHF6 突變是否會導致疾病的懷疑。另一方面，所有 BFLS 患者和異型 (heterozygous) PHF6 突變攜帶者發生血液腫瘤的風險可能增加。因此，PHF6 突變的腫瘤驅 動潛力相當重要。
1.4.2.1 通過觀察小鼠的長期表型來測試PHF6在惡性造血中的作用
為了證明 PHF6 是一種真正的腫瘤抑制因子。本論文利用單獨缺乏 Phf6 的小鼠，比較分 析缺乏 Phf6 小鼠與其同窩野生型小鼠的表現型如是否會產生腫瘤，並監測疾病結果。
1.4.2.2 通ICN的逆轉錄病毒表達測試PHF6和細胞內NOTCH1 (ICN1)的相互作 用
激活的 NOTCH1 突變是人類 T-ALL 中最常見的基因突變。據報導，在 T-ALL 中 PHF6 突變和 NOTCH1 突變顯著相關，而在其他報告中沒有顯著相關性，但 PHF6 和 NOTCH1 在 許多病例中存在共同突變。由於 PHF6 突變與人類 T-ALL 中的 NOTCH1 激活突變一起發生，
本論文分析 PHF6 的缺失是否會加速由 NOTCH1 驅動的白血病。
用 NOTCH1 的細胞內結構域(ICN1)進行逆轉錄病毒轉導的細胞移植通常用於模擬 NOTCH1 驅動的 T-ALL。為了測試 PHF6 的缺失是否對 ICN1 驅動的疾病有影響，本論文透 過分析 Phf6 缺失小鼠的骨髓造血細胞移植，獲得結論。
1.4.3 假說3：PHF6突變與Idh2R172K突變協同誘導白血病發生
Phf6 突變在淋巴發生和白血病發生中的作用仍然未知。由於本論文發現 Phf6 條件性 KO 小鼠未有明顯的血液惡性腫瘤(Hsu, Chen et al. 2019)。因此假設需要第二個異常突變 (second hit)，尤其是有效的致癌基因，以配合 Phf6 突變來驅動白血病發生。在急性骨髓性 白血病常見的突變中，本論文選擇 IDH1/2 突變作為可能的候選者，基於以下原因：(1)IDH1/2 突變常見於髓系和淋巴系惡性腫瘤，類似於 PHF6 突變(Van Vlierberghe, Palomero et al.
2010, Van Vlierberghe, Patel et al. 2011, Lemonnier, Cairns et al. 2016, Mori, Nagata et al.
2016)；(2)據報導，當與 Flt-ITD 和 NrasG12D 突變同時發生時，它們會導致侵襲性急性骨髓 性白血病(Chen, Liu et al. 2013)；(3) IDH1/2 突變的細胞後果是 DNA 高甲基化和 DNA 損傷 增加。PHF6 突變也會導致 DNA 損傷增加；(4) PHF6 突變與 IDH1/2 突變在急性骨髓性白血 病具顯著相關。
1.4.3.1 觀察紀錄PHF6突變加Idh2R172K突變對正常造血功能的影響
為了評估PHF6KO和IDH2R172K是否協同改變正常的造血功能，本論文將Phf6KO小鼠與 Idh2R172K 小鼠雜交以創建Phf6KOIdh2R172K小鼠。除了Phf6KOIdh2R172K小鼠外的同窩小鼠，包 括野生型（WT；Phf6f/f或Phf6f/Y）、Phf6KO 和Idh2R172K小鼠用作對照。
1.4.3.2 觀察紀錄PHF6突變加Idh2R172K突變對惡性造血功能的影響
為了測試 PHF6 和 IDH2 突變是否對白血病發生具有協同作用，本論文追蹤了一組 WT、
Phf6KO、Idh2R172K 和 Phf6KOIdh2R172K小鼠的存活率。
1.4.4 假說4：PHF6突變和Idh2R172K突變協同誘導腫瘤發生的分子機制 1.4.4.1 檢查血清代謝物以探索造血系統惡性腫瘤早發的基礎機制
為了探索造血系統惡性腫瘤在 Phf6KOIdh2R172K小鼠中早期發病的機制，本論文在 8~12 週齡時檢測每種基因型小鼠的血清 2-HG 相對數值，及一系列相關研究。
1.4.4.2 單細胞RNA測序(scRNA-seq)
為了進一步探索 Phf6KOIdh2R172K小鼠造血功能改變和血液腫瘤早期發病的分子機制，本 論文在小鼠 10 週時，對每種基因型小鼠的 Lin-c-Kit +骨髓細胞進行單細胞 RNA 測序
(scRNA-seq)，包括 WT、Phf6KO、Idh2R172K和 Phf6KOIdh2R172K小鼠。
1.4.4.3 測試骨髓細胞中與DNA穩定性有關的機制
DNA 修復機制的損傷可能在腫瘤發生中具重要作用。本論文分析 4 種基因型中涉及 DNA 穩定性的基因及相關的機制。
第二章、材料與方法(Materials and methods) 2.1 動物模型
動物實驗均按照台灣大學醫學院 IACUC 進行。本研究使用之小鼠如下，Phf6KO小鼠代 表 vav1-cre; Phf6fl/Y小鼠和 vav1-cre；Phf6fl/fl小鼠，以及野生型小鼠代表 Phf6fl/Y小鼠和 Phf6fl/fl 小鼠。整個研究中使用 7-12 週齡至 18 個月大的小鼠。此外，vav1-cre；Idh2R172K；Phf6fl/Y 小鼠和 vav1-cre； Idh2R172K；Phf6fl/fl小鼠，標記為 Phf6KOIdh2R172K小鼠，Idh2R172K；Phf6fl/Y 小鼠和 Idh2R172K；Phf6fl/fl 小鼠，為 Idh2R172K小鼠。
2.1.1 骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結的單細胞懸液製備 (Randall, Lambe et al. 2009) 骨髓、胸腺、脾臟和淋巴結（腋窩、腹股溝）自小鼠取出放入含有 10% FBS 的 DMEM 中輕輕篩網，以準備單細胞懸液。單細胞懸液將通過流式細胞儀進行分析，並在特定子集中 進行分類及 T 細胞功能測試。
2.1.2 小鼠細胞流式細胞儀分析(Randall, Chan et al. 2011)
對於 FACS 分析，來自培養細胞或小鼠淋巴器官（骨髓、胸腺、脾臟或淋巴結）的單細 胞懸液使用 FITC、APC 或 PE 標記的抗小鼠單株抗體染色。數據將在 BD LSRFortessa、BD FACSAriaIII 或 BD FACSVerse 上獲取。細胞分選使用 BD FACSAriaIII 多色細胞分選器對所 需細胞進行分選，並使用 FlowJoTM 軟件(FlowJo, Ashland, OR)分析數據。
2.1.3 精緻骨髓細胞的流式細胞儀分析
有關骨髓細胞分析的詳細程序如前所述(Hsu, Chiu et al. 2017, Hsu, Chen et al.
2019)。簡而言之，小鼠骨髓細胞的單細胞懸液將用螢光染料綴合的抗氧化劑染色小鼠抗體。
長期造血幹細胞（Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-）、短期造血幹細胞
（Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48+）的種群規模、譜系限制性祖細胞
(Lin-Sca-1+c-Kit+CD150-CD48+)、常見髓系祖細胞 (Lin-Sca-1-c-Kit+CD34+FcγRlo)、骨髓細胞 -單核細胞祖細胞 (Lin-Sca-1-c -Kit+CD34+FcγRhi) 和巨核細胞-紅系祖細胞
(Lin-Sca-1-c-Kit+CD34-FcγRlo) 將在 BD LSRII、BD LSRFortessa 或 BD FACSVerse 上獲 得。具有 c-Kit、Mac-1、B220、CD3 和 Gr1 的抗小鼠抗體將用於表徵外周血中的白血病表 型。將使用FlowJo™軟件 (FlowJo, OR, USA)分析數據。
2.1.4 精緻 T 細胞的流式細胞儀分析
本論文進一步分析發育過程中的胸腺細胞亞群，包括前體 T 細胞、DN1、DN2、DN3、
DN4、DP、CD4 SP 和 CD8 SP、較不成熟的 CD69hi單陽性細胞、成熟 CD62L+CD69-單陽 性細胞。成熟 T 淋巴細胞亞群將被細分為循環幼稚和活化/記憶細胞（幼稚 CD44lo和活化/記 憶 CD44hi T 細胞亞群）和活化 CD25hiCD69hi T 細胞。本論文還將分析 CD8+CD44hi子集上 CD45RB、PD-1、CTLA-4、KLRG1、CD127、CD122、CD25、CD27、CD3 或 Tbet 的表達，
以揭示這些標記在 Phf6KO和野生型之間的任何差異小鼠處於穩定狀態。
用於流式細胞儀分析淋巴細胞表面染色（來自 BD，除非另有說明）的抗體如下，FITC- 綴合的抗 CD4 (GK1.5)、peridinin 葉綠素蛋白(PerCP)-花青(Cy) 5.5-綴合抗 CD4 (RM4.5)、
PE-吲哚三碳菁(PE-Cy7)–綴合抗 CD4 (RM 4.5)、別藻藍蛋白(APC)-綴合抗 CD4 (RM 4.5)、
APC-Cy7–綴合抗 CD4 (GK1.5；BioLegend)、PE 結合抗 CD4 (GK1.5)、PE 結合抗 CD8a (53–6.7)、PerCPCy5.5 結合抗 CD8a (53-6.7)、Alexa Fluor 405–偶聯抗 CD8a (5H10;
Invitrogen), APC-Alexa Fluor 750-偶聯抗 CD8a (53-6.7, 5H10), PE-Cy7-偶聯抗 CD8a (53-6.7; BioLegend), APC-偶聯抗 CD25 (PC61)、APC-Cy7 偶聯抗 CD25 (PC61;
BioLegend)、PE 偶聯抗 CD27 (LG.3A10)、APC 偶聯抗 CD44 (1M7)、Alexa Fluor 405 偶 聯抗 CD44 (1M7) ; Invitrogen), Pacific blue-conjugated anti-CD44 (IM7; BioLegend), PE- conjugated anti-CD45.1 (A20), Alexa Fluo r 700-共軛抗 CD45.1 (A20; BioLegend)、Paci c blue-conjugated anti-CD45.2 (104; BioLegend)、FITC-conjugated anti-CD45.2 (104)、
APC-conjugated anti-CD45.2 (104; eBioscience)、FITC-conjugated anti-CD45.2 (104;
eBioscience) CD62L (MEL-14)、APC-Cy7 綴合的抗 CD62L (MEL-4; BioLegend)、
PerCPCy5.5 綴合的抗 CD69 (H1.2F3)、FITC 綴合的抗 CD122 (5H4)、
PE-indodicarbocyanine (PE-Cy5)-偶聯抗 CD127 (A7R34; eBioscience)、PE-偶聯抗 CD152 (UC10-4F10-11)、FITC-偶聯抗 B220 (RA3-6B2)、APC-Alexa Fluor 750-偶聯抗-B220
（RA3-6B2；Invitrogen）、APC 偶聯抗 KLRG1（2F1；eBioscience）、PE 偶聯抗 TCR V 2 (B20.1)、FITC 偶聯抗 CD45RB (16A)、PE 偶聯抗-PD-1 (J43)和 Alexa Fluor 700 偶聯 CD3 (17A2; eBioscience)。
2.1.5 小鼠血液和組織採集
小鼠外週血收集是利用頜下出血方法，收集大約 0.05-0.1 ml 外週血以全血細胞計數分 析或流式細胞儀技術分析。通過使用 25 號針頭和 3-ml 一次性注射器用 IMDM 培養基沖洗股 骨和脛骨來獲得無菌骨髓。使用紅細胞裂解緩衝液在冰上裂解紅細胞。脾組織的細胞懸液將 通過研磨顯微鏡載玻片磨砂端之間的組織獲得，然後進行細胞計數。血液、脾臟或骨髓的代 表性樣本中的平均細胞數將用於通過流式細胞術計算絕對數量。所有器官和組織將在無菌條 件下進行。
2.2 骨髓移植和競爭性骨髓移植試驗(Competitive repopulation unit assay) 從野生型或 Phf6 剔除小鼠中收穫的骨髓細胞(BMC)用於骨髓移植。
B6.SJL-Ptprcapepcb/BoyJ (CD45.1)受體小鼠用單劑量 10 Gy 進行致死輻照。然後在 24 小 時內通過眼眶後注射將 106個未分級供體 (unfractionated donor) BMC (CD45.2)施用於每個 受體小鼠(recipient mice)。每 4 週評估一次受體小鼠外週血中 CD45.2+細胞的嵌合性 (chimerism)。移植後 16 週檢查骨髓。對於二次移植，本論文將來自第一個接受者的分選 CD45.2+野生型或 CD45.2+ Phf6 剔除細胞，移植到每個受致命照射的接受者中。按照與主要 受者相同的時間表檢查外周血和骨髓。
在 CRU 檢測中，2 x 105的 CD45.1+全 BMC 被用作輔助細胞；CD45.2+ Phf6 剔除或野 生型 BMC 是測試細胞。將測試細胞與 CD45.1+ 輔助細胞，1:1 混合併移植到經過致死照射 的 CD45.1+受體小鼠中。每 4 週分析外周血中 CD45.1+和 CD45.2+細胞的比例。
2.3 系列移植試驗(Serial transplantation assay)
取自第一代移植小鼠的骨髓細胞，將其移植到第二代接受小鼠中，並進一步評估 Phf6 和 Idh2R172突變的協同作用。接續測試在 Phf6 和 Idh2R172K突變存在下產生的腫瘤細胞是否 能夠進行強大的自我更新，這是造血系統惡性腫瘤的特性。
2.4 組織學和病理學分析
骨骼、脾臟和肝臟將在 10%福爾馬林中固定。使用 IDEXX RADIL 進行包埋、切片和 H&E 染色。骨髓及血液抹片，用 Liu 染色 A 和 B 溶液(S-Y LIU'S STAIN KIT) 染色。Cytospin 在 Shandon Cytospin 4 上進行，然後用 Liu 染色劑染色。
2.5 細胞內 NOTCH1(ICN1)的逆轉錄病毒轉導
野生型和 Phf6 剔除供體小鼠在收穫骨髓前 4 天注射 150 mg/kg 5-氟尿嘧啶
(5-fluorouracil) (Merck，Darmstadt，Germany)。在病毒轉導前 3 天，將攜帶細胞內 NOTCH1 (ICN1)的逆轉錄病毒構建體，轉染(transfected)到 Plat-E 逆轉錄病毒包裝細胞系(Cell Biolabs, San Diego, CA)中。在病毒轉導(viral transduction)當天，收穫供體小鼠的骨髓，條件培養基 通過 0.22-mm 注射器過濾器過濾並通過 Amicon Ultra-15 離心過濾器單元(Merck)濃縮。然後 將病毒濃縮物應用於在含有硫酸魚精蛋白(protamine sulfate) 5 mg/mL、重組小鼠幹細胞因子 (recombinant mouse stem cell factor) 50 ng/mL、重組小鼠白細胞介素 3 (recombinant mouse interleukin-3) 10 ng/mL、重組小鼠 Flt3 配體(recombinant mouse Flt3 ligand) 50 ng/mL，重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin)50 ng/mL 的 StemSpan SFEM II(Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada)完全培養基中培養的小鼠骨髓。
72 小時後，具有綠色螢光(GFP+)的活細胞被分選並移植到受致命照射的受體中，以進行進一 步的實驗。
2.6 白血病起始細胞(leukemia initiating cells, LIC)的有限稀釋分析
根據 GFP 表達，從具有 ICN1 過表達(WT+ICN1)的野生型細胞或 ICN1 過表達(Phf6 KO+ICN1)的 Phf6 剔除細胞的受體小鼠的骨髓中分選白血病細胞。受致命照射的受體接受了 300,000 個輔助細胞以及 100,000、30,000、10,000 或 3,000 個分類的 GFP+ BMC。移植後 4 至 5 週，對受體小鼠的外周血進行取樣以評估嵌合狀態。監測小鼠 6 個月。使用極限稀釋 分析工具來計算 LIC 數。
2.7 Immunoblotting 和 immunohistochemistry
使用針對野生型 Idh2（免疫印跡 1:1000；ab131263；Abcam，Cambridge，UK）、
突變體 Idh2 R172K（免疫印跡 1:1000；D328-3；MBL，Woburn，MA，US）的一抗進行免 疫印跡和免疫組織化學染色、r-H2AX（免疫印跡 1:1000；#9718；細胞信號傳導，Danvers，
MA）、rH2AX（免疫組織化學 1:1000；ab11174；Abcam）和 GAPDH（免疫印跡 1:1000；
#2118；細胞信號傳導）。
2.8 RT-qPCR 分析
使用 TRIzol RNA 試劑(Thermo Fisher, Waltham, MA)分離 RNA，然後使用1 μg RNA 用 GoScriptTM 逆轉錄系統 (Promega, Wisconsin, US)合成 cDNA。使用 7500 FAST 實時 PCR 系統(ABI)和 KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 試劑盒(sigma-aldrich, Burlington, MA)一式三份進行 PCR。每個樣品中的靶基因表達根據參考基因 GAPDH 表達的幾何平均值 進行標準化。包括突變體在內的野生型 Idh2 的引物序列是正向的，
5'-TGCCACAATCACCCCTGATG-3'和反向的，5'-ATCTGTGGCCTTGTACTGGTC-3'。
Idh2R172K 特異的引物序列是正向的，5'-TGCCACAATCACCCCTGATG-3'和反向的，
5'-TGGTCGCCATGGGCGTTCTT-3'。GAPDH 的引物序列是正向的，
5'-CAGCAATGCATCCTGCACC-3'和反向的，5'-TGGACTGTGGTCATGAGCCC-3'。
2.9 RNA 測序和分析(Clever, Roychoudhuri et al. 2016)
所有 RNA-Seq 分析都使用 2 生物重複進行。使用 RNeasy Plus Mini 試劑盒
(QIAGEN) 從 Phf6 野生型、Phf6KO、IDH2R172K 和 Phf6KOIDH2R172K小鼠的骨髓幹細胞中 製備總 RNA。隨後根據製造商的說明使用 TruSeq RNA 樣品製備試劑盒(Illumina)將 200 ng 總 RNA 用於製備 RNA-Seq 文庫。雙端 RNA 測序在 HiSeq 2000 (Illumina)上進行。測序讀 數將使用 Tophat 2.0.11(Kim and Salzberg 2011)與小鼠基因組 (NCBI37/mm9)對齊，並且 將使用唯一映射的讀數(mapped reads)來計算基因表達。RNA-Seq 讀數將使用 Bowtie 映射 到 mm9 (UCSC)。註釋轉錄本的基因表達將使用 Cuffdiff 從映射的 RNA-Seq 讀數計算，以 獲得 RPKM 歸一化的基因表達值(Trapnell, Roberts et al. 2012)。在應用用於多次測試的 Benjamini-Hochberg 校正。還將進行基因集富集分析(Subramanian, Tamayo et al. 2005)。
2.10 質譜儀(Mass spectrometry)
液相色譜/質譜儀 (Liquid chromatography/mass spectrometry)由國立台灣大學代謝組 學核心設施進行。簡而言之，使用 Bruker maxis Impact Q-TOF 質譜儀結合 Agilent 1290 Infinity 液相色譜分析樣品。色譜柱為 Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 x 100 mm，1.8 μm 顆粒）。流動相由(A)水和 1% 1M 乙酸銨和 0.1%甲酸和(B)乙腈/異丙醇= 1:1 和 1% 1M 乙酸銨和 0.1%甲酸組成，梯度洗脫。流速為 0.4 毫升/分鐘。在 150 至 1600 的 m/z 範圍 內收集數據。
2.11 單細胞測序分析(Single cell sequencing analysis)
本研究中的 scRNA-seq 文庫(libraries)是按照 Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide 準備。總結，來自四種基因型小鼠的大約 15,000 個譜系陰性(Lin negative)和 c-Kit 陽性 BM 細胞被 FACS 分選到20 μL DMEM/10% FBS 中，然後根據製造商的建議加載到 10x 鉻控制器(Chromium Controller)。根據協議，使用 Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Construction Kit v3.1（10X Genomics，Pleasanton，CA，US）處理樣品。來自四個樣品的 細胞被加載到鉻控制器的芯片上，用於液滴形成和逆轉錄。多重 cDNA 文庫在 NextSeq 500 上進行測序，目標是每個細胞獲得超過 20,000 個讀數。
2.12 10x Genomics 單細胞 RNA 測序數據預處理和分析
測序數據使用 10x Genomics 的 Cell Ranger 軟件（版本 3.0.1）處理。FASTQ 讀數與 小鼠參考基因組(GRCm38)對齊，以獲得唯一分子標識符(UMI)計數並為每個庫生成表達矩 陣。分析中包括的細胞是那些滿足以下質量控制(QC)閾值的細胞：UMI 計數> 1,000 且 ≤ 50,000）；檢測到的基因數量> 500 且≤ 5,500）；每個細胞的線粒體基因表達百分比< 10%；
分析中包含的基因是在至少 10 個細胞中表達的基因。在應用上述閾值後，8422、9311、7405 和 8944 細胞分別在 WT、Phf6KO、Idh2R172K 和 Phf6KOIdh2R172K樣本中通過了 QC。Seurat 軟件（3.0.0 版）用於下游分析(Butler, Hoffman et al. 2018)。簡而言之，為了標準化，每個 庫的特徵表達測量被縮放到 10,000 的大小，然後進行對數轉換。接下來，在對數轉換數據 上識別出高度可變的基因，以促進下游分析。整合來自每個庫的數據以校正樣本之間的技術 差異。使用高度可變的基因進行主成分分析（PCA），並通過肘圖估計數據集的維度。然後 使用數據矩陣的前 30 個 PC 將細胞投影到均勻流形近似和投影 (UMAP) 空間。使用基於 Louvain 圖的聚類方法進行細胞聚類，分辨率參數設置為 = 0.3。通過檢查文獻中先前報導 的典型譜系特異性標記的表達模式來進行細胞簇的譜系分配(Nestorowa, Hamey et al. 2016, Dahlin, Hamey et al. 2018, Pellin, Loperfido et al. 2019)。為了進一步分析，最終分化的成熟 細胞被排除在外，留下十個主要簇代表 HSPC 和譜系特異性祖細胞群，分別包括 WT、
Phf6KO、Idh2R172K 和 Phf6KOIdh2R172K樣本中的 7927、8651、7068 和 8644 細胞。進一 步使用 Wilcoxon 秩和檢驗鑑定差異表達基因(DEG)。在超過 25%的特定簇中檢測到的基因 被包括在分析中，最小倍數變化閾值設置為 1.25。基因集富集分析(GSEA)在 R 包
clusterProfiler 中實現 (Yu, Wang et al. 2012)，用於分析的 HALLMARK 基因集從 MSigDB (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb) 下載/)。特定途徑的總分計算為該途徑或基因 組中成分基因的平均標準化表達值。
2.13 統計分析
本研究中的統計分析使用 GraphPad Prism（GraphPad Software，La Jolla，CA）和 R
（4.0.3 版）進行。 Wilcoxon 秩和檢驗或 t 檢驗用於比較兩個連續變量，以適當者為準。
Kruskal-Wallis 檢驗用於比較三個或更多連續變量的分佈。用 Kaplan-Meier 方法和對數秩檢 驗對小鼠進行生存分析。小提琴圖、條形圖和火山圖是使用 ggplot2 庫(v3.3.3)創建的。
第三章、結果(Results) 3.1 培育 Phf6 條件性剔除小鼠
Phf6 條件式基因剔除策略主要是剪除 2~11 外顯子，作法是在外顯子 1 及最後一個，即 第 11 外顯子後(圖 2A)，嵌入 loxP 序列(圖 2B)，所製造出的小鼠命名為 Phf6fl/Y及 Phf6fl/fl
（分別為公及母鼠）。接續以 vav1-cre 轉基因小鼠配種 Phf6fl/fl小鼠，得到 Phf6 條件性 KO 小鼠，命名為 vav1-cre; Phf6fl/fl和 vav1-cre；Phf6fl/Y 小鼠，特點是 Phf6 在造血細胞中被特 異性剔除。全骨髓細胞、胸腺細胞和脾細胞的蛋白質印跡顯示剔除小鼠中幾乎完全沒有 Phf6 蛋白(圖 3)。vav1-cre；Phf6fl/fl（母鼠）和 vav1-cre；Phf6fl/Y（公鼠）小鼠以預期的孟德爾比 率出生並存活。
3.2 PHF6 對正常造血的作用
3.2.1 Phf6 條件性剔除(KO)在穩態下會增加造血幹細胞和前驅細胞
為了研究 Phf6 在造血中的作用，本論文接續分析了 8 至 12 週大的 Phf6 cKO 小鼠及其 野生型同窩小鼠的 CBC/DC。結果顯示 Phf6 cKO 小鼠的總白細胞計數(WBC)高於其野生型 同窩小鼠(圖 4B)。Phf6 cKO 小鼠的 B220+ B 細胞和單核細胞的絕對計數顯著升高，外週血 中 CD4+和 CD8+ T 細胞的計數顯著降低(圖 4B 和 C)。然而，脾臟重量和胸腺重量在 Phf6 cKO 小鼠和它們年輕時的野生型同窩小鼠之間相當(圖 4D)。進一步分析了穩態下造血幹細胞和祖 細胞的組成，發現 Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) 和短期造血幹細胞(ST-HSC)的百分比顯著增加，
骨髓細胞的骨髓細胞-巨噬細胞祖細胞(GMPs)的百分比顯著降低(圖 5A，B 和 D)。Phf6 cKO 和它們的野生型同窩小鼠在它們的骨髓中具有相似的細胞數目和結構(圖 5E)。
3.2.2 Phf6 KO 小鼠週邊血細胞的淋巴細胞生成存在顯著偏差
分析 8~12 週齡的 Phf6 KO 小鼠及其野生型同窩小鼠的 CBC/DC，發現 Phf6 KO 小鼠的 白細胞計數(WBC)、血色素水平(Hgb)和血小板計數(PLT)與其野生型同窩小鼠相當(圖 6A)。
Phf6 KO 小鼠 B220+ B 細胞的百分比和絕對計數顯著升高，外週血中 CD4+和 CD8+ T 細胞 的百分比顯著降低(圖 6B 和 C)。12 週時，Phf6 KO 小鼠 CD8+ T 細胞絕對計數仍顯著低於野 生型，但 Phf6 KO 小鼠 CD4+ T 細胞僅略低。此外，Phf6 KO 小鼠脾臟中的 B220+ B 細胞和 CD8+ T 細胞也明顯增多(圖 6D)。基於這些結果，Phf6 似乎在淋巴細胞生成中起作用。
