細胞中的RNA 以 QIAamp○R RNA Blood Mini Kits (QIAGEN)萃取 ，實驗流
程 參 照 QIAGEN 實驗手冊。將 2 µg RNA 以 oligo(dT)20 做 為 引 子 ， 利 用 High-Capacity cDNA Reverse transcription kits (Applied Biosystems)合成 cDNA，
Reverse transcription 條件為 25℃ 10 分鐘，37℃ 120 分鐘，85℃ 5 秒，於 4℃中止 反應。
將構築好具有HIF-1β 及 GAPDH 基因片段的質體做一系列不同濃度的稀釋，
分 別 以 TaqMan ○R Gene Expression Assays (Applied Biosystems) 中 HIF-1β (Hs01121912_m1 ， Applied Biosystems) 及 GAPDH (Hs99999905_m1 ， Applied Biosystems) 的專一性探針進行同步定量 PCR，所得實驗數據做為標準曲線。稀
釋已合成好的細胞cDNA，以同樣的探針進行同步定量 PCR，以先前已做好的標
準曲線回算濃度。
七、腫瘤增生實驗
我們將注射轉殖miR-221 inhibitor 和 miR-222 inhibitor 或 scramble-miR 的癌 胞株至裸鼠，檢視miR-221 及 miR-222 對腫瘤細胞增生的影響。轉殖前 24 小時 將細胞培養於175T flask (MIAPaCa-2 為 1×105/mL；ASPC-1 為 1.5×105/mL)，每 個 flask 含細胞培養液 30 mL。將 miR-221 inhibitor 和 miR-222 inhibitor 或 scramble-miR 轉殖至貼附好的細胞，轉殖濃度為 100 nM，作用體積 13 mL，作用 時間為5 個小時，5 個小時後加入細胞培養液至 30 mL，於轉殖後 36 個小時收取 細胞。收取細胞前2 個小時移去細胞培養液，以 1×PBS 清洗細胞表面兩次，加入 30 mL 細胞培養液，培養 2 個小時後，收取細胞。將收下的細胞懸浮於 1×PBS 中 (MIAPaCa-2 為 2.5×107/mL；ASPC-1 為 5×107/mL，細胞濃度為經實驗測試，經 注射細胞後，能於裸鼠皮下形成腫瘤的細胞濃度)，以200 µL 為一劑注射至裸鼠(來 自國家實驗研究院動物實驗中心)後肢。於注射後每週拍照觀察。
結果 一、miR-221/222 可能標的基因的預測
在過去的文獻報告中顯示，miR-221 及 miR-222 在許多腫瘤細胞，如 thyroid papillary carcinoma、pancreatic adenocacinoma 及 glioblastoma 呈現大量表現的情 形，且這兩種miRNA 對腫瘤細胞的增生似乎扮演著重要的角色。我們利用 miRNA 資料庫miRBase (Griffiths et al., 2006, microrna.sanger.ac.uk)，得知人類的 miR-221 和miR-222 為同一 clustered member，座落於 X 染色體的 45490529 bp 至 45491417 bp 之間，兩個 miRNA 座落的位置相距 727 bp。在 miRBase 中我們也得到 miR-221 及miR-222 的 secondary structure 及 pre-miRNA 的 stem-loop 結構，及得知成熟的 miR-221 和 miR-222 分別為 23 及 21 個核醣核酸所組成。
我們接著利用預測 miRNA 標的基因的資料庫 TargetScan (targetscan. org)、
PicTar-Vert (pictar.bio.nyu.edu)及 miRNA Viewer (cbio.mskcc.org/mirn aviewer)，所 提供seed site match (Lewis et al., 2003)及運算後所得到的自由能、分數及可能性來 判斷miR-221 及 miR-222 的可能標的基因。其中，我們篩選出了 HIF-1β 基因。
此基因於3’-UTR 上＋1868 bp 至＋1890 bp 之間，被預測為 miR-221 及 miR-222 可能的標的位置，其序列與miR-221 及 miR-222 的 seed site 配對有 8 mer 吻合，
且此序列在多種物種中具有高度的保留性，同時也符合了 conserved seed site match 多由 adenocine flanking 的條件 (Lewis et al., 2003)。配對的自由能約為－20~
－25 Kcal/mol，屬於穩定配對，也符合 miRNA-RNA duplexes 的自由能需低於－
20 Kcal/mol；conserved site 配對自由能需低於－10 Kcal/mol 的條件 (Watanabe et al., 2006)。除此之外，HIF-1β 在 PicTar-Vert 資料庫被預測為 miR-221 和 miR-222 標的基因的可能性大於80% (圖 1A)。由於 HIF-1β與HIF-1α 組成的 HIF-1 轉錄因 子對腫瘤細胞的形成、生存及轉移也具有相當重要的意義。後續我們將以各種實 驗探討HIF-1β 是否確實為 miR-221 及 miR-222 的標的基因。
二、分析HIF-1β 蛋白質及 miR-221 在消化道癌細胞株中的表現 RNA，將這些小片段 RNA 利用 TaqMan○R Human MicroRNA Assays 套組的 miR-221 專一性引子合成 cDNA，再以同步定量 PCR 作定量分析。實驗結果以 MKN45 細胞的內生性 miR-221 表現量當作基準值，其餘細胞相對於 MKN45 細胞 的miR-221 表現量顯示於圖 2B。由於 miR-221 及 miR-222 為同一基因座成員，
且為使用同一起動子做轉錄，被認為是 polycistronic 基因，因此我們僅分析其中 的miR-221 的表現情形。
由於後續的實驗中，我們計劃外加入miRNA mimic，了解 miR-221 及 miR-222 能否抑制HIF-1β 表現；為了此目的，我們根據西方點墨法及同步定量 RT-PCR 的 結果選擇了HCT116 及 MKN45 這兩種分別屬大腸癌及胃癌的細胞株，主要原因
是此兩種細胞株內生性miR-221 屬於相對表現量較低，且於我們過去的實驗經驗
認為此兩種細胞株有較好的轉殖效率 (圖 2B)，在我們轉殖 miRNA mimic 時可能
可以觀察到比較顯著的影響力；此外，此兩個細胞株的HIF-1β 的表現量，其中一
個為表現量較高，另一個為中等 (圖 2A)。選用 HIF-1β 表現量不同的兩種細胞株，
是為了避免表現量高的細胞株在實驗結果中可能造成不易觀察的情形。我們將以 這兩種細胞株當作細胞模型進行後續的研究。