在過去的文獻中指出，miRNA 能與標的基因所轉錄出的 mRNA 的 3’-UTR (3’-untranslated region)上特定序列配對，形成 miRNA-RNA duplexes (Ha et al., 1996；Moss et al., 1997；Lai et al., 2002；Doench et al., 2004)。脊椎動物中 miRNA 與RNA 配對時，miRNA 的 5’端前 8 mer 的吻合度被認為最為重要。其中，第 1 個核醣核酸多由腺嘌呤 (adenosine)構成，與標的序列 (target site)配對時可不須遵 守Watson-Crick pair (Grimson et al., 2007)。第 2 至第 8 個核醣核酸稱為 seed site (Lai et al., 2005)，為主要的配對核心，決定 miRNA 能否調控標的基因。形成 miRNA-RNA duplexes 後，則進一步藉由 translational repression (Lewis, 2003；
Ambros, 2004；Sage et al., 2007)或 mRNA cleavage 抑制標的基因的表現。植物細 胞中的 miRNA 與標的基因大多為完全配對，走向 mRNA cleavage(Millar and Waterhouse, 2005)。動物細胞中大部分為部分配對，走向 translational repression，
唯有少部分miRNA 與標的基因配對程度較高，或當中具有 AU-rich element (ARE) 序列的 mRNA，能走向類似植物細胞中 mRNA cleavage 的途徑 (Bagga et al., 2005；Jing et al., 2005；Yekta et al., 2008)。
3. miRNA-221/222 的生理意義
在過去的研究中顯示，許多腫瘤的生成肇因於p27kip1的表現量降低 (Lloyd et
al., 1999；Blain et al., 2003)。p27kip1為 cyclin-dependent kinase (CDK)/cyclin E al., 2007)， 且同時在 thyroid papillary carcinoma (Pallante et al., 2006；Visone et al., 2007)、pancreatic adenocarcinoma (Bloomston et al., 2007)、glioblastoma(Ciafre et al., 2005) 及 prostate carcinoma (Galardi et al., 2007) 等 多 種 腫 瘤 細 胞 中 發 現 miR-221/222 呈現大量表現，才瞭解造成 p27kip1表現量減少引發腫瘤生成的主因。
miR-221/222 除了造成腫瘤細胞的形成外，也對腫瘤細胞的生長速度有所影 響。過去有文獻報導指出，若抑制thyroid papillary carcinoma 中的 miR-221，可以 使得腫瘤細胞增生速度顯著的降低 (Pallante et al., 2006)。
miR-221/222 不僅在腫瘤生成扮演重要的角色，miR-221/222 的表現也會經抑 制 kit receptor 影響正常的紅血球及 erythroleukemic 細胞的生成 (Felli et al., 2005)。同時，miR-221/222 也能經抑制 kit receptor，抑制血管增生 (angiogenesis)，
影響組織器官的發育 (Poliseno et al., 2006)。
二、 HIF-1 的組成及生理意義 1. HIF-1 的組成單元
HIF (hypoxia-inducible factor)為調控 hypoxia-inducible 基因表現的重要轉錄因 子 (transcription factor)，由 α 子單元 (HIF-α)及 β 子單元 (HIF-β)兩個子單元組
成。過去的研究中發現，HIF 具有三種不同的異構物，分別為 HIF-1、HIF-2、HIF-3，
其表現具有組織特異性，且功能也不盡相同，其中以HIF-1 的功能最為重要，也
最為常見 (Lee et al., 2004；Ke and Costa, 2006)。
HIF-1 中，α 子單元主要由四個 domain 組成，由 N 端至 C 端分別為 basic helix-loop-helix (bHLH)、Per/ARNT/Sim (PAS)、N-terminal activation domain (NTAD) 及C-terminal activation domain (CTAD)，其中 HIF-1α 蛋白上第 401～603 胺基酸 之間的區域又稱為Oxygen-dependent degradation domain (ODDD)，為調控 HIF-1α 蛋白穩定性的重要區域。HIF-1β 主要由兩個 domain 組成，由 N 端至 C 端分別為 bHLH 及 PAS (Huang et al., 1998 ；Willian and Kaelin, 2005)。HIF-1α 與 HIF-1β 利 用PAS domain 作結合 (Yang et al., 2005)，結合而成的 HIF-1 能以 bHLH 結合在 DNA 的 HRE (hypoxia response element)上，調控基因的表現。HIF-1 主要的轉錄 調控活性位於HIF-1α 的 CTAD 上，CTAD 能與 coactivator p300/CBP 結合，HIF-1 與p300/CBP 結合後才具有轉錄因子的活性(Kung et al., 2000)。
2. HIF-1 的調控
組成HIF-1 的 HIF-1α 及 HIF-1β 在細胞中均處於持續表現的狀態，但 HIF-1α 的轉錄調控活性及蛋白穩定性會受到氧分壓的影響，唯有細胞處在低氧狀態下 (hypoxia 狀態，氧分壓 0.5%～5%)，HIF-1α 才能與 HIF-1β 組成完整並且具有功能 性的HIF-1 (Jiang et al., 1996)。當處於低氧狀態下，HIF-1α 蛋白能經由 p42/p43 mitogen-activated protein kinase (MAPK)於 Thr796 上作磷酸化 (phosphorylation)修 飾，經磷酸化修飾的HIF-1α 與 HIF-1β 有較好的結合力，與 HIF-1β 組合成完整的 HIF-1 (Hur et al., 2001；Gradin et al., 2002)。
若處於正常氧分壓狀態下 (nomoxia 狀態，氧分壓 6%~21%)，HIF-1α 蛋白上 的Asn803 (於 CTAD 上)會最先被 factor inhibit HIF-1 (FIH-1)以氧分子為基質作氫 氧化 (hydroxylation)修飾，氫氧化修飾後的 CTAD domain 會失去與 p300/CBP 結 合的能力，使得HIF-1 失去轉錄因子的活性 (Lando et al., 2002)。隨著氧分壓的上
升，HIF-1α 蛋白上的 Pro402 和 Pro564 及 Lys532 會接著被 prolyl hydroxylation domain (PHD)和 arrest-defective-1 (ARD-1)分別作氫氧化與乙醯基化(acetylation) 修飾。經修飾之後的HIF-1α 能與 VHL(von Hippel-Lindau)蛋白結合(Jeong et al., 2002；Willian and Kaelin, 2005；Ke and Costa, 2006)。VHL 蛋白為 E3 ligase family 的一員，VHL 與 HIF-1α 結合後，會對 HIF-1α 作 polyubiquitination 的修飾，而被 polyubiquitination 的 HIF-1α 會很快的經 proteosome-dependent 的降解途徑被降 解，此反應於細胞中十分的快速，於氧分壓～20%的正常氧分壓狀態下，HIF-1α 的半衰期僅約5 分鐘 (Cockman et al., 2000；Tanimoto et al., 2000；Masson et al., 2001)。
相較於HIF-1α，HIF-1β 則十分的穩定，不受氧分壓的調控，且表現量十分高。
3. HIF-1 的功能及生理意義
HIF-1 為生物體內重要的轉錄因子，它藉由辨識基因上的 HRE 序列 (5’
-RCGTG- 3’)活化 hypoxia-inducible 基因。最早被發現受 HIF-1 調控的基因為 EPO (erythropoietin)基因。EPO 為促進紅血球增生的重要因子。過去利用各種細胞模型 的研究結果顯示，若當人體組織器官處於低氧狀態下時，EPO 會受到 HIF-1 的調
控，表現大量的 EPO 蛋白，促進紅血球的增生，增加人體內能攜帶的氧氣總量
(Semenza et al., 1991)。而為了因應大量的紅血球增生，HIF-1 也會調控 transferrin receptor (Tfr)基因，表現大量的 Tfr，將與鐵離子結合的固鐵蛋白送入細胞內，提 高細胞吸收鐵離子的能力，以得到足夠的鐵離子來生成紅血球所需的血紅蛋白 (Generale et al., 1999；Lok and Ponka, 1999)。除此之外，VEGF (Vescular endothelial growth factor)基因上也具有 HRE (Forsythe et al., 1996) ，在低氧狀態下也同樣會 受到 HIF-1 的調控。VEGF 為促進血管增生的重要因子，在低氧狀態下，HIF-1
能刺激VEGF 大量表現，誘使血管增生，以增加氧氣的輸送率。
HIF-1 除了引發紅血球生成與血管增生外，HIF-1 對於腫瘤細胞存活、增生及 轉移也有著密不可分的關係。過去的研究報告中指出，腫瘤細胞中的 core tumor
經常處於低氧環境下，呼吸作用的電子傳遞鏈會因無法得到足夠的氧作為電子接 受者，造成Reactive Oxygen Species (ROS)產物累積，為了避免過多 ROS 產物累 積誘發死亡，腫瘤細胞中的HIF-1 會促進 MXI-1 蛋白表現，藉由 MXI-1 蛋白抑制 粒線體的生成，降低呼吸作用。正常細胞中，MYC 與 MAX 形成的 complex 能 促進粒線體的生成。而腫瘤細胞能藉由大量表現HIF-1 與 MAX 競爭 MYC 的方 式，抑制粒線體的生成 (Zhang et al., 2007；Dang et al., 2008)。為了因應呼吸作用 的降低，腫瘤細胞中的 HIF-1/MYC complex 會調控醣解代謝 (glycolysis)的酵素 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)大量表現 (Lu et al., 2002)，加 速醣解代謝。除了大量表現醣解代謝的酵素外，HIF-1 也會造成細胞的 glucose transporter-1 (GLUT1)大量表現，使腫瘤細胞能得到更多的醣進行代謝 (Chen et al., 2001)。而為了避免醣解代謝的最終產物 pyruvate 進入三羧酸循環走向呼吸作用，
HIF-1 也會誘導 pyruvate dehydrogenase kinase-1 (PDK-1)及 lactate dehydrogenase A (LDHA)的大量表現，抑制 pyruvate dehydrogenase (PDH)，使 pyruvate 走向乳酸發 酵的途徑，將主要產能途徑由呼吸作用轉換成無氧醣解作用，使腫瘤細胞得以在 低氧環境下存活，也藉此淘汰無法於低氧環境下生存的腫瘤細胞 (Semenza et al., 1996；Kim et al., 2006；Semenza, 2007)。
腫瘤細胞中亦能藉由HIF-1 誘導 VEGF 的表現，刺激血管增生，提供腫瘤細 胞 轉 移 的 通 道 。HIF-1 也 能 誘 導 協 助 腫 瘤 細 胞 轉 移 時 分 解 基 底 層 (basement membrane)及做貼附動作所需的蛋白大量表現，使腫瘤細胞轉移至其他位置 (Krishnamachary et al., 2003；Büchler et al., 2004；Postovite et al., 2008)。另外，HIF-1 與insulin-like growth factor 2 (IGF-2)、transforming growth factor-α (TGF-α)在腫瘤 細胞中，亦被證明存在著正向的相互調控關係，能促進腫瘤細胞的增生 (Feldser et al., 1999；Semeza, 2003)。若將 HIF-1α 突變的癌細胞株注射至裸鼠，腫瘤生長的 速度比具正常 HIF-1α 的癌細胞株降低許多 (Maxwell et al., 1997；Zhang et al., 1997)。
HIF-1 除了能調控生長因子 (growth factor)，加速腫瘤細胞的增生外，也能藉 由調控細胞凋亡因子，調控腫瘤細胞的死亡。在某些腫瘤細胞中，proapoptotic 蛋白 Bcl-2/adenovirus EIB 19-kDa interacting protein 3 (BNip3)呈現大量表現 (Sowter et al., 2001)；而 BNip3 基因的啟動子上也被證實具有 HRE，能在低氧狀態 下受到HIF-1 調控，控制腫瘤細胞凋亡 (Bruiclk, 2003)。如前段所述，許多腫瘤 細胞擁有在缺氧狀態下誘發腫瘤細胞死亡的調控機制，而留有此機制的目的被推 測可能是藉此淘汰無法於缺氧環境下生存的腫瘤細胞，但能在缺氧環境下生存腫 瘤細胞如何抵抗此調控機制而生存下去，至今仍不明。
三、 研究構想與目的
在腫瘤細胞中，miR-221/222 與 HIF-1 均扮演著極重要的角色，特別是在腫 瘤細胞的生成與增生。我們於預測 miRNA 標的基因的資料庫中發現，HIF-1 中 HIF-1β 子單元為 miR-221/222 的可能標的基因。於此，我們利用消化道系統的癌 細胞株作為細胞模型，探討在腫瘤細胞中miR-221/222 對 HIF-1β 基因表現的影響。
實驗材料與方法 一、細胞培養
人類大腸直腸癌細胞株HCT116、人類胰臟癌細胞株 MIAPaCa-2、人類腎臟 癌細胞株 HEK293T 及非洲綠猴腎臟癌細胞株 COS-7，培養於含 10% FBS (fetal bovine serum，GIBCO)、50 unit/mL penicillin (GIBCO) 及 50 µg/mL streptomycin (GIBCO)的 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium，GIBCO)培養液中，置於 含有5% CO2的37℃恆溫培養箱中培養。HCT116 及 HEK293T 細胞以 8.5×104/mL 的細胞濃度做繼代培養；MIAPaCa-2 及 COS-7 細胞以 1×105/mL 的細胞濃度做繼 代培養。
人類胃癌細胞株MKN45 及人類胰臟癌細胞株 ASPC-1 培養於含 10% FBS、
50 unit/mL penicillin 及 50 µg/mL streptomycin 的 RPMI1640 (GIBCO)培養液中。
以1×105/mL 的細胞濃度做繼代培養。
二、細胞蛋白萃取與西方點墨法 (Western blot)分析
將細胞由液態氮中取出，置於37℃水浴槽中解凍，於解凍後加入適量的培養
液，離心移去培養液，加入適量體積的 1×PBS 做 wash，離心移去 PBS，收取沉 澱的細胞。加入適量的M-PER (Mammalian protein extraction reagent，Promega)溶 液至所收取的細胞中，冰上作用5 分鐘裂解細胞，於 4℃下以 KUBOTA 3700 離 心機以14000×g 離心 3 分鐘，離心後收取 cell lysate，以 BIO-RAD Protein Assays 套組 (BIO-RAD)作蛋白質定量，定量流程參考 BIO-RAD 實驗手冊。
取含 12 µg 蛋白質的 cell lysate 以 10% SDS-PAGE 做蛋白分離。將於 SDS-PAGE 分離好的蛋白以 iBlot™ Transfer Stack (Invitrogen)轉印至 nitrocellulose 膜上。西方點墨法流程參照Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, 1996)。西方點墨法所用的 blocking reagent 為 5% 脫脂奶粉 (BD Biosciences)；一 級抗體為 mouse anti-human HIF-1β (1：3000 稀釋，BD Biosciences)、mouse
anti-human α-tubulin (1：9000 稀釋，Abcam)；二級抗體為 goat anti-mouse IgG-HRP (1：10000 稀釋，Abcame)。以 Western LightingTM Chemiluminescence Reagent Plus Enhanced luminol 試劑(PermkinElmer)做冷光呈色。由於 HIF-1β 與 α-tubulin 的蛋 白大小有明顯差異，我們於實驗中將膜裁開，分別做抗體結合反應及冷光呈色。
三、小片段RNA 萃取及 miRNA 同步定量 RT-PCR
細胞中小片段RNA 以 mirVanaTM PARISTM套組 (Ambion)萃取，實驗流程參 照 Ambion 實驗手冊。接續利用 TaqMan○R MicroRNA Reverse transcription kit (Applied Biosystems)配合 TaqMan○R Human MicroRNA Assays 套組 (Applied Biosystems)中 hsa-miR-221、hsa-miR-222 及 hsa-U6 RNA 的專一性引子，將小片 段RNA 合成 cDNA。Reverse transcription 的條件為 16℃ 30 分鐘、42℃ 30 分鐘、
85℃ 5 分鐘，4℃中止反應。以合成好的 cDNA 當作模板，分別利用 TaqMan○R Human MicroRNA Assays 套組中 hsa-miR-221、hsa-miR-222 及 hsa-U6 RNA 的專 一性探針配合 TaqMan○R Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)，以 GenAmp 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems)進行同步定量 PCR 分析。
四、轉殖miRNA mimic 及 miRNA inhibitor
轉 殖 前 24 小 時 將 細 胞 以 約 五 分 滿 培 養 於 12 well plate (HCT116 為 6.5×104/mL ； MKN45 為 8×104/mL ； MIAPaCa-2 為 8×104/mL ； ASPC-1 為 1×105/mL)，每個 well 含細胞培養液 1mL。由於轉殖 miR-221 inhibitor、miR-222 inhibitor 及 scramble-miR 的轉殖試劑細胞毒性較強，若需同時轉殖 miRNA mimic 與miRNA inhibitor 時，我們優先轉殖 miRNA inhibitor。
MiRNA inhibitor 為 來 自 Exiqon 公 司 的 miRCURYTM LNA Knockdown probes，具有能與 miRNA 互補的的互補序列。將 miR-221 inhibitor、miR-222