一. 前言
致病型細菌一直是人們健康的威脅來源之一，雖然目前研究上有許多種類的抗生 藥物於臨床上使用，但這類的細菌會因環境的變遷與生存的需求，而突變出更能適 應的菌株；對於這些苟活下來的細菌，可能將它們的抗藥基因傳給子代，使得原本 的藥物喪失作用或是降低效果而產生抗藥性；因此，人們對傳染性疾病的憂心又再 度升高，原有的抗生素已經不再是控制病情的萬靈丹，具抗藥性細菌散播速度更是 超出我們的想像；因此，如何發展更新的抗生素將是一項重要挑戰。
圖一、 細胞壁生合成過程(註: Moenomycin 抑制 GT 活性、Vancomycin、β-lactams 抑 制TP 活性)1
細 胞 壁 的 形 成 主 要 是 利 用 膜 上 轉 醣 酶(glycosyltransferase, GT) 與 轉 胜 肽 酶 transpeptidase (TP)的雙功能蛋白質(penicillin-binding proteins, PBPs)，其催化肽聚醣 (peptidoglycan)單元以高度網狀聚合而成，抵抗了滲透壓與維持整個細胞的形狀(圖 一)1。而這酵素目前被認為是極佳的藥物發展對象，因為它是建構細胞壁所必須部 份 ， 並 且 與 哺 乳 類 細 胞 是 不 相 同 的 。 而 原 先 發 現 已 的 抗 生 素 如: Vancomycin、
Penicillin 等可抑制胜肽酶的活性，但是經人們大量的使用，產生抗藥性導致治療上 的窘境日漸突現；而 Moenomycin 則是多醣體的抗生素，其結構和轉醣酶受質類似，
模擬了轉醣酶催化時的過渡態，具有不錯的抑制效果，但是Moenomycin 分子不易被 人體給吸收，大大降低了用藥的價值。
在我們的研究方向，主要是設計與合成出具有抑制細胞壁生合成的化合物，因此 以天然的lipid II 受質為主軸架構，修飾官能基來獲得各式各樣的 lipid II 的類似物，
針對我們所研究的目標酵素-轉醣酶進行活性分析。
二. 實驗部份
首先，在整個研究中必須建立完整的生物分析系統，對於所純化出的蛋白質評估 酵素活性特性，因此我們須先經由化學合成法來獲得足量 transglycosylase 的天然受 質 lipid II (圖二)。而 lipid II 結構合成策略上，由文獻 2與實驗室已合成出的技術，
我們分為三片段進行: (1)disaccharide 先接上 L-Ala (2)tetrapeptide (3)undecaprenyl phosphate；在雙醣部份我們是以 GlcNAc 與 MurNAc(含 L-Ala)經由 glycosylation 而 得(流程一)。
undecaprenyl phosphate
圖二、天然Lipid II 受質結構
HO O HOHO
AcHN OH
O O
AcHN OBn HOAcO AcOAcO
PhthN
O CCl3 NH
8 steps 4 steps
O O
AcHN OBn HOAcO
O NH
O OTMSE AcO O
AcOAcO PhthN
O CCl3 NH
O O
AcHN OBn AcO
O NH
O OTMSE AcO O
AcOAcO PhthN
O TMSOTf, DCM, -78oC
39%
Glycosylation
Acceptor Part Preparation Donor Part Preparation
流程一、Disaccharide 合成步驟
製備雙醣部份後，經由下列(式二)的合成步驟，接上 tetrapeptide 與萃取出
undecaprenyl phosphate 部份，去掉各保護基經 HPLC 純化，可得到我們預期的 lipid II 受質產物。
O O
AcHN OBn AcO
O NH
O OTMSE AcO O
AcOAcO PhthN
O O
O
AcHN OBn AcO
O NH
O OTMSE AcO O
AcOAcO AcHN
O O
O AcHN OH
AcO
O NH
O OTMSE AcO O
AcOAcO AcHN
AcOAcO AcHN
AcOAcO AcHN
AcOAcO AcHN
R= protected tetrapeptide
(f)
AcOAcO AcHN
AcOAcO AcHN L= lipid chain
O O (c) (i) dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidite, tetrazole, ACN ;(ii) MCPBA; (d) TBAF, THF;
(e) tetrapeptide coupling; (f) Pd/C, MeOH, H2; (g) CDI, indecprenyl phosphate, DMF; (h) (i)TBAF, DMF; (ii) 3% NaOMe, MeOH
流程二、Lipid II substrate 合成路徑
後續研究方面，今年 Strynadka etc.在 science 雜誌中 3，報導出在細胞壁合成的 transglycosylation 過程中，作者利用 moenomycoin 抑制轉醣酶活性後，首次成功地將 晶體結晶出，經 X-ray 解出的晶體提供了 Moenomycoin 跟轉醣酶(GT51)相互作用的主
HO NHAc H3N or some possible structure via computer modeling
圖三、預期具活性的Lipid II 受質類似物
三.未來方向
製備足量lipid II 化合物以建立完善生物分析後，開始著手修飾物的合成，針對 GlcNAc 的 4´和 6´-氫氧基置換成胺基，增加修飾後的受質與酵素鍵結能力而達到抑 制效果，這方面想法尚未有文獻報導過，因此修飾後的lipid II 受質若達到我們預期 的效果，這將提供以lipid II 修飾抑制物為主的抗生素，經由結晶更大大的提供轉醣 酶作用活性位子。
Reference:
(1) Thomas K. Ritter, Chi-Huey Wong Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 3508-3533 (2) Benjamin Schwartz, Jay A. Markwalder, Yi Wang J. Am. Chem. Soc. 2001, 123,
11638-11643
(3) Andrew L. Lovering, Liza H. de Castro, Daniel Lim, Natalie C. J. Strynadka Science
2007, 315, 1402-1405
方俊民教授出席國際會議報告 計畫編號：95-2113-M-002-007
計畫名稱：僿吩組成雜環化合物之合成及應用研究(2/3) 計畫主持人：方俊民
執行起迄：2006/08/01 ~ 2007/07/31 執行單位：台灣大學化學系
On March 30, I was invited by Prof. Fred Ziegler to give a lecture in the Department of Chemistry, Yale University. My lecture title was “SARS and antiviral drug discovery”.
Before talking on the main subject, I first briefed our current research programs that include (i) natural product chemistry of Dendrobium huoshanense and Gastrodia elata, (ii) SmI2/mercaptan co-catalyzed acetal-Tishchenko-lactone reactions, (iii) Carbohydrate elaboration, analysis and sensing, in particular, immobilization of oligosaccharides; (iv) Transglycosylase substrates and inhibitors in bacterial cell wall biosynthesis, (v) Phosphate ion sensors with pyrene reporting units, and (vi) Detection and inhibition of influenza virus.
My lecture was greatly appreciated by audience.
This lecture is mainly on our structure-based SARS drug discovery program, which turned out to be successfully in discovery existing drugs and synthetic inhibitors against severe acute aspiratory syndrome. The main content includes (i) SARS 3CL protease preparation, (ii) High throughput fluorescence assay, (iii) Protease inhibitors discovery, (iv) Cell-based screen of anti-SARS agents, and (v) 3-D structure of protease–inhibitor complex.
Due to the limitation of lecture time, I focused on the efficient synthesis of AG7088 and dipeptidomimetic α,β-unsaturated esters, as well as their properties on 3CL protease inhibition, anti-SARS activity, and cytotoxicity. I also talked about our serendipitous discovery of benzotriazole esters as mechanism−based inactivators of SARS 3CL protease.
The next day, March 31, we held a full-day symposium on synthetic organic chemistry at Yale University to mark Professor Fred Ziegler’s retirement from full-time service. This symposium featured six lectures by
Patrick Harran (Univ. Texas Southwest Medical Center): Synthetic means to reach natural ends.
James Leighton (Columbia Univ.): Synthetic silicon as a Lewis acid: New strategies &
opportunities for asymmetric synthesis.
Paul Wender (Stanford Univ.): Fantastic Fred: Synthesis and lessons for a lifetime.
Glenn Micalizio (Yale Univ.): Group 4 metal-mediated reactions for carbon–carbon bond formation: cross coupling via directed carbometalation.
Koichi Mikami (Tokyo Inst. Technol.): Two decades after Yale with my mentor.
Gilbert Stork (Columbia Univ.): Morphine, the ageless prima donna.
Because I have common research interests with these speakers, and close “academic relationship” with them, we have very good communication in this symposium. This vivid chat and discussion continued in the gala dinner party.