(一) H327、H600 家族的 DNA 甲基化分析
經CpG Island Searcher線上軟體(http://cpgislands.usc.edu/cpg.aspx)
檢測ATXN8OS與ATXN8基因，發現ATXN8基因之鄰近區域無豐富的 CpG島，而ATXN8OS與KLHL1之重疊區域有豐富的CpG島(圖一B)，
因此利用ATXN8OS基因引子F2、R2 (圖三A)，檢測SCA8 CTA/CTG三 核苷重複擴增的帕金森氏症病人H327和H600家族(表四)，ATXN8OS 基因5’端甲基化程度。圖四A顯示未經酵素切割(-)、HpaII切割(H)、
MspI切割(M)的基因組DNA，未經過酵素切割者有一明顯的DNA色帶
(lane -)；由於辨識序列無論甲基化與否，均能被MspI切割，經MspI 切割後DNA呈smearing現象(lane M)，而HpaII僅能切割未甲基化的辨 識序列，故切割後的DNA片段明顯大於MspI切割者(lane H)。
圖四B顯示以上述三種實驗條件處理後之基因組DNA作為模版，
利用辨認ATXN8OS基因5’端區域之專一性引子進行PCR反應的結 果。未經過酵素切割的正控制組模板，於464 bp的位置有一明顯的產 物(lane -)，MspI切割後的負控制組模板則無(lane M)，而以HpaII切割 後的實驗組模板，則依此區域CCGG序列上的甲基化程度，而增幅出 不同強度的PCR產物(lane H)。SPINK5基因exon 29區域，因缺乏 CCGG 序列，故三種實驗條件處理後之基因組DNA模板，均能增幅 出343 bp的產物，作為內生性控制組。
圖四C為上述H327和H600家族甲基化程度量化結果，顯示各樣品 的CTG重複次數和甲基化程度沒有一定的關連性。
(二) SCA8 胚胎腎臟細胞株的 DNA 甲基化分析
利用 ATXN8OS cDNA 基因引子 F2、R3 (圖三 B)，檢測 SCA8 胚 胎腎臟細胞株(CR)0、(CR)23、(CR)88、(CR)157的 ATXN8OS 基因甲基 化情形。圖五A 為未經酵素切割(-)、HpaII 切割(H)、MspI 切割(M) 的基因組DNA，圖五 B 為以上述處理後 DNA 為模板之 PCR 產物，
包括494 bp 的 ATXN8OS cDNA 基因及，464 bp 的 ATXN8OS 內生性 基因，圖五C 為 cDNA 基因(白色柱子)和內生性基因(黑色柱子)的甲
基化程度量化圖，顯示CTG 重複次數和甲基化程度沒有一定的關連
性。
由於酵素切割若不完全，會導致甲基化程度的誤判，故進一步利 用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit 處理 SCA8 (CR)23~157胚胎腎臟細胞 株 DNA，使 DNA 序列上沒有甲基化的 C 鹼基轉變為 U 鹼基，CpG 上的C 鹼基若發生甲基化，則維持 C 鹼基。Sodium bisulfate 處理後 的模板經特定引子F6、R6 (表一)增幅後，再藉定序比較 T 鹼基與 C
鹼基的訊號強弱，來推知樣本的甲基化程度。結果所分析的 CpG 位
置了全都被修飾成T，表示均未被甲基化，包括 PCR-based 限制酶檢 測所辨認的二個CCGG 在內(圖六)。
(三) SCA8 胚胎腎臟細胞株的染色質結構分析
利用辨識組蛋白 H3 上特定修飾的抗體及 cDNA 引子(圖七)，來 檢查 SCA8 CTA/CTG 重複擴增與染色質結構的關係，結果顯示於圖 八。如圖八 A 所示，與未受超音波震盪處理相較(lane -)，經過超音 波震盪後，DNA 被震碎成小片段呈 smearing 現象(lane +)。超音波處 理後將樣品分成未進行免疫沈澱、不加抗體但進行免疫沈澱、加抗體 進行免疫沈澱三組，免疫沉澱反應的抗體包括辨認 dimethyl Histone H3 lysine 9 及辨認 acetyl Histone H3 lysine 14 的抗體。dimethyl Histone H3 lysine 9 的組蛋白修飾代表染色質結構緊密、低基因轉錄活性，而 acetyl Histone H3 lysine 14 的組蛋白修飾則代表染色質結構鬆散，利 於基因轉錄作用。如圖八B、C 所示，dimethyl Histone H3 lysine 9 抗 體免疫沉澱的DNA 模板，PCR 增幅後於(CR)157細胞株檢測到代表染 色質結構緊密的 ATXN8OS cDNA 片段；acetyl Histone H3 lysine 14 抗 體免疫沉澱的 DNA 模板，PCR 增幅後則於(CR)23、(CR)88細胞株檢 測到代表染色質結構鬆散的 ATXN8OS cDNA 片段。即結果顯示，SCA8 CTA/CTG 重複 157 次時可能會導致染色質結構較緊密，而重複 23 次 或88 次時染色質結構是較為鬆散的。
(四) SCA8 淋巴細胞株的染色質結構分析
利用年齡、性別配對的淋巴細胞株(表五)，來探討 ATXN8OS 基
因之染色質結構。各淋巴細胞株的SCA8 基因 CTA/CTG 重複的數目 顯示於圖九。如圖十所示，dimethyl Histone H3 lysine 9 抗體免疫沉澱 的 DNA 模板，PCR 增幅後於 P3 (95~185 次重複)、P4 (120 次重複) 檢測到代表染色質結構緊密的 ATXN8OS 464-bp gDNA 片段，顯示 P3 與P4 之 ATXN8OS 基因 exon D 到 intron D 的染色質結構較為緊密，
但exon A ~ 3’ flanking 的染色質結構並不見類似的緊密狀況。acetyl Histone H3 lysine 14 抗體免疫沉澱的 DNA 模板，PCR 增幅後則於各
細胞株皆檢測到代表染色質結構鬆散的 ATXN8OS 464-bp 及 401-bp gDNA 片段。
三、 SCA8 淋巴細胞株的細胞存活率分析
上述年齡、性別配對的三組淋巴細胞株，經 proteasome 抑制劑 MG-132 或細胞自戕刺激物 staurosporine 處理後，藉由 trypan blue 排
除檢測，結果如圖十一所示。正常人淋巴細胞株經 0、50、200 nM MG-132 處理後，死亡率分別是 7.7~8.8、8.5~10.1、13.0~13.9%，病 人淋巴細胞株則分別是 8.2~9.1、9.0~12.2、18.8~25.1%，在 200 nM 濃度處理下，病人淋巴細胞株的死亡率顯著高沒有處理的細胞(P =
0.029~0.039)，正常人淋巴細胞株處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.050~0.092) (圖十一 A)。
正常人淋巴細胞株經0、10、50 nM staurosporine 處理後，死亡 率分別是7.7~9.0、8.1~10.4、11.7~15.4%，病人淋巴細胞株則分別是 8.4~9.1、9.5~15.1、20.2~23.6%，在 50 nM 濃度處理下，病人淋巴細 胞株的死亡率顯著高沒有處理的細胞(P = 0.004~0.034)，正常人淋巴 細胞株處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.074~0.191) (圖十一 B)。
四、 SCA8 淋巴細胞株的 caspase-3 活性分析
藉由 EnzChek Caspase-3 Assay Kit，進一步分析上述 50 nM staurosporine 處理後的淋巴細胞株的 Caspase-3 活性，結果顯示於圖 十二。正常人淋巴細胞株經0、50 nM staurosporine 處理後，Caspase-3 活性分別是 0.60~0.73、0.64~0.98 μM，病人淋巴細胞株則分別是 0.59~1.02、1.22~1.87 μM，在 50 nM 濃度處理下，病人淋巴細胞株的 Caspase-3 活性顯著高沒有處理的細胞(P = 0.007~0.015)，正常人淋巴 細胞株處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.128~0.687)。
肆、討論
一、 SCA8 CTA/CTG 重複之遺傳分析
本研究分析臺灣地區四個不同樣品群之SCA8 CTA/CTG 重複次 數，包含69 位正常人、74 位帕金森氏症患者、55 位原發性顫抖症患 者、90 位其他神經疾病患者，結果顯示各樣品群皆以 18 次為出現最 多的對偶基因頻率(22.3~25.5%)，而第二常見之重複次數則多為 24 次 (11.5~16.1%) (圖二、表二)。此結果與本實驗室先前的研究結果大致 符合(洪, 2005; 黃, 2006; 林, 2007)。
本研究中於正常人樣品群及其他神經疾病樣品群中共發現三個 CTG 重複擴增的對偶基因，分別是 90 次重複[(CTA)10(CTG)80，正常 人]、104 次重複[(CTA)9(CTG)95，肌肉營養不良症]、106 次重複 [(CTA)9(CTG)97，肌肉營養不良症] (表三)。SCA8 雖然在極少數正常
人及精神疾病、富來德瑞克氏共濟失調症、帕金森氏症、阿茲海默氏 症中被報導過(Worth et al., 2000; Sobrido et al., 2001)，但未見於肌肉
營養不良症。而肌肉營養不良症主要是由於 PABPN1 (polyadenylate binding-protein nuclear 1)基因有不正常的三核苷酸重複擴增轉譯出多 丙氨酸(polyalanine)所導致，因此這兩位有血源關係的肌肉營養不良 症患者，其 SCA8 CTG 重複擴增與造成疾病之間的關係有待進一步
的探討。
二、 SCA8 外遺傳研究
(一) DNA 甲基化分析
利用CpG Island Searcher 軟體檢測與 SCA8 相關的 ATXN8OS 及 ATXN8 基因，結果發現 ATXN8OS 與 KLHL1 之重疊區域有 CpG 島(圖
一 B)，因此藉 CTA/CTG 重複擴增的帕金森氏症病人及其家族(表四) 與SCA8 胚胎腎臟細胞株(林, 2007)，來進一步探討此區域甲基化程度 與 CTG 重複擴增的關聯。首先，利用 PCR-based 限制酶檢測技術，
檢查 DNA 甲基化程度，結果發現各樣品之 DNA 皆有甲基化現象，
但是其甲基化程度與帕金森氏症性狀和重複擴增次數無顯著關係(圖 四、圖五)。進一步利用 Sodium bisulfate 定序分析技術探討 SCA8 胚
胎腎臟細胞株其DNA 甲基化程度。結果發現 CTG 長度不論(CR)23、 (CR)88、(CR)157，所檢視區域 CpG 位置上的 C 皆全部修飾成 T，即 DNA 無甲基化現象(圖六)。此結果和上述 PCR-based 限制酶檢測結果 不符。
PCR-based 限制酶檢測須藉 HpaII、MspI 酵素切割 DNA 樣品，若
酵素作用不完全就會影響其PCR 結果，所以不是一個很精準的技術。
相對的，bisulfate 定序分析可確切得知每一個 CpG 位置上的甲基化程 度，所以利用此技術所分析出的結果其可信度較高。可能由於 HpaII、
MspI 限制酵素切割不完全，而導致甲基化程度的誤判。由 bisulfate
定序分析結果顯示 SCA8 的 CTG 重複擴增現象和甲基化程度沒有關 連，所以甲基化在此疾病中扮演的角色還有待進一步的研究查證。
(二) 染色質結構分析
染色質可藉不同組蛋白修飾改變其結構，調控基因的轉錄與表 現。組蛋白H3 的第九、第十四個胺基酸-離胺酸之乙醯化與染色質結 構鬆散、基因轉錄活化有關，而組蛋白H3 的第九胺基酸-離胺酸發的 甲基化修飾，則與染色質結構緊密、基因轉錄抑制相關(Yan and Boyd, 2006)。本研究利用 SCA8 胚胎腎臟細胞株及 anti-dimethyl-H3-K9 (緊 密染色質結構)、anti-acetylated-H3-K14 (鬆散染色質結構)兩種抗體的
染色質免疫沉澱及PCR 技術，來探討 ATXN8OS cDNA 基因之染色質 結構(圖八)。結果發現當 SCA8 的 CTG 三核苷酸重複擴增次數為 157
時，會導致 ATXN8OS cDNA 基因染色質結構變得較緊密(圖八 B，
cDNA 5’端的 494-bp 片段及 3’ 端的 213-bp 片段)，但是 88 次的 CTG 三核苷酸重複擴增並未改變 ATXN8OS cDNA 基因染色質結構。染色 質結構緊密的 anti-dimethyl-H3-K9 抗體(圖八 B)與染色質結構鬆散的
anti-acetylated-H3-K14 抗體(圖八 C)的實驗結果是符合的。
進一步利用年齡、性別配對的淋巴細胞株(表五)重複上述實驗(圖 十)。結果顯示兩位病人(P3，95~185 次重複；P4，120 次重複)之 ATXN8OS 基因之染色質結構較為緊密(圖十 B，gDNA 5’端的 464-bp
片段)，三位正常人(C1、C2、C3)及另兩位病人(P1，88 次重複；P2，
92 次重複)則較為鬆散。但 anti-acetylated-H3-K14 抗體的實驗結果顯 示所檢測的各樣品都是染色質結構鬆散(圖十 C)，與代表染色質結構
緊密的 anti-dimethyl-H3-K9 抗體的結果(圖十 B)不完全符合。即在 P3、P4 病人中可同時檢測到緊密和鬆散的 ATXN8OS 基因染色質結 構。可能因為兩位病人皆為異型合子擴增突變的病人(表五)，因此會 看到兩種染色質結構狀況。另外，P3 病人因 CTG 重複不穩定，出現 95~185 次多種重複序列(黃, 2006)，也可能導致染色質免疫沉澱實驗 中看到兩種不同的染色質結構。綜合 SCA8 胚胎腎臟細胞株及淋巴細 胞株的實驗結果，推論SCA8 CTA/CTG 的重複次數在 120 次以上時，
可能導致緊密的染色質結構。
先前Greene 等人於 GAA 三核苷酸擴增的富來德瑞克氏共濟失調 症的研究中，以染色質免疫沉澱的技術分析 frataxin (FXN)基因的染 色質結構與其表現的關聯，結果發現 FRDA 的患者於 FXN 基因的啟 動子區域有較高的dimethyl H3-K9，同時患者的 FXN mRNA 表現量
下降(Greene et al., 2007; Al-Mahdawi et al., 2008)。即 GAA 三核苷重
複擴增會導致染色質結構緊密，進而影響蛋白因子與 FXN 啟動子結
複擴增會導致染色質結構緊密，進而影響蛋白因子與 FXN 啟動子結