脊髓小腦共濟失調症：第八型脊髓小腦共濟失調症之外遺傳與細胞模式研究

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(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士論文. 脊髓小腦共濟失調症：第八型脊髓小腦共濟失調症之外遺傳與細胞模式研究 Spinocerebellar ataxia: Epigenetic and cell model studies of SCA type 8 研究生：李金玨 Ghin-chueh Lee. 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen. 中華民國九十八年六月.

(2) 誌謝隨著論文的完成，我在師大三年的碩士生涯也即將劃下句點；從之前就讀高師大利用寒暑假來師大做實驗，一直到自己能如願考上師大生科系碩士班，而走到至今能夠順利畢業，這一路走來，我真的真的要感謝太多人的幫忙與關懷。本論文的完成，首先要感謝我的恩師李桂楨老師，對於我的實驗以及論文指導上給予很大的幫忙，也讓我在研究的過程中獲益良多，在我面臨實驗的挫折時，老師的關懷與鼓勵是讓我堅持努力下去的勇氣；感謝我的口委謝秀梅老師和陳瓊美醫師，因為有您們的教導與指正，讓我的論文更加完整；此外，要特別感謝帶我進入分生領域的王憶卿老師，在我轉換到生科領域的路途上，老師給予我很多的學習機會，讓我能夠實現我的夢想；也要感謝林口長庚紀念醫院、台北榮民總醫院在血液樣本及淋巴細胞株方面的提供，讓我能順利進行實驗。實驗室的歡樂氣氛彷彿在我的研究生活中注入一股活力，感謝實驗室的大家：玄原學長、怡辰學姐、士寰學長同是一起為 SCA8 打拼的夥伴們，不僅在我實驗的指導上給予很大的幫忙與鼓勵，大家活潑開朗的個性更是為實驗室帶來許多歡笑；承岳學長、淑宜學姐、宜欣學姐、李姐、秀觀學姐、志信學長、芷英學姐、雅今學姐、雰茹學姐、.

(3) 襄銘學長、若芸學姐、慧茹學姐、郡潔學姐，感謝您們在研究上的協助與提醒，沒有您們的幫忙與指正，就不能順利完成我的實驗；佩瑛、昇翰、玄竺更是我在研究生涯中一起共同努力打拼好同學，多虧有你們的陪同和鼓勵，在我面臨實驗困難時注入一股溫暖；感謝學弟妹們品蓉、春嫻、軒浩、國修、郁芳、亦鈞、伯勳、柚子……等，平時在生活上對我的照顧與幫忙，每次在我實驗來不及吃午餐時，貼心的幫我買便當，你們活潑開朗的個性，也為實驗室帶來不少歡樂；另外還要感謝大學時期在王憶卿老師實驗室的學長姐：芳宜學姐、信銘學長、一泓學姐、世華學長、素芬學姐、家揚學長、偉苓學姐、一麟學長、逸萱學姐……等，在我剛踏入分生領域時，你們給予我很多指導與鼓勵；還要感謝鄰近實驗室的學長姐芳足學姐、明聰學長、慶孝學長、心嚴學姐以及一起共同奮鬥的好朋友翊萱、薏婷、逸涵、高妹、孝文、俊彥、子瑋…..等，研究所的生活也因為有了你們而多采多姿。除了老師與夥伴們外，還要特別感謝我的家人，爸爸、媽媽從小對我的栽培，以及四位姊姊們和姊夫們在背後的支持與鼓勵，特別是我的姊姊兼學姐金祝和姊夫兼學長哲維，他們是我在轉換生科跑道上的重要貴人，在我面臨跨領域所遇到的困難與挫折時，他們總是不斷的鼓勵我陪伴我走過低潮期，在我的研究生涯中扮演不可或缺的角.

(4) 色，真的非常感謝我的家人！最後，要感謝一直默默在背後支持陪伴我的男友哲泓，一起陪我渡過了這艱難的研究所生涯。這一路走來，我要感謝太多人的幫忙，這段豐富的研究旅程讓我學習到不少寶貴的人生經驗，是我人生中最珍貴的禮物，再一次感謝大家的加持，未來我會帶著大家的祝福，勇往直前的繼續努力完成我的夢想！.

(5) 目錄. 目錄............................................................................................................. I 中文摘要.................................................................................................. IV 英文摘要................................................................................................... V 圖表次...................................................................................................... VI 壹、緒論.................................................................................................... 1 一、脊髓小腦共濟失調症(SCA)...................................................... 1 二、第八型脊髓小腦共濟失調症(SCA8)........................................ 3 三、SCA8 的可能致病機轉 ............................................................. 4 (一) KLHL1 的功能缺失(loss of function)................................. 5 (二) RNA gain-of function .......................................................... 5 (三) PolyQ擴增蛋白 .................................................................... 6 四、外遺傳(Epigenetic)修飾與基因表現的調節............................ 7 (一) DNA甲基化 ......................................................................... 7 (二) 組蛋白修飾 ......................................................................... 8 (三) 三核苷酸重複擴增和染色質結構..................................... 8 五、SCA的淋巴細胞株模式研究 .................................................... 9 六、研究動機與目的....................................................................... 10. I.

(6) 貳、研究材料與方法 ............................................................................. 12 一、研究材料................................................................................... 12 二、細胞株的培養及冷凍保存 ...................................................... 12 三、基因組DNA萃取...................................................................... 13 四、SCA8 (CTG)n重複分析 .......................................................... 14 五、PCR-based限制酶檢測............................................................ 14 六、Sodium-bisulfat定序 ............................................................... 15 七、染色質免疫沈澱-PCR (ChIP- PCR) ..................................... 16 八、淋巴細胞的存活率分析 .......................................................... 18 九、caspase-3 活性分析 ................................................................. 19 參、結果.................................................................................................. 20 一、SCA8 CTA/CTG重複之遺傳分析.......................................... 20 二、SCA8 外遺傳研究(epigenetic studies)................................... 20 (一) H327、H600 家族的DNA甲基化分析 ............................. 20 (二) SCA8 胚胎腎臟細胞株的DNA甲基化分析..................... 22 (三) SCA8 胚胎腎臟細胞株的染色質結構分析...................... 23 (四) SCA8 淋巴細胞株的染色質結構分析............................. 23 三、 SCA8 淋巴細胞株的細胞存活率分析.................................. 24 四、 SCA8 淋巴細胞株的caspase-3 活性分析 ............................ 25. II.

(7) 肆、討論.................................................................................................. 26 一、 SCA8 CTA/CTG重複之遺傳分析 ....................................... 26 二、 SCA8 外遺傳研究.................................................................. 27 (一) DNA甲基化分析................................................................ 27 (二) 染色質結構分析 ............................................................... 28 (三) DNA甲基化與組蛋白修飾之關係 ................................... 30 三、 SCA8 淋巴細胞株的細胞存活率與caspase-3 活性分析 .... 31 伍、參考文獻.......................................................................................... 34 陸、附錄圖表.......................................................................................... 46. III.

(8) 摘要第八型脊髓小腦共濟失調症(SCA8)是第一個被報導的單一三核苷重複擴增突變、由DNA兩股分別產生致病性的RNA (ATXN8OS)及蛋白質(ATXN8)產物的疾病。SCA8外顯性不完全，基因突變也見於極少數正常人及其他神經性疾病。ATXN8OS基因5’端有明顯的CpG島。本研究首先檢視正常人族群及帕金森氏症患者、原發性顫抖症及其他神經相關疾病患者族群之SCA8基因CTG重複變異，結果共發現一位正常人及兩位相關的肌肉營養不良症患者具CTG重複擴增的對偶基因。其次，在SCA8外遺傳研究方面，利用SCA8 CTG擴增的病人及其家屬及帶有SCA8 0~157個複合重複序列的胚胎腎細胞株DNA樣品，以PCR-based限制酵素及bisulfite定序技術，檢測ATXN8OS與KLHL1基因重疊序列上的CpG島甲基化情形。結果並未觀察到甲基化現象。另外也利用辨識緊密或疏鬆染色質結構的抗體及染色質免疫沈澱-PCR 技術，來檢測SCA8基因的染色質結構。結果觀察到與CTG重複擴增相關的緊密染色質結構，但與DNA甲基化無關。最後，利用年齡、性別配對的正常人和CTG重複擴增病患的淋巴細胞株，探討對細胞自戕刺激物staurosporine或proteasome抑制劑MG-132的敏感性。病人淋巴細胞株在staurosporine (50 nM)及MG-132 (200 nM)濃度處理下，細胞死亡率顯著增加的結果，顯示SCA8的CTG重複擴增具細胞毒性。. IV.

(9) Abstract Spinocerebellar ataxia type 8 (SCA8) involves the expression of an expanded CTG/CAG combined repeats from opposite strands producing CUG expansion transcripts (ATXN8OS) and a polyglutamine expansion protein (ATXN8). SCA8 disease does not show complete penetrance and repeat expansions have been found among unaffected individuals and patients with other neurological diseases. An apparent CpG island was observed within the 5’ region of the ATXN8OS gene. In this study, we screened the SCA8 CTG repeats distribution in normal controls and in patients with various neurodegenerative diseases. A tatal of three subjects with expanded alleles was found, including one normal and two related oculopharyngeal muscular dystrophy. In the epigenetic studies, aberrant methylation in the overlapped ATXN8OS/KLHL1 gene exon 1 region was evaluated using DNA samples from patients with SCA8 expansions and stable HEK-293 lines carrying 0~157 combined repeats. PCR-based restriction enzyme assay and bisulfite-sequencing assay were performed for the measurement of CpG hypermethylation. No methylation was observed. Additionally, chromatin immunoprecipitation and PCR using antibody associated with repressed or open chromatin were performed to examine the chromatin structure of the SCA8 gene. A repeat length-dependent repression of chromatin structure, which is independent of DNA methylation, was observed. Finally, age and gender-matched lymphoblastoid cells with or without expanded SCA8 alleles were tested for their sensitivity to staurosporine (apoptotic stimulus) and MG-132 (proteosome inhibitor). The results of significant increase of cell death by staurosporine (50 nM) and MG-132 (200 nM) treatment further demonstrate that the expanded SCA8 repeats are toxic to human cells.. V.

(10) 圖表次圖一、ATXN8OS、ATXN8 與KLHL1 基因構造圖與CpG島預測分析 46 圖二、SCA8 CTG三核苷酸重複等位基因頻率及多型性基因型分佈圖 ...................................................................................................................47 圖三、PCR-based限制酶檢測之引子設計 ............................................48 圖四、H327 和H600 家族之ATXN8OS基因甲基化分析......................49 圖五、SCA8 (CR)0~157 胚胎腎臟細胞株的甲基化分析 ........................50 圖六、SCA8 (CR)23~157 胚胎腎臟細胞株的Bisulfite定序分析 .............51 圖七、免疫染色質沈澱-PCR之引子設計 .............................................52 圖八、SCA8 (CR)23~157 胚胎腎臟細胞株的CHIP-PCR分析 .................53 圖九、SCA8 淋巴細胞株的CTA/CTG重複區域的PCR分析 ...............54 圖十、SCA8 淋巴細胞株的CHIP-PCR分析 .........................................55 圖十一、SCA8 淋巴細胞株的Trypan blue排除檢測 ............................56 圖十二、SCA8 淋巴細胞株的Caspase-3 活性分析 ..............................57 表一、PCR之引子對及反應條件...........................................................58 表二、ATXN8OS基因CTG三核苷重複等位基因的頻率分佈..............59 表三、SCA8 CTA/CTG三核苷重複擴增的定序結果...........................60 表四、SCA8 CTA/CTG擴增的H327、H600 家族................................61 表五、SCA8 淋巴細胞株........................................................................62. VI.

(11) 壹、緒論. 一、脊髓小腦共濟失調症(SCA). 脊髓小腦共濟失調症(spinocerebellar ataxia；簡稱SCA)是一群體染色體顯性遺傳的神經退化疾病，一般簡稱為「小腦萎縮症」，其主要特徵為小腦共濟失調，但也包含中樞神經系統及其他部位之功能異常現象。SCA主要是由於小腦內的神經細胞出現漸進式的退化或萎縮現象，因而影響到行動的協調性，因此SCA患者會有漸進式的行動失調、步履蹣跚等共同症狀。雖然SCA存在典型病徵，但臨床上仍無法藉由病徵的辨別，來判定為何種類型的SCA患者，需要加上分子層次的診斷來界定。SCA目前仍無有效的根治方法，所以僅能利用藥物或物理治療來減輕其症狀。目前共報導了 28 種類型的 SCA (Manto, 2005; Yu et al., 2005; Cagnoli et al., 2006)。SCA 具有高度異質性(Schols et al., 2004; Manto, 2005)，大部份研究顯示 SCA3 為最普遍的 SCA 類型，台灣最常見的也是 SCA3 (Soong et al., 2001)。此外，SCA1、SCA2、SCA6-8 的盛行率皆超過 2%，其餘類型的 SCA 則較罕見(盛行率低於 1%)。在大部分已知突變基因的 SCA 類型中，其分子層次上有一共同點，就是大多以 CAG 三核苷為重複擴增單位。位於轉譯區的 CAG 1.

(12) 可轉譯出麩醯胺酸(glutamine；簡稱 Q)，如 SCA1、2、3、6、7、17 等。當致病基因 CAG 三核苷酸重複擴增時，其擴增次數會影響病患發病的年齡及臨床症狀，即擴增次數愈多發病年齡愈早且愈嚴重。此外，在病人的腦部組織中也可染到 poly-Q 蛋白質累積所形成的 inclusion，且多在細胞核中(Michalik and Van Broeckhoven, 2003; Koeppen, 2005)。細胞核中的 inclusion 可能會對神經細胞造成毒害 (Perez et al., 1998; McCampbell et al., 2000; Yamada et al., 2001)，或扮演某種保護的機制(Bowman et al., 2005)，因此 inclusion 在疾病中所扮演的角色仍有待查證。除了上述 polyQ 的 SCA 外，SCA10 是由於在致病基因內含子 (intron)部分的 ATTCT 五核苷重複擴增所造成(Grewal et al. 1998)， SCA12 是由於在致病基因 5’端非轉譯區(5’ untranslated region; 5’ UTR) 的 CAG 三核苷重複擴增所造成(Holmes et al., 1999)，SCA8 則是由於在致病基因 3’端非轉譯區(3’ UTR)的 CTG 三核苷酸重複擴增所造成 (Koob et al., 1999)。最後，還有一些非三核苷酸重複擴增所引起的 SCA，如 SCA5、 SCA14、SCA27。SCA5 是由於 βIII spectrin (SPTBN2)基因突變(Ikeda et al., 2006)所造成，SCA14 是由於 protein kinase Cγ gene (PRKCG)基因突變所導致(Chen et al., 2003)，SCA27 是由於 Fibroblast growth factor. 2.

(13) 14 (FGF14)基因突變所導致(van Swieten et al., 2003)。. 二、第八型脊髓小腦共濟失調症(SCA8). SCA8 最早在 1999 年被報導，主要由於染色體 13q21 的 ATXN8OS (ataxin 8 opposite strand)基因 3’ UTR 的 CTA/CTG 複合重複序列 (CTA/CTG combined repeat；簡稱 CR)擴增所造成(Koob et al., 1999)。 SCA8 患者在臨床上有發音困難、呼氣緩慢、步態失調及眼球震顫等症狀(Day et al., 2000)。此外，有些患者還會伴隨著智能障礙。SCA8 發病年齡分布於 18~65 歲間，平均值約為 39 歲，屬於晚發性的遺傳性疾病，因此容易將致病基因遺傳至子代，造成家族性遺傳。自 SCA8 在 1999 年被報導後，歐、美、亞各國學者的研究分析顯示，在正常人族群當中，SCA8 基因 CTA/CTG 的三核苷擴增數目多為 16~37 (Koob et al., 1999)，而在家族性及偶發性之運動失調患者中則發現 68 (Stevanin et al., 2000) ~ >1000 (Ikeda et al., 2004)三核苷擴增數目。此外，在 SCA8 家族中，複合重複序列擴增不一定和疾病性狀共分離(co-segregation)，且在精神疾病(psychiatric disorder)、富來德瑞克氏共濟失調症 (Friedreich’s ataxia) 、帕金森氏症 (Parkinson’s disease；簡稱 PD)、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease；簡稱 AD)等退化性神經疾病患者，甚至於極少數正常人當中，亦可見到異常的複合 3.

(14) 重複序列擴增(Koob et al., 1999; Worth et al., 2000; Sobrido et al., 2001; Mosemille et al., 2003; Schols et al., 2003; Ikeda et al., 2004)。因此 CTA/CTG 重複擴增次數和造成 SCA8 疾病之產生的相關連性還有待證實。 SCA8 複合重複序列可以(CTA)1-21(CTG)n 形式來表示，(CTA)1-21 在遺傳上較穩定，但 CTG 重複較不穩定，次數會隨著子代的承傳而有所增減(Silveira et al., 2000)。另外，學者也發現由母親遺傳來的 CTG 重複會有擴增的現象，導致外顯性(penetrance)較高，且有 anticipation 的現象，即子代的發病年齡會較親代提早且病情也較為嚴重。相反的，來自父系遺傳的 CTG 重複則會有縮減情形，發生疾病的外顯性也相對減弱(Silveira et al., 2000)。在 SCA8 患者中觀察到的複合重複序列，可能是不間斷的 CTG 重複序列，或是插入單個或多個 CCG、 CTA、CTC、CCA、CTT 等(Ikeda et al., 2000; Schols et al., 2000; Silveira et al., 2000; Juvonen et al., 2002)。. 三、SCA8 的可能致病機轉. SCA8 的可能致病機轉十分複雜，除了在 ATXN8OS 基因的 exon A 上有未轉錄的 CUG 重複擴增之外，從另一方向的 ATXN8 (ataxin 8) 基因上也可轉譯出 polyQ 擴增蛋白(Ikeda et al., 2007)及對 KLHL1 基因 4.

(15) 的反義(antisense)調控(圖一)。. (一) KLHL1 的功能缺失(loss of function):. ATXN8OS 基因的 mRNA 5’端和 KLHL1 (Kelch-like 1)基因的 mRNA 5’端具互補性(Nemes et al., 2000)，此互補的情形，也可在老鼠的基因體結構中看到(Benzow and Koob, 2002)，故在演化上具有高度保留性。故 ATXN8OS 可能藉此 antisense RNA 機制，來調節 KLHL1 基因的表現。人類的 KLHL1 蛋白和果蠅中的 kelch 蛋白在結構上有高度相似性(Robinson and Cooley, 1997)。果蠅 kelch 蛋白質能和肌動蛋白(actin)結合，進一步形成營養細胞(nurse cell)的環管(ring canal)。人的 KLHL1 蛋白質包含 748 個胺基酸，專一性表現在包括小腦在內的腦部組織(Nemes et al., 2000)。KLHL1 蛋白的功能主要和軸突的分枝有關(Seng et al., 2006)。在小鼠的浦金埃神經(purkinje neurons)中將 KLHL1 基因去除，會導致神經元樹突的損傷、步伐的異常形態以及漸進式的運動協調能力缺失(He et al., 2006)。另外，KLHL1 蛋白亦可能調節一些 ligand-和 voltage-gated Ca2+離子孔道(Aromolaran et al., 2007)。因此 ATXN8OS 對於細胞正常功能維持具有很重要的意義。. (二) RNA gain-of function 5.

(16) 除了 SCA8，CTG 擴增所造成的遺傳性神經退化疾病還包括肌強直萎縮症第一型(Dystrophia myotonica type 1；DM1)。DM1 是由於 DMPK (Dystrophia myotonica-protein kinase)基因 3’端非轉譯區 CTG 三核苷擴增所導致(Brook et al., 1992; Fu et al., 1992; Mahadevan et al., 1992)。DM1 可能的致病機轉包括藉由 RNA gain-of function 造成疾病 (Ranum and Day, 2004)。在 DM1 細胞模式中，擴增的 CUG mRNA 在細胞中會累積形成 ribonuclear foci，因而改變一些 CUG 結合蛋白質如 CUG-BP、MBNL、MBLL、MBXL 等 RNA 結合蛋白的功能(Fardaei et al., 2002; Miller et al., 2000)，並影響氯離子孔道基因(Charlet-B et al., 2002)和胰島素接受器基因(Savkur et al., 2001)選擇性裁接的改變。在 SCA8 果蠅模式中，亦發現異常表現的 ATXN8OS mRNA 會和一些 RNA 結合蛋白質如 staufen、muscle-blind、split ends 等相互作用，導致果蠅的視覺接受器和色素細胞產生漸進式的退化 (Mutsuddi et al., 2004)。由於 SCA8 擴增的 CUG 亦導致 ribonuclear foci 的形成(洪, 2005)，因此 RNA gain-of function 在 SCA8 的致病機轉中亦可能扮演角色。. (三) PolyQ 擴增蛋白. 6.

(17) 2006年SCA8基因轉殖鼠模式的研究，發現在浦金埃細胞(purkinje cell)和腦幹神經元(brainstem neurons)中有polyQ擴增蛋白，對神經細胞造成毒害(Moseley et al., 2006)。此polyQ蛋白應源自於CAG擴增方向的ATXN8基因(圖一)。不過ATXN8基因的啟動子(promoter)及轉錄的 mRNA目前尚未被定義出。. 四、外遺傳(Epigenetic)修飾與基因表現的調節. 外遺傳的修飾因子大致可分為兩大種類：DNA 甲基化(DNA methylation)、組蛋白的修飾作用(Histone modifications) (Bernstein et al., 2007)。. (一) DNA 甲基化. DNA 甲基化大部分發生於 CpG 位上(Bird, 2002)。甲基化會透過影響染色質絲的結構(chromatin structure)，進而降低基因的轉錄活性。此外，甲基化程度的變化亦可能影響核苷酸重複的穩定性。如有研究報導指出，利用 DNA 甲基化轉移酶抑制劑 (DNA methyltransferase inhibitor)使 DNA 去甲基化，可藉由增加同源重組 (homologous recombination)促進三核苷酸重複的不穩定(Gorbunova et. 7.

(18) al., 2004)。DNA 去甲基化亦可能透過不同的路徑而使三核苷酸重複不穩定(Dion et al., 2008)。故此世代間的核苷酸重複不穩定性的機制仍不明確。. (二) 組蛋白修飾. 根據「組蛋白密碼(histon code)」假說，組蛋白的氨基端有乙醯化(acetylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)和泛素化(ubiquitination)等轉譯後修飾，來調節基因的表現(Strahl and Allis, 2000)。如 H3 的 lysine9 (H3K9)、H3K27、H4K20 甲基化與基因抑制 (repression)有關，而 H3K4、H3K36 甲基化以及 H3K14 乙醯化與基因活化(active)有關(Bannister et al., 2002; Fischle et al., 2003; Ng et al., 2003)。H3K4 甲基化可能透過專一性 HMT Set9 因子和一些共同活化的複合體，或透過抑制一些核小體組裝(nucleosome remodelling)蛋白和去乙醯化抑制物複合體的結合，而達到基因轉錄活化的目的 (Nishioka et al., 2002; Zegerman et al., 2002; Sedkov et al., 2003)。. (三) 三核苷酸重複擴增和染色質結構. 和 SCA8 相類似的肌強直萎縮症的研究，發現擴增的 CTG 三核 8.

(19) 苷酸重複會改變鄰近的染色質結構(Otten and Tapscott, 1995)。在 Friedreich ataxia (FRDA)的研究中，利用人類淋巴細胞株、大腦組織切片及轉殖基因鼠來探討 frataxin (FXN)基因的染色質結構，也發現擴增的 GAA 三核苷酸重複會使 FXN 基因的染色質結構較為緊密 (Greene et al., 2007; Al-Mahdawi et al., 2008)。此外，先前的研究亦報導一 α 型海洋性貧血(α-thalassemia)患者因為 LUC7L 基因的部份缺失，產生一反義 RNA，而導致鄰近正常的 HBA2 (α-globin)基因不表達(Tufarelli et al., 2003)。此種基因沈默主要是和 CpG 島(CpG island) 的甲基化有關。此部份缺失 LUC7L 基因和 HBA2 α-globin 基因之間產生反義 RNA 的關係，和 ATXN8OS 基因與 KLHL1 基因之間的關係十分類似。. 五、SCA 的淋巴細胞株模式研究. 雖然 SCA 的病理特徵主要出現在小腦，SCA 的致病基因在非腦部的其他組織亦多有表現。 SCA 及另一 CAG 重複擴增疾病 Huntington's disease (HD)的研究顯示，患者包括淋巴球在內的周邊組織也會出現病變，如西方轉漬分析及免疫化學分析顯示 SCA7 患者的淋巴細胞株中 Hsp27、Hsp70 蛋白的表現量顯著降低(Tsai et al., 2005)。HD 患者的周邊細胞中 Akt 活性較正常人低(Colin et al., 9.

(20) 2005) ，且 HD 患者的淋巴球中基因表現的情形亦有顯著變化 (Borovecki et al., 2005)。先前本實驗室建立了正常人和 CTG 重複擴增病患的淋巴細胞株，RT-PCR 分析顯示 ATXN8OS 及 KLHL1 mRNA 在淋巴細胞株中亦有表現(黃, 2006)。故 SCA8 CTG 重複擴增的淋巴細胞株對細胞自戕刺激物、proteasome 抑制劑等藥物的敏感性，亦為一值得探討的問題。. 六、研究動機與目的. 自1999年SCA8被報導以來，SCA8的CTG重複擴增現象除了出現在遺傳性和偶發性的運動失調患者外，也被報導於帕金森氏症、阿茲海默氏症、Friedreich’s運動失調症等退化性神經疾病及精神病患者，和極少數正常人當中。而先前實驗室學長姐已經進行初步的分析，也在台灣的PD患者中發現SCA8的CTG有重複擴增現象(Wu et al., 2004; 黃, 2006; 林, 2007)。本研究延續之前的實驗成果，繼續擴大建立臺灣正常族群、帕金森氏症、原發性顫抖症、舞蹈症及肌張力異常症等其他神經疾病患者的SCA8 CTG三核苷酸重複次數的遺傳資料庫，以提供臨床診斷諮詢的參考。在外遺傳研究方面，主要會針對ATXN8OS、KLHL1基因互補的exon 1區域進行甲基化分析，除了利用以PCR為基礎的限制酶檢測試驗，分析CTG擴增的病人及其家屬和帶有0、23、88、157個 10.

(21) CTA/CTG複合重複的人類胚胎腎HEK-293細胞株(林, 2007)外，也會藉由Bisulfite定序分析，來檢測這些HEK-293細胞株其ATXN8OS、 KLHL1基因互補的exon 1甲基化情形。另外，由於CTG三核苷重複擴增可能引發鄰近區域染色質結構的改變，因此我們利用上述HEK-293 細胞株及淋巴細胞株，藉由染色質免疫沈澱法 (Chromatin Immunoprecipitation)來檢測SCA8基因之染色質結構，來探討外遺傳是否影響SCA8穿透度。最後利用正常人和CTG重複擴增病患的淋巴細胞株，經細胞自戕刺激物staurosporine或proteasome抑制劑MG-132 處理後，利用trypan blue排除檢測細胞存活情形，來探討SCA8 CTG 重複擴增是否影響細胞對上述藥物的敏感性。. 11.

(22) 貳、研究材料與方法. 一、研究材料. 經診斷判定無精神疾病或神經退化性疾病的正常人(69 位)、帕金森氏症(74 位)、原發性顫抖症(55 位)、舞蹈症及肌張力異常症等其他疾病和其家屬(45 位)的DNA樣品，由林口長庚紀念醫院神經內科吳逸如醫師、陳瓊美醫師提供。3 組年齡、性別配對的正常人與SCA8 CTG 重複擴增病患的淋巴細胞株，由林口長庚紀念醫院神經內科吳逸如醫師、陳瓊美醫師及台北榮民總醫院周邊神經科宋秉文醫師提供。血液樣品之採集皆經由本人或是家屬同意。. 二、細胞株的培養及冷凍保存. 正常人和 SCA8 CTG 重複擴增患者淋巴細胞株細胞培養於 37℃、含 5% CO2 且溼度良好的培養箱中，培養液為含 10%胎牛血清、 1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/L sodium bicarbonate 之 RPMI 1640 (Gibco)。每隔 2-3 天加 5 或 10 ml 培養液至培養瓶中，待培養液到一定體積後，離心 1000 rpm 5 分鐘，去上清液後換至新培養瓶中，繼代培養。. 12.

(23) 帶有不同 SCA8 CTA/CTG 重複次數(0R、23R、88R 和 157R)的人類胚胎腎臟細胞(林, 2007)，培養於 37℃、含 5% CO2 且溼度良好的培養箱中，培養液為含 10%胎牛血清、1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/L sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin 及 100 U/ml streptomycin 之 DMEM (Gibco)。繼代培養時，先以 PBS 清洗細胞一次後，再以 Trypsin-EDTA solution (含 0.05% Trypsin 及 0.02% EDTA)將細胞沖散，取適當比例將之繼代培養。冰凍保存細胞時，將細胞以離心 1000 rpm 5 分鐘，收集細胞 pellet，棄上清液，加入 1 ml 含 12.5% DMSO 的培養液，置於-20℃ 2 小時及-80℃隔夜後，保存於液態氮中。. 三、基因組 DNA 萃取. SCA8 淋巴細胞株及胚胎腎臟細胞株基因組 DNA 的萃取係採用 STRATAGENE DNA Extraction Kit (Stratgene)，其步驟如下：首先，將 107 細胞收集離心 1000 rpm、5 分鐘，再以 PBS 清洗細胞兩次後，將細胞離心收集至 15ml 離心管中，加入 solution II 2ml，震盪使核沉澱懸浮，再加入 10 µl protease K，置於 37℃水浴隔夜或作用數天。待 proteinase K 反應結束後，將各管放置冰上 10 分鐘，再加入 solution III 800 µl 沈澱蛋白質。放置冰上五分鐘後，離心 3400 rpm 15 分鐘。取 13.

(24) 上清液加入 RNase，置於 37℃15 分鐘，再加入 0.8 倍體積異丙醇，搖晃使 DNA 析出，將沈澱出的 DNA 轉移到新的微量離心管，離心 14000 rpm 1 分鐘，沉澱 DNA；去上清液後，加入 0.5 ml 75%酒精清洗，離心 14000 rpm 1 分鐘，去上清液，風乾後溶於適量 ddH2O 中；以 OD260 吸光值測定 DNA 濃度，稀釋成 50 ng/µl 後，置於 4℃冰箱備用。. 四、SCA8 (CTG)n 重複分析. 取 100 ng 的基因組 DNA，置於 25 µl 的 PCR 反應中，放大包含 SCA8 CTG 三核苷酸重複的片段。PCR 之引子對(F1、R1)及反應條件 (49℃煉和溫度、1.5 mM MgCl2、10% DMSO)如表一。反應後以 1.4% 洋菜膠體電泳檢查後，以二次水稀釋 PCR 產物(1:16 比例)，取 2 μl 稀釋產物，委託國立台灣師範大學遺傳多樣性實驗室進行基因型分析 (MegaBACE500，Amersham Biosciences Ltd.)，並以軟體 MegaBACE Genetic profile v.1.5 軟體分析其長度，推算三核苷酸重複次數。所檢測到的擴增的重複次數樣本，進一步以 1.4%洋菜膠電泳純化 PCR 產物，進行 DNA 定序，確認三核苷酸重複次數。. 五、PCR-based 限制酶檢測. 14.

(25) 利用辨識相同序列(C↓CGG)的限制酵素 HpaII、MspI 對甲基化 CpG 是否能切割(HpaII 無法切割有甲基化的 CpG，MspI 則無論甲基化否都可切割)，分析帶有 CTG 擴增的病人 DNA 樣品和 SCA8 胚胎腎臟細胞。將各 DNA 樣品分別用 HpaII (實驗組)、MspI (負控制組) 或不添加酵素的緩衝液(正控制組)，於 37℃處理 48 小時後，以 0.8% 洋菜膠體電泳檢查。將上述處理的 DNA 為模板，進行聚合酶連鎖反應(PCR)。SCA8 淋巴細胞株的引子對為 F2、R2，反應條件為 60℃煉和溫度、1.5 mM MgCl2，SCA8 胚胎腎臟細胞株的引子對為 2、R3，反應條件為 53℃ 煉和溫度、1.5 mM MgCl2 (表一)。SPINK5 基因引子對(F、R)作為內在控制組(表一) (黃, 2006)。反應結束後，以 1.4%洋菜膠體電泳檢查 PCR 產物，並以 Alphalmager 1200 影像系統作相對定量分析。. 六、Sodium-bisulfat 定序. 將 DNA 用 sodium bisulfate 處理之後，若此 DNA 之 C 鹼基沒有甲基化，會被修飾成 U 鹼基；反之，會維持 C 鹼基。故可區別甲基化及無甲基化 DNA。使用 EZ DNA Methylation-GoldTM Kit (ZYMO) 進行 Sodium bisulfate 處理，其步驟如下：首先，準備 1000 ng 的 SCA8 胚胎腎臟 15.

(26) 細胞株 DNA 樣品，加入 130 µl CT conversion reagent，於 98℃環境下作用 10 分鐘後，再以 64℃環境下作用 2.5 小時。加入 600 µl M-Binding buffer 至 Zymo-Spin IC column 中，再將上述處理過後的 DNA 樣品加入 column 中混勻，離心 14000 rpm，30 秒，去除廢液。加入 100 µl M-Wash buffer，離心 14000 rpm 30 秒，去除廢液，再加入 200 µl M-Desulphonation buffer，室溫作用 20 分鐘後，離心 14000 rpm，30 秒，去除廢液。最後，再加入 200 µl M-Wash buffer，離心 14000 rpm， 30 秒，去除廢液，再重複一次此步驟。將 column 換至新的微量離心管中，加入 10 µl M-Elution buffer 作用五分鐘後，離心 14000 rpm 30 秒，再重複一次此步驟，最終 Elution 的總體積為 20 µl。利用甲基化專一性引子設計軟體 (http://www.urogene.org/ methPrimer/index1.html)，對上述Sodium bisulfate處理過後的DNA設計專一性的引子對(表一，引子對F6、R6)，反應條件為 63℃煉和溫度、 2.5 mM MgCl2。PCR產物經膠體檢查後，委託源資生物科技股份有限公司進行定序反應。. 七、染色質免疫沈澱-PCR (ChIP- PCR). 利用 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay kit (Upstate)製備樣品。首先取定量(107)細胞，以冰的 PBS 清洗兩次之後，利用 1% 16.

(27) formaldehyde 於 37℃培養箱中作用十分鐘，cross link 組蛋白和 DNA。再以含 protease inhibitor 的 PBS 清洗細胞兩次後，收集細胞 pellets，加入適當體積的 SDS lysis buffer，置於冰上作用 10 分鐘。之後利用均質震盪器(MiceosonTM Ultrasonic cell disruptor)，將 DNA 震斷至 200 ~ 2000 bp。震破之後的細胞，以 4℃、12000 rpm 離心 10 分鐘，吸取上清液置於新的離心管。上清液經蛋白質及 OD260 定量後分成 A、B、C 三管，A 管作為正控制組，直接抽取 DNA，B 管作為負控制組，不加抗體，C 管作為實驗組，加入抗體，B、C 二管皆進行下列免疫沉澱。首先，利用 protein A agarose blocking 一小時，去除非專一性蛋白質。以 4℃、2000 rpm 離心 5 分鐘後，取上清液置於新的離心管，C 管實驗組加入 5 μg anti dimethyl Histone H3 lysine 9 抗體(代表緊密的染色質結構) 或 anti acetyl Histone H3 lysine 14 (代表鬆散的染色質結構)，不加抗體的 B 管為負控制組，置於 4℃冰箱混勻旋轉 16~24 小時。隔天加入 60 μl protein A-agarose/salmon sperm DNA，置於 4℃冰箱混勻旋轉 1 小時，讓 protein A agarose 與抗體結合。以 4℃、2000 rpm、離心 3 分鐘後去除上清液，經 low salt、high salt、LiCl 等鹽離子緩衝溶液清洗沉澱物數次後，加入 0.1M NaHCO3、1% SDS 溶液，於室溫環境下震盪半小時，將 protein A agarose 與抗體分開，溶離出含 DNA 與蛋白質的免疫. 17.

(28) 複合物。加入 8 µl 5 M NaCl，於 65℃水浴 4 小時，分開 cross-link 的 DNA 與蛋白質。每管再加入 2 μl proteinase K 使蛋白分解，最後使用 phenol/chloroform 溶液萃取 DNA，再以等體積之 isopropanol 沉澱 DNA，以 80% 酒精清洗沉澱、風乾後，溶於 100 µl 二次水，存於-20℃。以上述製備的 A、B、C 三管 DNA 溶液為模板，進行 PCR。分析 SCA8 淋巴細胞株的引子對為 F2、R2 (ATXN8OS 基因)及 F5、R5 (ATXN8 基因)，反應條件分別為 60℃、53℃煉和溫度及 1.5 mM MgCl2；分析 SCA8 胚胎腎臟細胞株的引子對為 F2、R3 及 F4、R4 (ATXN8OS cDNA 基因)，反應條件 53℃煉和溫度及 1.5 mM MgCl2 (表一)。反應結束後，以 1.4%洋菜膠體電泳檢查 PCR 產物。. 八、淋巴細胞的存活率分析. 取淋巴細胞(105 in 100 µl)種在 96 孔盤中，在含有 10%胎牛血清之培養液、37°C 及 5% CO2 環境下培養 12 小時後，給予不同藥物(0 nM、10 nM、50 nM staurosporine 與 0 nM、50 nM、200 nM MG-132) 之處理 24 小時。之後將每個 well 的細胞混勻，取 20 µl 和 20 µl 0.4% Trypan blue (Gibco)混合後，在光學顯微鏡下分別計算活細胞(亮)及死細胞(藍色)數量，每種藥物處理實驗進行三重複，每次實驗進行二重複。 18.

(29) 九、caspase-3 活性分析. 將淋巴細胞(107 in 10 ml)培養於培養瓶中，12 小時後以 50 nM 濃度之 staurosporine 處理 24 小時。之後離心收集細胞，以 PBS 清洗兩次，收集細胞 pellets。利用 EnzChek Caspase-3 Assay Kit (Molecular Probes)偵測 Caspase-3 活性，活化的 caspase-3 切割受質 Z-DEVD-R110 (N-CBZ-Asp-Glu-Val-Asp)後發出螢光，因此可利用偵測 R110 的螢光量來推測細胞中活化的 caspase-3 之相對量。首先於細胞 pellets 中家加入適當體積 cell lysis buffer，於冰上作用 10 分鐘後，利用液態氮連續冷凍解凍六次打破細胞以萃取蛋白質。4℃離心 5000 rpm、5 min 後，取細胞上清液。定量後取在 100 µg 置於 96 孔盤中，加入 2X Z-DEVD-R110 受質反應 1 小時後，利用 excitation 496 nm 及 emission 520 nm 進行測試(FLX800, Microplate Fluorescence Reader)。. 19.

(30) 參、結果. 一、SCA8 CTA/CTG 重複之遺傳分析. 目前共分析 69 位正常人(138 條染色體)以及 74 位帕金森氏症患者(148 條染色體)、55 位原發性顫抖症患者(110 條染色體)以及 90 位其他神經疾病患者(180 條染色體)。如圖二所示，在上述樣品群中， SCA8 基因 CTA/CTG 重複的數目大約分佈在 18～32 個之間，最常見的為 18 次重複，在正常人、帕金森氏症患者、原發性顫抖症及其他樣品群中各佔 24.6%、22.3%、25.5%、22.8%。各樣品群的 CTA/CTG 重複分佈情形列於表二。另外在此研究中發現三個擴增的對偶基因，包括一位正常人(90 次重複)及兩位肌肉營養不良症(OPMD)患者(104、106 次重複)， CTA/CTG 三核苷重複擴增的定序結果列於表三。. 二、SCA8 外遺傳研究(epigenetic studies). (一) H327、H600 家族的 DNA 甲基化分析. 經CpG Island Searcher線上軟體(http://cpgislands.usc.edu/cpg.aspx). 20.

(31) 檢測ATXN8OS與ATXN8基因，發現ATXN8基因之鄰近區域無豐富的 CpG島，而ATXN8OS與KLHL1之重疊區域有豐富的CpG島(圖一B)，因此利用ATXN8OS基因引子F2、R2 (圖三A)，檢測SCA8 CTA/CTG三核苷重複擴增的帕金森氏症病人H327和H600家族(表四)，ATXN8OS 基因5’端甲基化程度。圖四A顯示未經酵素切割(-)、HpaII切割(H)、 MspI切割(M)的基因組DNA，未經過酵素切割者有一明顯的DNA色帶 (lane -)；由於辨識序列無論甲基化與否，均能被MspI切割，經MspI 切割後DNA呈smearing現象(lane M)，而HpaII僅能切割未甲基化的辨識序列，故切割後的DNA片段明顯大於MspI切割者(lane H)。圖四B顯示以上述三種實驗條件處理後之基因組DNA作為模版，利用辨認ATXN8OS基因5’端區域之專一性引子進行PCR反應的結果。未經過酵素切割的正控制組模板，於464 bp的位置有一明顯的產物(lane -)，MspI切割後的負控制組模板則無(lane M)，而以HpaII切割後的實驗組模板，則依此區域CCGG序列上的甲基化程度，而增幅出不同強度的PCR產物(lane H)。SPINK5基因exon 29區域，因缺乏 CCGG 序列，故三種實驗條件處理後之基因組DNA模板，均能增幅出343 bp的產物，作為內生性控制組。圖四C為上述H327和H600家族甲基化程度量化結果，顯示各樣品的CTG重複次數和甲基化程度沒有一定的關連性。. 21.

(32) (二) SCA8 胚胎腎臟細胞株的 DNA 甲基化分析. 利用 ATXN8OS cDNA 基因引子 F2、R3 (圖三 B)，檢測 SCA8 胚胎腎臟細胞株(CR)0、(CR)23、(CR)88、(CR)157 的 ATXN8OS 基因甲基化情形。圖五 A 為未經酵素切割(-)、HpaII 切割(H)、MspI 切割(M) 的基因組 DNA，圖五 B 為以上述處理後 DNA 為模板之 PCR 產物，包括 494 bp 的 ATXN8OS cDNA 基因及，464 bp 的 ATXN8OS 內生性基因，圖五 C 為 cDNA 基因(白色柱子)和內生性基因(黑色柱子)的甲基化程度量化圖，顯示 CTG 重複次數和甲基化程度沒有一定的關連性。由於酵素切割若不完全，會導致甲基化程度的誤判，故進一步利用 EZ DNA Methylation-GoldTM Kit 處理 SCA8 (CR)23~157 胚胎腎臟細胞株 DNA，使 DNA 序列上沒有甲基化的 C 鹼基轉變為 U 鹼基，CpG 上的 C 鹼基若發生甲基化，則維持 C 鹼基。Sodium bisulfate 處理後的模板經特定引子 F6、R6 (表一)增幅後，再藉定序比較 T 鹼基與 C 鹼基的訊號強弱，來推知樣本的甲基化程度。結果所分析的 CpG 位置了全都被修飾成 T，表示均未被甲基化，包括 PCR-based 限制酶檢測所辨認的二個 CCGG 在內(圖六)。. 22.

(33) (三) SCA8 胚胎腎臟細胞株的染色質結構分析. 利用辨識組蛋白 H3 上特定修飾的抗體及 cDNA 引子(圖七)，來檢查 SCA8 CTA/CTG 重複擴增與染色質結構的關係，結果顯示於圖八。如圖八 A 所示，與未受超音波震盪處理相較(lane -)，經過超音波震盪後，DNA 被震碎成小片段呈 smearing 現象(lane +)。超音波處理後將樣品分成未進行免疫沈澱、不加抗體但進行免疫沈澱、加抗體進行免疫沈澱三組，免疫沉澱反應的抗體包括辨認 dimethyl Histone H3 lysine 9 及辨認 acetyl Histone H3 lysine 14 的抗體。dimethyl Histone H3 lysine 9 的組蛋白修飾代表染色質結構緊密、低基因轉錄活性，而 acetyl Histone H3 lysine 14 的組蛋白修飾則代表染色質結構鬆散，利於基因轉錄作用。如圖八 B、C 所示，dimethyl Histone H3 lysine 9 抗體免疫沉澱的 DNA 模板，PCR 增幅後於(CR)157 細胞株檢測到代表染色質結構緊密的 ATXN8OS cDNA 片段；acetyl Histone H3 lysine 14 抗體免疫沉澱的 DNA 模板，PCR 增幅後則於(CR)23、(CR)88 細胞株檢測到代表染色質結構鬆散的 ATXN8OS cDNA 片段。即結果顯示，SCA8 CTA/CTG 重複 157 次時可能會導致染色質結構較緊密，而重複 23 次或 88 次時染色質結構是較為鬆散的。. (四) SCA8 淋巴細胞株的染色質結構分析 23.

(34) 利用年齡、性別配對的淋巴細胞株(表五)，來探討 ATXN8OS 基因之染色質結構。各淋巴細胞株的 SCA8 基因 CTA/CTG 重複的數目顯示於圖九。如圖十所示，dimethyl Histone H3 lysine 9 抗體免疫沉澱的 DNA 模板，PCR 增幅後於 P3 (95~185 次重複)、P4 (120 次重複) 檢測到代表染色質結構緊密的 ATXN8OS 464-bp gDNA 片段，顯示 P3 與 P4 之 ATXN8OS 基因 exon D 到 intron D 的染色質結構較為緊密，但 exon A ~ 3’ flanking 的染色質結構並不見類似的緊密狀況。acetyl Histone H3 lysine 14 抗體免疫沉澱的 DNA 模板，PCR 增幅後則於各細胞株皆檢測到代表染色質結構鬆散的 ATXN8OS 464-bp 及 401-bp gDNA 片段。. 三、 SCA8 淋巴細胞株的細胞存活率分析. 上述年齡、性別配對的三組淋巴細胞株，經 proteasome 抑制劑 MG-132 或細胞自戕刺激物 staurosporine 處理後，藉由 trypan blue 排除檢測，結果如圖十一所示。正常人淋巴細胞株經 0、50、200 nM MG-132 處理後，死亡率分別是 7.7~8.8、8.5~10.1、13.0~13.9%，病人淋巴細胞株則分別是 8.2~9.1、9.0~12.2、18.8~25.1%，在 200 nM 濃度處理下，病人淋巴細胞株的死亡率顯著高沒有處理的細胞(P = 24.

(35) 0.029~0.039)，正常人淋巴細胞株處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.050~0.092) (圖十一 A)。正常人淋巴細胞株經 0、10、50 nM staurosporine 處理後，死亡率分別是 7.7~9.0、8.1~10.4、11.7~15.4%，病人淋巴細胞株則分別是 8.4~9.1、9.5~15.1、20.2~23.6%，在 50 nM 濃度處理下，病人淋巴細胞株的死亡率顯著高沒有處理的細胞(P = 0.004~0.034)，正常人淋巴細胞株處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.074~0.191) (圖十一 B)。. 四、 SCA8 淋巴細胞株的 caspase-3 活性分析. 藉由 EnzChek Caspase-3 Assay Kit，進一步分析上述 50 nM staurosporine 處理後的淋巴細胞株的 Caspase-3 活性，結果顯示於圖十二。正常人淋巴細胞株經 0、50 nM staurosporine 處理後，Caspase-3 活性分別是 0.60~0.73、0.64~0.98 μM，病人淋巴細胞株則分別是 0.59~1.02、1.22~1.87 μM，在 50 nM 濃度處理下，病人淋巴細胞株的 Caspase-3 活性顯著高沒有處理的細胞(P = 0.007~0.015)，正常人淋巴細胞株處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.128~0.687)。. 25.

(36) 肆、討論. 一、 SCA8 CTA/CTG 重複之遺傳分析. 本研究分析臺灣地區四個不同樣品群之 SCA8 CTA/CTG 重複次數，包含 69 位正常人、74 位帕金森氏症患者、55 位原發性顫抖症患者、90 位其他神經疾病患者，結果顯示各樣品群皆以 18 次為出現最多的對偶基因頻率(22.3~25.5%)，而第二常見之重複次數則多為 24 次 (11.5~16.1%) (圖二、表二)。此結果與本實驗室先前的研究結果大致符合(洪, 2005; 黃, 2006; 林, 2007)。本研究中於正常人樣品群及其他神經疾病樣品群中共發現三個 CTG 重複擴增的對偶基因，分別是 90 次重複[(CTA)10(CTG)80，正常人]、104 次重複[(CTA)9(CTG)95 ，肌肉營養不良症]、106 次重複 [(CTA)9(CTG)97，肌肉營養不良症] (表三)。SCA8 雖然在極少數正常人及精神疾病、富來德瑞克氏共濟失調症、帕金森氏症、阿茲海默氏症中被報導過(Worth et al., 2000; Sobrido et al., 2001)，但未見於肌肉營養不良症。而肌肉營養不良症主要是由於 PABPN1 (polyadenylate binding-protein nuclear 1)基因有不正常的三核苷酸重複擴增轉譯出多丙氨酸(polyalanine)所導致，因此這兩位有血源關係的肌肉營養不良症患者，其 SCA8 CTG 重複擴增與造成疾病之間的關係有待進一步 26.

(37) 的探討。. 二、 SCA8 外遺傳研究. (一) DNA 甲基化分析. 利用 CpG Island Searcher 軟體檢測與 SCA8 相關的 ATXN8OS 及 ATXN8 基因，結果發現 ATXN8OS 與 KLHL1 之重疊區域有 CpG 島(圖一 B)，因此藉 CTA/CTG 重複擴增的帕金森氏症病人及其家族(表四) 與 SCA8 胚胎腎臟細胞株(林, 2007)，來進一步探討此區域甲基化程度與 CTG 重複擴增的關聯。首先，利用 PCR-based 限制酶檢測技術，檢查 DNA 甲基化程度，結果發現各樣品之 DNA 皆有甲基化現象，但是其甲基化程度與帕金森氏症性狀和重複擴增次數無顯著關係(圖四、圖五)。進一步利用 Sodium bisulfate 定序分析技術探討 SCA8 胚胎腎臟細胞株其 DNA 甲基化程度。結果發現 CTG 長度不論(CR)23、 (CR)88、(CR)157，所檢視區域 CpG 位置上的 C 皆全部修飾成 T，即 DNA 無甲基化現象(圖六)。此結果和上述 PCR-based 限制酶檢測結果不符。 PCR-based 限制酶檢測須藉 HpaII、MspI 酵素切割 DNA 樣品，若酵素作用不完全就會影響其 PCR 結果，所以不是一個很精準的技術。. 27.

(38) 相對的，bisulfate 定序分析可確切得知每一個 CpG 位置上的甲基化程度，所以利用此技術所分析出的結果其可信度較高。可能由於 HpaII、 MspI 限制酵素切割不完全，而導致甲基化程度的誤判。由 bisulfate 定序分析結果顯示 SCA8 的 CTG 重複擴增現象和甲基化程度沒有關連，所以甲基化在此疾病中扮演的角色還有待進一步的研究查證。. (二) 染色質結構分析. 染色質可藉不同組蛋白修飾改變其結構，調控基因的轉錄與表現。組蛋白 H3 的第九、第十四個胺基酸-離胺酸之乙醯化與染色質結構鬆散、基因轉錄活化有關，而組蛋白 H3 的第九胺基酸-離胺酸發的甲基化修飾，則與染色質結構緊密、基因轉錄抑制相關(Yan and Boyd, 2006)。本研究利用 SCA8 胚胎腎臟細胞株及 anti-dimethyl-H3-K9 (緊密染色質結構)、anti-acetylated-H3-K14 (鬆散染色質結構)兩種抗體的染色質免疫沉澱及 PCR 技術，來探討 ATXN8OS cDNA 基因之染色質結構(圖八)。結果發現當 SCA8 的 CTG 三核苷酸重複擴增次數為 157 時，會導致 ATXN8OS cDNA 基因染色質結構變得較緊密(圖八 B， cDNA 5’端的 494-bp 片段及 3’ 端的 213-bp 片段)，但是 88 次的 CTG 三核苷酸重複擴增並未改變 ATXN8OS cDNA 基因染色質結構。染色質結構緊密的 anti-dimethyl-H3-K9 抗體(圖八 B)與染色質結構鬆散的 28.

(39) anti-acetylated-H3-K14 抗體(圖八 C)的實驗結果是符合的。進一步利用年齡、性別配對的淋巴細胞株(表五)重複上述實驗(圖十)。結果顯示兩位病人(P3，95~185 次重複；P4，120 次重複)之 ATXN8OS 基因之染色質結構較為緊密(圖十 B，gDNA 5’端的 464-bp 片段)，三位正常人(C1、C2、C3)及另兩位病人(P1，88 次重複；P2， 92 次重複)則較為鬆散。但 anti-acetylated-H3-K14 抗體的實驗結果顯示所檢測的各樣品都是染色質結構鬆散(圖十 C)，與代表染色質結構緊密的 anti-dimethyl-H3-K9 抗體的結果(圖十 B)不完全符合。即在 P3、P4 病人中可同時檢測到緊密和鬆散的 ATXN8OS 基因染色質結構。可能因為兩位病人皆為異型合子擴增突變的病人(表五)，因此會看到兩種染色質結構狀況。另外，P3 病人因 CTG 重複不穩定，出現 95~185 次多種重複序列(黃, 2006)，也可能導致染色質免疫沉澱實驗中看到兩種不同的染色質結構。綜合 SCA8 胚胎腎臟細胞株及淋巴細胞株的實驗結果，推論 SCA8 CTA/CTG 的重複次數在 120 次以上時，可能導致緊密的染色質結構。先前 Greene 等人於 GAA 三核苷酸擴增的富來德瑞克氏共濟失調症的研究中，以染色質免疫沉澱的技術分析 frataxin (FXN)基因的染色質結構與其表現的關聯，結果發現 FRDA 的患者於 FXN 基因的啟動子區域有較高的 dimethyl H3-K9，同時患者的 FXN mRNA 表現量. 29.

(40) 下降(Greene et al., 2007; Al-Mahdawi et al., 2008)。即 GAA 三核苷重複擴增會導致染色質結構緊密，進而影響蛋白因子與 FXN 啟動子結合，降低基因轉錄的活化。此結果與本研究結果(SCA8 CTG 重複擴增可能導致染色質結構緊密，圖八、圖十)相符合。先前研究顯示 HP1 (Heterochromatin protein 1) 會與 DNA 甲基轉移酶 (DNA methyltransferase) 結合，在基因的轉錄抑制中扮演重要的角色 (Bannister et al., 2001)。HP1 是否在此染色質結構改變上扮演角色，及此染色質結構改變所影響的轉錄活化因子，有待進一步的探討。另外，SCA8 複合重複序列擴增不一定和疾病性狀共分離(Koob et al., 1999; Mosemille et al., 2003; Schols et al., 2003; Ikeda et al., 2004)，此低穿透度(reduced penetrance)和染色質結構間的關連，亦是值得探討的問題。. (三) DNA 甲基化與組蛋白修飾之關係. 在哺乳類動物中，cytosines 的甲基化會透過吸引甲基化 CpG 的結合蛋白(methyl-CpG binding domain proteins)如 MeCP2，使基因沈默 (Bird, 2002)。MeCP2 蛋白包含與甲基化 CpG 的結合區域(methyl-CpG binding domain)和轉錄抑制區域(transcriptional repression domain)。 MeCP2 吸引組蛋白去乙醯酶 HDAC1 和 HDAC2 複合體，進而導致組 30.

(41) 蛋白去乙醯化，使基因沈默(Jones et al., 1998; Nan et al., 1998)。故 MeCP2 在 DNA 甲基化和組蛋白甲基化間，扮演重要得中間橋樑的角色(Fuks et al., 2003)。此外，MeCP2 亦可在 DNA 無甲基化的情況下，直接和 K9-專一的組蛋白甲基化轉移酶 HMT 交互作用，造成組蛋白 H3-K9 甲基化以及組蛋白去乙醯化。如 fragile X mental retardation 1 (FMR1)基因啟動子區域缺乏甲基化，但仍發生組蛋白去乙醯化與組蛋白 H3K9 甲基化(Pietrobono et al., 2005)。本研究利用 SCA8 胚胎腎臟細胞株及 Sodium bisulfate 定序、免疫染色質沈澱-PCR 技術，分析 ATXN8OS cDNA 基因的 DNA 甲基化及染色質結構，結果亦於 ATXN8OS cDNA-(CR)157 細胞發現，染色質結構緊密和 DNA 甲基化無關聯(圖六、圖八)。此結果與上述 FMR1 基因啟動子的無甲基化及組蛋白 H3K9 甲基化的結果(Pietrobono et al., 2005)相符合，故佐證組蛋白的甲基化可在 DNA 無甲基化的情況下產生。哺乳類動物的 H3-K9 甲基轉移酶目前已有 SuvarH1、SuvarH2、G9a、ESET、Eu-HMTase1 等多種被定義出(Lachner et al., 2001; Tachibana et al., 2001; Yang et al., 2002; Ogawa et al., 2002; Kouzarides, 2002)，MeCP2 和組蛋白 H3-K9 甲基轉移酶之間的作用機制目前還不明確，值得進一步探討。. 三、 SCA8 淋巴細胞株的細胞存活率與 caspase-3 活性分析. 31.

(42) 先前CGG重複擴增所引起的Fragil X syndrome的細胞模式研究，顯示未轉譯的CGG重複擴增對於人類細胞是具有毒性的，並改變 caspase-8、CYFIP、Neurotensin、UBE3A等基因的表現(Handa et al., 2005)。故本研究利用MG-132和staurosporine兩種藥物來處理淋巴細胞株，藉此探討正常人與帶有SCA8 CTG重複擴增的病人淋巴細胞對藥物的敏感差異如何。MG-132可抑制蛋白質降解的ubiquitin-proteasome 的路徑(Myung et al., 2001)，而ubiquitin-proteasome pathway在細胞的訊息傳遞、週期調節、轉錄或是DNA修復等的功能上扮演重要的角色 (Ciechanover, 1994; Glickman and Ciechanover, 2002)。Staurosporine為一種protein kinase C的抑制劑，可使細胞透過caspase走向細胞凋亡的路徑。實驗結果發現三位患者細胞株在經過proteasome抑制劑MG-132 或細胞自戕刺激物staurosporine處理後，在MG-132 200 nM及STS 50 nM的濃度下，與未處理相較，細胞死亡率顯著上升，而年齡、性別配對的正常人細胞株則無此現象(圖十)。顯示帶有SCA8 CTG重複擴增的病人淋巴細胞對此兩種藥物的敏感度較高。因此，更進一步利用 staurosporine 50 nM濃度處理淋巴細胞，來探討caspase-3活性之差異。 Caspase 3為一種aspartate-specific cysteine proteases，在功能方面為 xecutioner caspase，須透過次單位的剪裁活化，使細胞走向凋亡路徑 (Fuentes-Prior and Salvesen, 2004)。首先利用西方轉漬法來探討藥物處. 32.

(43) 理過後的正常人與病人淋巴細胞，其活化的caspase-3蛋白的差異。可能由於caspase-3蛋白的低表現量及/或表現差異不夠大，導致西方轉漬法無法判別差異(data not shown)。進一步利用高敏感度的EnzChek Caspase-3 Assay Kit來偵測caspase-3活性，結果發現病人淋巴細胞株在 staurosporine 50 nM濃度處理下，其caspase-3活性有顯著增高，而正常人則無明顯差別(圖十一)。結果顯示病人淋巴細胞株在此藥物濃度處理下，可能會透過caspase-3走向細胞凋亡的路徑。故本研究顯示SCA8 CTG重複擴增對於人類細胞是具有毒性的，其所影響的基因，值得深入探討問題。. 33.

(44) 伍、參考文獻. 洪葦苓 (2005)。第八型脊髓小腦運動失調症：CTG 三核苷重複的遺傳分析與細胞模式研究。國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文。黃淑宜 (2006)。人類遺傳疾病：第一部份-第八型脊髓小腦共濟失調症之分子遺傳及外遺傳研究；第二部份-台灣兩個 Netherton 徵候群病患家族之分子遺傳研究。國立台灣師範大學生命科學系碩士論文。林玄原 (2007)。脊髓小腦運動失調症之族群遺傳分析與 CTG 三核苷重複擴增的分子致病研究。國立台灣師範大學生命科學系博士論文。 Al-Mahdawi, S., Pinto, R. M., Ismail, O., Varshney, D., Lymperi, S., Sandi, C., Trabzuni, D., and Pook, M. (2008). The Friedreich ataxia GAA repeat expansion mutation induces comparable epigenetic changes in human and transgenic mouse brain and heart tissues. Hum Mol Genet 17, 735-746. Aromolaran, K. A., Benzow, K. A., Koob, M. D., and Piedras-Renteria, E. S. (2007). The Kelch-like protein 1 modulates P/Q-type calcium current density. Neuroscience 145, 841-850. Bannister, A. J., Zegerman, P., Partridge, J. F., Miska, E. A., Thomas, J. O., Allshire, R. C., and Kouzarides, T. (2001). Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. 34.

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(56) 陸、附錄圖表. 圖一、ATXN8OS、ATXN8與KLHL1的基因構造圖與CpG島預測分析。(A) ATXN8OS、ATXN8與KLHL1基因構造圖。ATXN8OS與KLHL1 兩個基因的啟動子、表現子1及部分intron 1重疊，導致mRNA 5'端分別表現自同一段DNA的兩股，且ATXN8OS mRNA有選擇性裁接的現象，CTG重複位於可以被選擇性裁接的表現子A上。此外，ATXN8與 KLHL1的轉錄為同一方向，CAG重複位於表現子A上，可轉錄出polyQ 蛋白 (圖形修改自Mutsuddi and Rebay, 2005)。(B) ATXN8OS與ATXN8 啟動子及5'端區域的CpG島預測分析。彎曲箭頭+1標示處為ATXN8OS 轉錄起始位置，標示ATG處為ATXN8 polyQ蛋白轉譯的起始點。藍色長方形標示處為CpG島。 46.

(57) 圖二、SCA8 CTG 三核苷酸重複等位基因頻率(A)及多型性基因型(B) 分佈圖。所檢測的台灣人族群包括正常人(Controls)、帕金森氏症患者 (Parkinson’s disease)、原發性顫抖症(Essential tremor)及其他神經相關疾病患者與其家屬(Others)。. 47.

(58) 圖三、PCR-based限制酶檢測之引子設計。ATXN8OS之genomic DNA (exon D ~ intron D) (A)和cDNA (exon D ~ C1) (B)序列，可能的CpG雙核苷(cg)以粉紅色標示出，進行PCR-based限制酶檢測的ATXN8OS基因引子(F2、R2)和ATXN8OS cDNA基因引子(F2、R3)以底線標示出，切割酵素HpaII、MspI之切割位(ccgg) 以紅色長方形標示。. 48.

(59) 圖四、H327 和 H600 家族之 ATXN8OS 基因甲基化分析。(A)基因組 DNA 未添加酵素(-)、添加甲基化敏感酵素 HpaII (H)、添加甲基化不敏感酵素 MspI (M)處理的 0.8%瓊脂膠體電泳分析照片。(B)以上述處理後 DNA 為模板之 PCR 產物(ATXN8OS 基因 5'UTR 區域，464 bp) 的 1.4%瓊脂膠體電泳分析圖，PCR 增幅 SPINK5 基因 exon 29 343 bp 片段作為內在對照組。(C) H327 和 H600 家族的甲基化程度量化圖。. 49.

(60) cDNA 基因內生性基因. 圖五、SCA8 (CR)0~157胚胎腎臟細胞株的甲基化分析。(A)基因組DNA 未添加酵素(-)、添加甲基化敏感酵素HpaII (H)、添加甲基化不敏感酵素MspI (M)處理的0.8%瓊脂膠體電泳分析照片。(B)以上述處理後 DNA為模板之PCR產物(ATXN8OS cDNA基因5'端，494 bp；ATXN8OS 內生性基因5'UTR區域，464 bp)的1.4%瓊脂膠體電泳分析圖，PCR增幅SPINK5基因exon 29 343 bp片段作為內在對照組。(C) cDNA基因(白色長柱)和內生性基因(黑色長柱)的甲基化程度量化圖。. 50.

(61) 圖六、SCA8 (CR)23~157胚胎腎臟細胞株的Bisulfite定序分析。可能的 CpG位置以黑色底線標示出。PCR-based限制酶檢測所辨認的三個 HpaII、 MspI酵素切割位置(C↓CGG)以藍色長方形標示出。. 51.

(62) 圖七、免疫染色質沈澱-PCR之引子設計。ATXN8OS之cDNA (exon B ~ A) (A)和genomic DNA (exon A ~ 3’ flanking) (B)序列，進行免疫染色質沈澱-PCR的ATXN8OS cDNA基因引子(F4、R4)和ATXN8OS基因引子(F5、R5)以底線標示出。. 52.