7.4 120 84 205
36 52 30
M 0 480 90015 30 60 120 240 0 15 30 60 120 240 480 900
Figure 4：利用 Western blot 分析在不同時間熱處理後之β-LG 變化。(A) 15% Native-PAGE。(B) 15% SDS-PAGE。分析與β-LG 抗體之反應，Lane 左至右為不同熱處理時間分別為0、15、30、60、120、240、480 及 900 秒。β-LG 明顯在加熱時間越長蛋白濃度逐漸降低。並且發現高分子聚 合物 (panel B)。
0
Percentage of dry milk added into raw milk
OD at 405 nm
Figure 5：利用 ELISA 初步所篩選出只會辨認還原乳不會辨認生乳。篩選 出有高titer 的抗體株單株化分別為 1, 2, 3 及 5 （1B5F2, 2F2D9, 1C10F10 及1D8F8）
Figure 6：利用 ELISA 分析辨認還原乳單株抗體在生乳中加入不同比例的 還原乳的免疫結合能力。由結果得知加入還原乳比例越高所分析的讀值越 高，因此可利用此單株抗體解決生乳中還原乳的摻雜問題。
0
1B5F2 2F2D9 1C10F10 1D8F8 2B4B4 Clones
OD at 405 nm
Raw milk Raw milk heated
0
OD at 405nm
15secs
Figure 7：利用 ELISA 分析辨認牛乳的單株抗體與生乳加熱後的結合力。
生乳加熱後加（熱 95℃15 分鐘）與此單株抗體的結合力增加五倍以上，
此結果可推測加熱後會暴露出新的epitope。2B4B4 的單株抗體為同時辨認 生乳與還原乳。
Figure 8：利用 ELISA 生乳經不同時間不同溫度加熱後此辨認還原乳單株 抗體的免疫結合力。將生乳用50, 60, 70, 80 及 90℃加熱 15’’, 30’’, 1’, 2’, 4’, 8’ 及 16’。結果當生乳加熱 80℃以上 1 分鐘即可被此抗體辨認。因此可用 此抗體訂定國家標準。
Figure 9：利用 Western blot 分析還原乳的專一性單株抗體（1B5F2, 2F2D9 及1D8F8）及缺乏專一性的單株抗體的特性。每一個 lane 放入 10ug 的乳 蛋白。Lane A：為 native LG、lane B：為生乳、lane C：為市售鮮乳、lane D：為還原乳及 lane E：加熱 95℃15 分鐘後的生乳。
1B5F2 1D8F8
A B C D E A B C D E
A B C D E 2F2D9
A B C D E 2B4B4
LG LG
LG
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4
190 200 210 220 230 240 250 260
WAVELENGTH (nm)
ELLIPTICITY (1000deg cm2 / dmole)
Heat Non-heat
Figure11：利用 western blot 分析 LG 由 CNBr 所分解後 epitope 的分佈情形。每一個 well 加入的蛋白質濃度分別為 30ug, 10ug 及 10ug 。Lane M：marker。 lane B： LG + CNBr。lane C：LG + CNBr。lane D：BSA。此抗體與 LG 結合的部位應在 9 kDa 的位置。
M A B C
9 kDa
Figure 10：利用 CD（Circular Dichroism）分析純化後之 LG 經加熱後之蛋白質結構。
虛線為未加熱處理之純化後LG，實線為加熱處理後之 LG。明顯得到在加熱處理後
之LG 部分結構已由α-helix 變為 random coil。由此可說明加熱處理造成構型
（conformation）上的改變。
Figure13：利用 peptide 合成的技術合成 16 片段，所包含的部位大多位於 CNBr 及 trypsin 所拼出的部位（N 端位置）。利用抗體分析後灰色區域 （胺機酸 67-75）即為抗體所 辨識的區域。
Figure12：利用 western blot 分析 LG 由 trypsin 分解後 epitope 的分佈情形。每一個 well 加入的蛋白質濃度 30ug。LG 和 trypsin 量的比例是 10000：1。 Lane M：marker。
Lane A：native LG。Lane B：LG+ trypsin 反應 10min。Lane C：LG+ trypsin 反應 30min。
Lane D：LG+ trypsin 反應 1hr。此抗體與 LG 結合的部位應在 12 kDa 的位置。
M A B C D
12 kDa
Figure 15：利用本實驗室研發出的 2D-PAGE 分析。牛乳經加熱後 LG 與乳中哪幾 種蛋白質結合。A：並未加熱的生乳。B：加熱後的生乳。結果發現生乳經加熱 後LG 與 BSA、Casein 及 LA 結合成大分子。
LG
Figure 14：利用 IEF 2D-PAGE 分析牛乳經加熱後 LG 與乳中哪幾種蛋白質結合。
A：並未加熱的生乳。B：加熱後的生乳。結果並未發現有不相同的地方。
A B
LG BSA
Casein
LA