用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養2 × 105的誘導式SCA17 細胞株於24孔培養盤，隔天加入1 μg/ml doxycycline，靜待24小時後 加 入100 nM STS或做缺血清處理24小時。接著以100 μl 0.05%
trypsin-EDTA使細胞懸浮，再加入400 μl細胞培養液緩和其作用，隨 後將細胞收集進1.5 ml離心管。離心3,000 rpm、5分鐘後，以PBS沖洗 細胞團塊，再次離心3,000 rpm、5分鐘，接著加入50 μl PBS懸浮細胞。
取出10 μl細胞懸浮液，加入10 μl Trypan Blue室溫反應5分鐘，再以 CountessTM Automated Cell Counter(Invitrogen)算出細胞存活率。上述 Trypan Blue染色進行三次重複，且每個sample讀取兩次存活率結果，
再將機器所計算出的細胞存活率結果做統計分析。
二、短暫表現SCA17細胞模式 (一)細胞培養
以包含兩種篩選細胞之抗生素(3 mg/ml penicillin-10.5 mg/ml streptomycin)的10% FBS/DMEM培養293T細胞株於10 cm2 dish中，並 將細胞置於37℃、5% CO2且溼度穩定之細胞培養箱。待細胞生長至 7、8分滿，以1:5 ~ 1:10的稀釋比例進行細胞繼代培養。
(二) HSPs重組質體構築 1. DNA片段純化
利用Primer Express軟體設計可以夾出HSPs DNA片段，並於序列 尾部帶有FLAG-tag的primer (表一)，再與293細胞所萃取並反轉錄之 cDNA進行94℃ 1分鐘 1個循環，94℃ 30秒鐘、70℃ 30秒鐘、72℃ 1 分鐘共30個循環，72℃ 10分鐘 1個循環，72℃ 30分鐘 1個循環的LA
Tag PCR。其25 μl反應溶液包含50 ng/μl的RNA、2.5 μl 10X LA buffer、
0.4 μl 2.5 mM LA dNTP、2.5 μl 50 mM Mg2+、0.5 μl primer，以及0.2 μl LA Tag (Takara)。HSPA5和HSPA8 DNA片段的PCR條件相同，HSPB1 則為95℃ 5分鐘 1個循環，95℃ 30秒鐘、84℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘 共 30個循環，72℃ 10分鐘 1個循環，72℃ 30分鐘 1個循環。
將限制酵素作用過之質體DNA以及PCR產物進行洋菜膠電泳分 離，切下所需的DNA片段後，用Gel Extraction Kit (Viogene)做膠體純 化。先加入700 μl GEX buffer進行60℃ 10分鐘乾浴，使膠體溶解，再 將溶液取至純化管柱中，離心13,000 rpm、1分鐘。去除廢液後，加入 500 μl wash I buffer，離心13,000 rpm、1分鐘，再去除廢液，隨後加 入700 μl wash II buffer，離心13,000 rpm、1分鐘。去除廢液後，再次 離心13,000 rpm、1分鐘，接著將管柱移至新的1.5 ml離心管，並加入 20 μl ddH2O。室溫靜置30分鐘後，再離心13,000 rpm、1分鐘，透明 溶液即為純化完成的DNA片段，最後取純化後的DNA進行洋菜膠電 泳檢查。
2.轉型勝任細胞(Competent cells)製備
在1 ml含tetracycline的LB培養基中(10 g/l trypton - 5 g/l yeast extract - 10 g/l NaCl)接種大腸桿菌TOP-10 F'單一菌落，37℃、200 rpm 震盪培養3小時。之後倒入50 ml LB中，以37℃、200 rpm隔夜震盪培
養。然後平均分裝到四個250 ml錐形瓶中，繼續培養約至OD600達0.75
~ 1.00。之後將菌液置於冰上15分鐘，再以4℃離心4,000 rpm、5分鐘，
並去除上清液。加入250 ml預冷之ddH2O懸浮細胞，再次以4℃離心 4,500 rpm、5分鐘，並去除上清液，細胞懸浮和離心的動作共重複四 次，最後加入3 ml 10% glycerol懸浮細胞，再以每管45 μl的體積分裝 進1.5 ml離心管中，置於-80℃長期保存。
3.接合反應
於16℃進行接合反應隔夜，其反應總體積為5 μl，內含10X buffer (300 mM Tris - HCl pH 7.8 - 100 mM MgCl2 - 100 mM DTT - 10 mM ATP)、適量純化的DNA片段，以及0.25 μl T4 DNA ligase (3U)。
4.細菌轉型作用(Transformation)
於接合反應完成後，以70℃乾浴10分鐘，終止T4 DNA ligase的酵 素反應，再置於冰上。取2 μl重組質體DNA加入20 μl的勝任細胞混 勻，再以BIO-RAD GENE PULSERII進行1.25 kV、25 μF、200 Ω的電 穿孔(electroporation)轉型作用。加入500 μl LB後，於37℃水浴30分 鐘，再將150 μl菌液塗至每盤含50 μg/ml ampicillin、0.5M IPTG和 100mg/ml X-gal的LB培養基中，置於37℃培養箱中培養16~18小時。
5.質體DNA小量製備
以滅菌牙籤挑選單一的白色菌落，畫在含50 μg/ml ampicillin的
LB培養基上保留菌株，同時將牙籤置入1.5 ml離心管裡，含50 μg/ml ampicillin的1 ml LB培養液中攪拌。接著將培養基與培養液置於37
℃、200 rpm培養隔夜，之後離心13,000 rpm、1分鐘，去除上清液。
隨後加入70 μl solution I (50 mM glucose - 25 mM Tris-HCl pH 8.0 - 10 mM EDTA pH 8.0)震盪懸浮菌液，再加入140 μl solution II (0.2 N NaOH - 1% SDS)反轉數次，接著加入105 μl solution III (3M potassium acetate)，溫和反轉數次，再離心14,000 rpm、10分鐘。將含有核酸之 上清液取至心的1.5 ml離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，反轉數次 後，離心14,000 rpm、1分鐘，去除上清液。以100 μl 70%酒精清洗多 餘鹽類後，放置室溫自然乾燥，再以50 μl 10 μg/ml RNase/ddH2O回溶 DNA，接著置於37℃水浴10分鐘，最後以0.8%洋菜膠電泳檢查重組 質體DNA的大小正確性，並以限制酵素切割確認插入片段是否正確，
再將重組質體DNA送定序作進一步確認。
6.質體DNA大量製備
將定序正確之重組質體DNA菌落培養於含50 μg/ml ampicillin的1 ml LB培養液中，於37℃、200 rpm培養3小時後倒入65 ml含50 μg/ml ampicillin的培養液中培養隔夜。接著利用Viogene Ultrapure Plasmid Midiprep System (Midi-prep-V100)大量抽取質體與純化DNA。先將菌 液離心8,000 rpm、5分鐘並去除上清液，再加入4 ml VP1 buffer震盪懸
浮細菌，隨後加入4 ml VP2 buffer靜置5分鐘，再反轉數次。再加入4 ml VP3 buffer反轉數次，然後以4℃離心12,000 rpm、15分鐘。此時，先 加入10 ml VP4 buffer取Midiprep - V100管柱潤洗管柱內膜，再將離心 後的上清液倒入管柱，利用重力讓菌液過管。接著加入15 ml VP5 buffer清洗雜質，再加入5 ml VP6 buffer沖堤出重組質體DNA，然後加 入0.75倍體積的異丙醇反轉數次，離心14,000 rpm、10分鐘。去除上 清液後，加入1/20倍體積的5M NaCl，並離心14,000 rpm、1分鐘，再 次去除上清液，加入99.5% 酒精。離心14,000 rpm、1分鐘後，去除 上清液，再加70% 酒精，再離心14,000 rpm、1分鐘，加入200 μl ddH2O 回溶DNA。隨後置於37℃水浴槽10 分鐘，再以限制酵素切割確認重 組質體DNA之正確性，最後以OD260測定DNA濃度，再置於-20℃保存。
(三) HSPs轉染(Transfection)
以含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養2 × 105的293T細胞於 於已經過poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理的coverslips (置於12孔 盤中)。隔天取100 μl OptiMEM與4 μl脂質試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen)混勻，作用5分鐘，並利用等待的時間配製DNA混合液。
取 100 μl OptiMEM 加 入 總 量 為 4 μg 的 DNA (pEF-TBP-Q36/61/79-IRES/hrGFP重組質體DNA：pcDNA3-HSPs-FLAG 重 組 質 體 DNA = 1 ： 1) ， 另 以 pcDNA3 載 體 與
pEF-TBP-Q36/61/79-IRES/hrGFP重組質體DNA共轉染，作為實驗的控制 組。pEF-TBP-Q36/61/79-IRES/hrGFP重組質體DNA為將TBP-Q36/61/79基因 片段以限制酵素EcoRI切位接進pEF-IRES/hrGFP載體上構築完成(李 麗卿, 2009)。接著換置1.5 ml不含抗生素的10% FBS/DMEM於12孔培 養盤中，並將Lipofectamine 2000混合液及DNA混合液加在一起混 勻，作用20分鐘後，每孔各加入200 μl的混合液。37℃培養6小時之後，
再換置含篩選抗生素的10% FBS/DMEM培養48小時。
(四)細胞螢光觀察
以PBS潤洗12孔盤中的細胞兩次，再以4% paraformaldehyde/PBS 作用10分鐘固定細胞，吸掉溶液後，加入0.1% Triton X-100/PBS作用 20分鐘。再次以PBS潤洗兩次後，以blocking buffer (0.5% BSA - 20 mM Glycine - PBS)在4℃浸泡細胞過夜。隔天加入稀釋500倍的Mouse anti-1C2 (Chemicon)一級抗體，4℃作用過夜。接著以blocking buffer 清洗coverslips，每次15分鐘，隨後加入稀釋500倍的二級抗體：Cy5 (Zymed)，4℃避光作用2小時。再次以blocking buffer清洗coverslips，
每 次 15 分 鐘 後 ， 加 入 稀 釋 1000 倍 的 DAPI (4’-6-diamidino-2-phenylindole，細胞核染劑)，避光作用20~30分鐘，
之後以PBS清洗三次，進行封片。最後利用Leica TCS SP2螢光顯微鏡 觀察細胞形態、聚集表現位置與團塊大小等。
肆、結果
ㄧ、誘導式SCA17細胞模式之建立
利 用 pcDNA5/FRT/TO 表 現 載 體 及 包 含 全 長 TBP cDNA (TBP-Q36/61/79)的重組質體(李麗卿, 2009)，來建立誘導式SCA17細胞模 式。上述質體與pOG44載體共轉入Flp-InTM T-REXTM 293細胞株後，
進行二週的抗生素處理，篩選誘導式SCA17細胞模式。
接 著 利 用 同 步 定 量 PCR 偵 測 外 源 性 TBP-Q36/61/79-HA 經 doxycycline 誘 導 後 的 mRNA 表 現 情 形 ， 來 檢 視 所 送 入 的 TBP-Q36/61/79-HA基因的表現情形。如圖二所示：(A)為偵測內生性TBP 及外源性TBP-Q36/61/79-HA mRNA的表現，並將結果相對於HuHPRT mRNA表現量作圖，由圖可知，誘導表現0、2、4 天後，vector細胞 的TBP/HuHPRT的相對表現量為0.29、0.31、0.41，TBP-Q36-HA細胞 的TBP/HuHPRT 的相對表現量為0.73、10.99、11.58，TBP-Q61-HA細 胞的TBP/HuHPRT 的相對表現量為0.71、9.75、11.98，TBP-Q79-HA 細胞的TBP/HuHPRT 的相對表現量為0.90、11.18、11.28。(B)為以無 誘導當作1.0倍，計算TBP-Q36/61/79-HA基因的mRNA誘導表現倍數，從 圖中可知TBP-Q36-HA基因在誘導表現2天後，mRNA增加約15倍；在 誘導表現4天後，mRNA增加約16倍；而TBP-Q61-HA基因在誘導表現
2天後，mRNA增加約14倍，4天後增加約17倍，TBP-Q79-HA基因則 在誘導表現2天後，mRNA都增加約12倍，4天後增加約13倍。結果顯 示：利用Flp-In T-Rex誘導系統所建立的SCA17細胞模式，在誘導表現 2~4天後，可表現TBP-Q36/61/79的mRNA，且倍數約為15倍。
為了得知誘導式SCA17細胞模式之TBP-Qn-HA蛋白質誘導表現 情形，將TBP-Q36/61/79-HA細胞於誘導2天後，利用西方轉漬法，以TBP 抗體偵測TBP-Qn-HA及內生性TBP蛋白表現，並以β-actin為蛋白質量 的控制組，其結果如圖三所示。由圖可知：TBP抗體辨識到分子量約 在43 kDa的蛋白，為細胞內生性的TBP蛋白，符合實際蛋白分子量大 小。而經誘導表現2天的細胞株，TBP-Q36/61/79蛋白才會表現。因外源 性基因後面相連HA-tag，所以能辨別TBP-Q36外源與內生性蛋白大小 的差異。Vector為轉入空載體的對照組，因此僅有內生性的TBP蛋白 被抗體所辨識。以上結果顯示：本篇研究所建立的誘導式SCA17細胞 模式可穩定誘導表現TBP-Q36/61/79蛋白。
長 Q 會導致不正確的蛋白質摺疊，並堆積於細胞內，因此進行 TBP-Qn-HA 蛋白聚集的觀察。Vector、TBP-Q36、TBP-Q61和TBP-Q79
細胞於誘導4 天後，以 1C2 抗體結合並接上含綠色螢光的 Alexa Fluor 488 (Invitrogen)二級抗體，隨後用 DAPI 進行細胞核染色，以便使用 螢光顯微鏡觀察細胞內 TBP-Q36/61/79的蛋白聚集情形。由圖四可見：
誘導4 天後，vector 與 TBP-Q36蛋白於細胞內表現呈均勻分散，無蛋 白聚集產生。而TBP-Q61與 TBP-Q79細胞內則可發現有少數細胞出現 些微蛋白聚集的情形，但大部分細胞仍呈現均勻分散狀況。
為了瞭解誘導式 SCA17 細胞模式的細胞週期表現情形，利用流 式細胞儀分析TBP-Qn 的細胞週期。Vector、TBP-Q36和 TBP-Q61細胞 於誘導1 天、去血清處理 1 天後進行 PI 螢光染色，並分析細胞週期。
如圖五所示：(A)為細胞週期波峰圖，在含 10%血清的情況下，Vector、
TBP-Q36和 TBP-Q61的sub G1%分別為 0.54、0.30、7.97，而缺血清處 理24 小時後，則分別為 4.41、5.09、10.07；(B)為細胞週期的量化圖，
由圖中可發現：在做缺血清處理後TBP-Qn 的 sub G1%都有提升的情 形，而無論是否做缺血清處理，TBP-Q61均呈現較高的 sub G1% (* P <
0.05)。
二、SCA17 細胞模式之氧化壓力指標表現
細胞在氧化壓力下，活性氧分子的表現量會提升。藉由 DHE 和 DCF 螢光偵測來觀察 ROS 的表現，可得知細胞是否真的面臨氧化壓 力。
DHE 在正常情況下發藍光(Ex/Em = 355 nm/420 nm)，可與細胞質 結合，而當細胞處於氧化壓力時，會產生許多活性氧分子，ROS 便 會氧化 DHE 使之脫氫成 ethidium 與細胞核中的 DNA 結合，發紅螢
光(Ex/Em = 518 nm/605 nm)，利用這種因氧化而造成吸光值改變的特
光(Ex/Em = 518 nm/605 nm)，利用這種因氧化而造成吸光值改變的特