熱休克蛋白過度表現及氧化壓力對SCA17細胞模式影響之研究

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(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士論文. 熱休克蛋白過度表現及氧化壓力對 SCA17 細胞模式影響之研究 The Effects of HSPs Overexpression and Oxidative Stress in SCA17 Cell Model. 研究生：王品蓉 Pin-Rong Wang 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen 中華民國九十八年七月.

(2) 誌謝在師大生活兩年，我每天都過著多采多姿的生活，感謝師大所供應的資源，讓我隨時隨地都能在享受與磨練中不斷成長，並充實自我。本研究的完成，首先要感謝恩師李桂楨老師，您豐富的專業知識與靈敏細心的思緒，總在我許多研究過程中成為不可或缺的提攜與助力，使我更容易得到盡善盡美的實驗結果。而您與學生亦師亦友的相處態度也讓我備受關心與鼓勵，讓我在面臨實驗挫折時，能立即恢復勇氣與信心；感謝謝秀梅老師與蘇銘燦老師，給予研究上精闢的建議，讓我在學習過程中能發現自己的盲點；也感謝陳瓊美醫師及吳逸如醫師在論文上的指導與協助，使我從問題中更瞭解自己的研究成果。在研究生涯中，我也得到許多貴人的幫助。感謝李姊、志信學長、秀觀學姊、怡辰學姊、士寰學長、佩瑛學姊、金玨學姊、玄竺學長、昇翰學長、雰茹學姊、芷英學姊、雅今學姊、奕村學長在實驗上耐心的協助與提醒；還有我的同學春嫺、軒浩，你們的存在讓我從不覺得自己在孤軍奮戰；再來是淑婷、慈蓬、詩涵、佩茹、婷中……等，感謝你們平時對我的照顧，陪我哭、陪我笑，給我加油打氣；也感謝鄰近實驗室的同學：柏安學長、俊彥學長、俞鈞、竣緯……等，感謝你們在實驗上的指導與藥品器材的協助；以及教導我許多氧化壓力相關. I.

(3) 知識的宛芬學姊，感謝妳總在實驗空檔撥空接我的電話，回答我許多氧化壓力實驗的疑慮。最後，我想將此篇論文獻給我的精神支柱：爸爸、媽媽、妹妹，有你們，我才能領到這張碩士班的畢業證書，謝謝！. II.

(4) 目錄目錄.......................................................................................................... III 摘要.......................................................................................................... VI Abstract..................................................................................................VII 圖表目錄 .............................................................................................. VIII. 壹、緒論 ....................................................................................................1 一、脊髓小腦運動失調症 ................................................................1 二、第十七型脊髓小腦運動失調症 ................................................3 三、氧化壓力 ....................................................................................4 四、熱休克蛋白 ................................................................................5 貳、研究目的 ............................................................................................8 參、研究材料與方法 ................................................................................9 一、誘導式 SCA17 細胞模式 ..........................................................9 (一)細胞來源..............................................................................9 (二)細胞培養..............................................................................9 (三)全長 TBP 重組質體構築 ....................................................9 (四)誘導式細胞株建立..............................................................9 (五) RNA 分析 .........................................................................11 1. RNA 萃取 .....................................................................11 III.

(5) 2.反轉錄作用(Reverse transcription) ..............................11 3.同步定量 PCR (Real-time PCR)...................................12 (六)蛋白質分析........................................................................12 1.蛋白質萃取 ...................................................................12 2.西方轉漬法(Western blotting)......................................13 (七)細胞螢光觀察....................................................................14 (八)流式細胞儀分析(FACS) ...................................................15 (九)ROS 表現量分析 ...............................................................15 1.細胞培養 .......................................................................15 2. Dihydroethidium 染色..................................................15 3. Dichlorofluorescein 染色 .............................................16 (十)細胞存活率檢測................................................................17 1. Hoechst 33342/PI 雙螢光染色法 ................................17 2. Trypan Blue 染色法 .....................................................17 二、短暫表現 SCA17 細胞模式 ....................................................18 (一)細胞培養............................................................................18 (二) HSPs 重組質體構築.........................................................18 1. DNA 片段純化.............................................................18 2.轉型勝任細胞(Competent cells)製備...........................19. IV.

(6) 3.接合反應 .......................................................................20 4.細菌轉型作用(Transformation)....................................20 5.質體 DNA 小量製備.....................................................20 6.質體 DNA 大量製備.....................................................21 (三) HSPs 轉染(Transfection) ..................................................22 (四)細胞螢光觀察....................................................................23 肆、結果 ..................................................................................................24 ㄧ、誘導式 SCA17 細胞模式之建立 ............................................24 二、SCA17 細胞模式之氧化壓力指標表現 .................................26 三、誘導式 SCA17 細胞模式之敏感性及耐受性測試 ................27 四、過度表現 HSPs 對短暫表現 SCA17 細胞模式之影響.........28 伍、討論 ..................................................................................................31 ㄧ、誘導式 SCA17 細胞模式之建立 ............................................31 二、SCA17 細胞模式之氧化壓力指標表現 .................................32 三、誘導式 SCA17 細胞模式之敏感性及耐受性 ........................33 四、過度表現 HSPs 對短暫表現 SCA17 細胞模式之影響.........34 陸、參考文獻 ..........................................................................................36 柒、附錄圖表 ..........................................................................................49. V.

(7) 摘要脊髓小腦運動失調症(spinocerebellar ataxias，簡稱 SCAs)為體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，有超過 28 種的亞型。其中的遺傳性第十七型脊髓小腦運動失調症 (SCA17)與染色體 6q27 位置 TATA binding protein (TBP)基因的 CAG 三核苷重複擴增相關。突變的 TBP 蛋白具有延長的聚麩醯胺(polyQ)片段，可能導致蛋白質結構錯誤摺疊及聚集，而 polyQ 擴增造成的氧化壓力與疾病形成有關。當細胞處於氧化壓力下，會提升熱休克蛋白的表現，如 HSPA5、HSPA8 和 HSPB1 等監護蛋白(chaperones)，以便抵抗氧化壓力所造成的傷害。監護蛋白可經由穩定錯誤摺疊蛋白的結構，降低聚集的生成，來緩和 polyQ 突變蛋白的毒性。藉由熱休克蛋白和氧化壓力與 SCA17 的關連性做探討，我們可以更瞭解 SCA17 的致病機轉，有助於疾病的改善或治療策略的發展。藉誘導式細胞模式的建立，本篇研究結果顯示擴增 polyQ 的 TBP 蛋白聚集在細胞核中，且細胞週期呈現較高的 sub G1%。表現擴增 polyQ 的 TBP 使細胞活性氧分子產量增加，且對 staurosporine 處理的敏感度提升及缺血清的耐受度下降。短暫表現 TBP 的細胞模式顯示，HSPA5、HSPA8 和 HSPB1 的過度表現可以降低聚集的生成。. VI.

(8) Abstract Autosomal heterogeneous. dominant group. spinocerebellar of. ataxias. neurodegenerative. (SCAs). disorders. are. a. involving. progressive degeneration of the cerebellum, brainstem, and spinal tract. More than 28 subtypes have been reported. SCA17 is caused by an expanded polyglutamine (polyQ) in a general transcription initiation factor, the TATA-box binding protein (TBP). The mutated TBP with polyQ expansion causes a conformational change to promote misfolding and aggregation. Futhermore, a polyQ mutation can induce reactive oxygen species (ROS) that directly contribute to cell death. During oxidative stress, synthesis of several heat shock proteins (such as HSPA5, HSPA8 and HSPB1 chaperones) increase to protect cells against oxidative stress. Chaperones may modulate polyQ protein toxicity by stabilizing the misfolded conformation to reduce aggregate formation. Investigation of chaperones and oxidative stress associated with SCA17 may not only contribute to the understanding of molecular mechanism of the disease but also provide therapeutic strategy to slow down the disease progression. By establishing stably induced cell model, the study results revealed that TBP with expanded polyQ formed nuclear aggregates with significant increase in sub G1 phase of cell cycle. Cells expressed polyQ-expanded TBP display increased ROS production and increased sensitivity to staurosporine treatment and serum deprivation. Using transient cell model, HSPA5, HSPA8 and HSPB1 overexpression can reduce aggregate formation.. VII.

(9) 圖表目錄圖一、誘導式 SCA17 細胞模式建立之流程圖。 ................................49 圖二、誘導式 SCA17 細胞模式之 TBP mRNA 誘導表現。...............50 圖三、誘導式 SCA17 細胞模式之 TBP-Qn-HA 蛋白質誘導表現。..51 圖四、誘導式 SCA17 細胞模式之 TBP-Qn-HA 蛋白聚集觀察。......52 圖五、誘導式 SCA17 細胞模式之細胞週期表現。 ............................53 圖六、誘導式 SCA17 細胞模式處理 TBH 及缺血清處理之 ROS 表現情形。...............................................................................................54 圖七、誘導式 SCA17 細胞處理 Staurosporine 之螢光染色觀察及相對細胞存活率。 ..................................................................................55 圖八、誘導式 SCA17 細胞處理 Staurosporine 及缺血清處理之相對細胞存活率。.......................................................................................56 圖九、TBP cDNA 重組質體。...............................................................57 圖十、HSPs 重組質體。.........................................................................58 圖十一、短暫表現 SCA17 細胞模式共轉染 HSPA5 之 TBP 蛋白聚集觀察。...............................................................................................59 圖十二、短暫表現 SCA17 細胞模式共轉染 HSPA8 之 TBP 蛋白聚集觀察。...............................................................................................60 圖十三、短暫表現 SCA17 細胞模式共轉染 HSPB1 之 TBP 蛋白聚集. VIII.

(10) 觀察。...............................................................................................61. 表一、增幅 HSPs cDNA 的引子對及條件 ............................................62. IX.

(11) 壹、緒論. 一、脊髓小腦運動失調症脊髓小腦運動失調症(spinocerebellar ataxias，簡稱 SCAs)為體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，有超過28種的亞型(Manto, 2005; Duenas et al., 2006)，一般簡稱小腦萎縮症。多數脊髓小腦運動失調症的患者在臨床上有腦幹、脊髓或週邊神經系統損傷的情形(Wullner, 2003)。此外，患者因小腦萎縮、小腦功能不良引起緩慢漸進性的「共濟失調」，而有身體運動協調功能不良的症狀，包括：口齒不清、吞嚥困難、寫字字體不清晰、手部細緻運動不良以及步履不穩，或因脊髓功能不良所導致的步態不穩等。各類脊髓小腦運動失調症相似的臨床症狀不易區分，常借助分子層次的診斷來確定病型。脊髓小腦運動失調症依基因病理機轉不同可分為三大類。大部分的患者屬第一類，包括SCA1、2、3、6、7、17 及齒狀核紅核殼視丘下核萎縮症(dentatorubropallidoluysian atrophy，簡稱DRPLA)等(Orr et al. 1993; Kawaguchi et al. 1994; Koide et al. 1994; Imbert et al. 1996; Pulst et al. 1996; David et al. 1997; Zhuchenko et al. 1997; Koide et al. 1999)，此類患者腦部神經退化及死亡，是由於CAG重複序列不正常擴增，轉譯出構形改變的異常聚麩醯胺鏈(polyglutamine tract，簡稱 polyQ tract)蛋白質產物，而構形異常的蛋白會出現摺疊錯誤、溶解性 1.

(12) 降低的情形，進而形成聚集(aggregation)。一些熱休克蛋白(heat shock protein)、監護蛋白(chaperones)、轉錄調節因數(transcription factor)、 26S蛋白酶體次單元(proteasome subunits)等會與這些帶polyQ擴增的突變蛋白結合，形成對細胞具毒性的不溶性包涵體(inclusion body)，影響細胞的生理功能(Perez et al., 1998; Mitsui et al., 2002; Schmidt et al., 2002)；然而有持相反論點的研究指出：包涵體的形成對細胞來說是一種保護機制(Ravikumar et al., 2004)。 Maltecca和Manto發現：患者的子女常有提早發病且症狀加重的情形，這種現象為期望效應(anticipation)，即突變遺傳至子代後，三核苷酸重複擴增的數目會增加(Maltecca et al., 2003; Manto, 2005)。第二類則包括SCA8、10、12等(Holmes et al. 1999; Koob et al. 1999; Matsuura et al. 2000)，為基因在非轉譯區含三或五核苷酸重複擴增造成基因變異而致病；而第三類包括SCA5、14、27等(van de Warrenburg et al. 2003; Yabe et al. 2003; Stevanin et al. 2004; Alonso et al. 2005; Brusse et al. 2006; Ikeda et al. 2006)，為錯意突變(missense mutation)、剪接位突變(splice site mutation)、缺失突變(deletion mutation)或無意義突變(nonsense mutation)所致。目前此病仍無法有效根治，只能以藥物控制或物理治療減緩疾病進程。. 2.

(13) 二、第十七型脊髓小腦運動失調症遺傳性第十七型脊髓小腦運動失調症 (SCA17) 與染色體 6q27位置 TATA binding protein (TBP)基因的 CAG三核苷重複擴增相關 (Koide et al., 1999; Nakamura et al., 2001)。突變的 TBP蛋白具有延長的 polyQ片段，可能導致蛋白質結構錯誤摺疊及聚集，最後形成不溶性的包涵體 (inclusion body)。分析這些包涵體成分時，發現有些熱休克蛋白(heat shock proteins, Hsp)及協助蛋白水解的ubiquitin蛋白也被包覆在其中，可能是細胞內機制試圖分解這些包涵體卻無法順利達成。當過多的此類相關蛋白被包覆在包涵體，即影響細胞正常生理功能，尤其神經細胞可能較為敏感，往往造成其退化或死亡(Mitsui et al., 2002; Perez et al., 1998; Schmidt et al., 2002; Wyttenbach et al., 2001)。 1999年Koide等人首度報導一個日本家族出現漸進式的神經性退化病症，他們的TBP基因上含63個CAG重複序列(Koide et al., 1999)。正常個體的三核苷數目為25~42，而家族性和偶發性患者中，所發現的 CAG 三核苷會擴增至 43~66 ，因而引起運動失調與認知缺失 (Fujigasaki et al., 2001; Nakamura et al., 2001; Zühlke et al., 2001; Silveira et al., 2002; De Michele et al., 2003; Hernandez et al., 2003; Maltecca et al., 2003; Reid et al., 2003; Rolfs et al., 2003; Zühlke et al., 2003)。除上述症狀外，第十七型脊髓小腦運動失調症還有其他 3.

(14) 臨床症狀，包括：小腦萎縮、錐體外症候(pyramidal signs)、口齒不清、肌張力失常等(Koide et al., 1999; Filla et al., 2002; Rolfs et al., 2003; Hagenah et al., 2004)。2004年Bauer等人更發現：SCA17 具有類似於亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s disease，簡稱HD)的症狀(Bauer et al., 2004)。 TBP基因三核苷酸重複序列不正常擴增在許多台灣地區的神經疾病病患，包括：帕金森氏症(Parkinson’s disease，簡稱PD)、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease，簡稱AD)及精神分裂症患者身上，也發現有類似的現象(Wu et al., 2004, 2005; Chen et al., 2005; Lin et al., 2007)，這可能意謂著TBP基因的不正常擴增可能與多種神經疾病相關。三、氧化壓力活性氧分子(Reactive oxygen species，ROS)，是一類含氧並具高度活躍化性分子的總稱，人體在外在環境壓力或體內發炎反應下會產生 ROS ，進而引發免疫反應來對身體行調節與代謝。氧化壓力 (oxidative stress)的形成常因ROS過量而引發，生物體於氧化壓力下會形成自由基(free radicals)來攻擊核酸、蛋白質、脂肪酸等生物大分子，導致生物體的損傷或衰老。 PolyQ擴增造成的氧化壓力與疾病形成有關(Browne et al., 1997;. 4.

(15) Trushina and McMurray, 2007)。In vitro和in vivo實驗都証實huntingtin 突變蛋白會誘發氧化壓力的產生(Browne et al., 1999; Bogdanov et al., 2001; Wyttenbach et al., 2002)。當細胞處於氧化壓力下，會提升熱休克蛋白的表現以便抵抗壓力所造成的傷害(Ohtsuka and Hata, 2000; Ohtsuka and Suzuki, 2000)。 2002年Wyttenbach等人發現，表現huntingtin突變蛋白的細胞會因 HSP27的幫助而減少活性氧分子的產生，這表示監護蛋白具保護細胞免於氧化壓力的作用(Wyttenbach et al., 2002)。四、熱休克蛋白熱休克蛋白Heat Shock Proteins (HSPs)首發於果蠅。Tissières等人將果蠅幼蟲的唾液腺做熱休克處理，隨後分離出6種新的蛋白質，即為熱休克蛋白(Tissières et al., 1974)。熱休克蛋白廣泛存在於人體的細胞質、粒腺體、內質網及細胞核中(Kiang and Tsokos, 1998)，當暴露於高溫、缺氧、寒冷、感染、饑餓的時候，就會誘發這些蛋白質的合成，對個體有保護作用，使細胞得以維持正常功能。依分子量大小，熱休克蛋白可分為：小分子熱休克蛋白(small Heat Shock Proteins，簡稱sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90、HSP100等五類。藉由熱休克反應可以抑制polyQ的聚集，進而減少細胞毒性(Zhang and Sarge, 2007)。許多熱休克蛋白都有監護蛋白 (chaperones) 的活性，例如：. 5.

(16) HSPA5、HSPA8和HSP27。監護蛋白可經由穩定錯誤摺疊蛋白的結構或與致病蛋白結合，並促進包涵體的形成來緩和突變蛋白質的毒性 (Sakahira et al., 2002)。監護蛋白的過度表現可以幫助蛋白質重新摺疊或使錯誤摺疊的蛋白質降解，並改善動物模式之存活(Warrick et al., 1999)。 HSPA5又可稱為免疫血球素重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein，簡稱BiP)或78 kDa葡萄糖調節蛋白(78 kDa glucose-regulated protein，簡稱GRP78)。HSPA5與內質網中蛋白質的摺疊和聚合有關，此蛋白的水解比率降低及不正常的蛋白摺疊都會導致體染色體隱性遺傳疾病－－ Marinesco-Sjogren 綜合症病徵的出現，包括：運動失調、漸進式肌病，以及白內障(Anttonen et al., 2005)。 Kakiuchi等人於2005年的報導更指出：遺傳變異改變HSPA5的調節會造成躁鬱症的發生(Kakiuchi et al., 2005)。 HSPA8 (heat shock 70kDa protein 8)，又稱HSC70 (70 kDa heat shock cognate protein)，能夠幫助蛋白質正確摺疊。有一些文獻指出：透過氧化壓力、熱休克，或營養缺乏的方式可以調節HSPA8的表現 (Bernardini et al., 2004; Lo et al., 2004; Shim et al., 2006)。2006年就有學者發現：熱處理的大鼠大腦會有HSPA8增加的情形，而使細胞免於死亡(Belay and Brown, 2006)，表示HSPA8在神經元受壓力刺激的保護. 6.

(17) 機制扮演著重要的角色。 HSP27 又稱為 HSPB1 ，能抵制 polyQ 突變誘發之活性氧分子 (reactive oxygen species，簡稱ROS)所造成的細胞死亡(Wyttenbach et al., 2002)。而SCA17小鼠模式的大腦中可以發現HSP27表現減少，這是由於TFIIB與不正常的TBP結合，但突變的TBP無法順利連接到包含 TATA的啟動子(TATA-containing promoter)，使得啟動子無法順利啟動，此情形發生在HSPB1啟動子與TBP及TFIIB結合減少時，HSPB1 的表現量自然會降低(Friedman et al., 2007)。. 7.

(18) 貳、研究目的. 由於 polyQ 詳細致病機轉仍不清楚，且目前無根治的方法，所以必須對此疾病作更進一步的研究，期待發現有效改善或治療疾病的方法。在本篇研究中，將建立穩定誘導正常 TBP-Q36 及多麩醯胺擴增 TBP-Q61、TBP-Q79 的人類胚胎腎 293 細胞，以 doxycycline 誘導表現後，使擴增的 TBP-Q61 及 TBP-Q79 形成聚集，觀察其 mRNA、蛋白質表現，細胞型態、細胞週期的改變，以及細胞存活的情形；或者利用短暫表現 HSPA5、HSPA8、HSPB1 的方式，觀察病態細胞改善的情形。此外，先前的研究發現 PolyQ 擴增會形成氧化壓力，造成神經退化性疾病，所以透過氧化壓力指標─活性氧分子的表現量，來瞭解細胞對氧化壓力的耐受情形。本篇研究著重於 SCA17 之致病機轉，將對疾病改善或治療策略具參考價值。. 8.

(19) 參、研究材料與方法. 一、誘導式SCA17細胞模式 (一)細胞來源自Invitrogen購買Flp-InTM T-REXTM 293誘導式細胞株和Flp-In T-Rex誘導系統。 (二)細胞培養以 DMEM 培養液 (Gibco) ，包含 10% FBS 、 1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/L sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin，以及兩種篩選細胞之抗生素(100 μg/ml Zeocin和15 μg/ml Blasticidin S)培養Flp-InTM T-REXTM 293 細胞株於10 cm2 dish 中，並將細胞置於37℃、5% CO2且溼度穩定之細胞培養箱。待細胞生長至7、8分滿，以1:5 ~ 1:10的稀釋比例進行細胞繼代培養。 (三)全長TBP重組質體構築將HA-tagged的全長TBP-Q36/61/79基因片段接進pcDNA5載體上構築完成(李麗卿, 2009)。 (四)誘導式細胞株建立圖一所示為誘導式 SCA17 細胞模式建立的流程圖。 Flp-InTM T-REXTM 293細胞株含FRT (Flp Recombinase Target)序列及抗生素篩. 9.

(20) 選基因zeocin、blasticidin。另外，其TetR (Tet repressor)基因可調控 CMV/TetO2啟動子下游基因表現。將HA-tagged的全長TBP (TBP-Q36/61/79)的基因片段構築於具相同 FRT序列與Hygromycin篩選基因的pcDNA5/FRT/TO表現載體上，並共轉表現重組酵素(Flp Recombinase)載體pOG44至Flp-InTM T-REXTM 293細胞株中，如此便能得到嵌入細胞基因中的單一重組全長TBP (TBP-Q36/61/79) 基因片段。利用 tetracycline 或結構類似物與 TetR 蛋白結合，使 pcDNA5/FRT/TO載體上的CMV/TetO2啟動子能夠驅動TBP-Q36/61/79的表現。本實驗加入1 μg/ml doxycycline誘導TBP-Q36/61/79表現，並觀察細胞誘導2天及4天後的表現情形。取250 μl OptiMEM與8 μl脂質試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 混勻，作用5分鐘，並利用等待的時間配製DNA混合液。取250 μl OptiMEM加入總量為8 μg的DNA (pcDNA5-TBP-Q36/61/79-HA重組質體 DNA：pOG44載體= 1：7)。接著於6孔培養盤中加入2 ml含有7 × 105 的Flp-InTM T-REXTM 293細胞液，每孔再各加入250 μl的Lipofectamine 2000混合液及DNA混合液，充分混勻作用20分鐘後，再以不含抗生素的10% FBS/DMEM之細胞培養液進行培養。待細胞貼附後，改以含 100 μg/ml Hygromycin B及5 μg/ml Blasticidin S的10% FBS/DMEM進. 10.

(21) 行轉染成功的細胞株篩選。控制組為Flp-InTM T-REXTM 293細胞共轉入pcDNA5/FRT/TO與pOG44載體。 (五) RNA分析 1. RNA萃取用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養3.5 × 105 的誘導式 SCA17細胞株於6孔培養盤，隔天加入1 μg/ml doxycycline，之後每兩天加一次1 μg/ml doxycycline，靜待4天後利用Trizol reagent (Invitrogen) 進行RNA萃取。以適量PBS清洗細胞後，加入500 μl Trizol reagent打破在6孔培養盤上的細胞，將細胞懸浮液收集至1.5 ml離心管。冰上作用5分鐘後，再加入1/5倍體積的chloroform混勻，再次冰上作用5分鐘後，4℃離心13,000 rpm、15分鐘。取含RNA的上清液至新的1.5 ml離心管中，並加入0.8倍體積的isopropanol混勻，-20℃作用1小時後，4 ℃ 離心 13,000 rpm 、 15 分鐘。去除上清液後，加入 1 ml 70% EtOH/DEPC-ddH2O，接著 4℃離心13,000 rpm、5分鐘。去除上清液後，將RNA pellet置於室溫自然乾燥，之後加入適量DEPC-ddH2O回溶RNA，最後進行RNA濃度測定，並將RNA放置-80℃長久保存。 2.反轉錄作用(Reverse transcription) 取6.25 μg RNA加0.5 μl Rnase-free Dnase進行25 μl的酵素作用，再利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Cat. No.4368814,. 11.

(22) Applied Biosystems)將RNA反轉錄成cDNA。以25℃ 10分鐘、37℃ 120 分鐘、85℃ 5秒鐘進行反轉錄作用，其20 μl反應溶液包含2 μg的 RNA、2 μl 10X RT buffer、0.8 μl 25X dNTP Mix (100 mM)、2 μl 10X RT Random Primer，以及 1 μl MultiScribeTM reverse transcriotase。反應完成後將產物置於-20℃保存。 3.同步定量PCR (Real-time PCR) 使用TBP螢光探針(TaqMan, Applied Biosystems)，以ABI PRISM 7000 Sequence Detectin System儀器進行real-time PCR，並以HuHPRT 螢光探針(4326321E, Applied Biosystems)作為內生性對照組。25 μl反應溶液包含25 ng cDNA、1X mix solution (2X TaqMan Universal PCR Master mix - 20X Primer/Probe mixture)。反應條件為50℃、2分鐘，接著以95℃、10分鐘進行cDNA雙股裂解，然後做95℃ 15秒、60℃ 60 秒的40個循環式裂解。上述RNA萃取、反轉錄作用實驗進行兩次重複，所合成之cDNA也進行兩次重複的real-time PCR，最後將四次 RNA表現量結果進行統計分析。 (六)蛋白質分析 1.蛋白質萃取用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養5 × 105的誘導式SCA17 細胞株於6孔培養盤，隔天加入1 μg/ml doxycycline，靜待48小時後，. 12.

(23) 把細胞收進1.5 ml離心管。接著以PBS清洗兩次後，加入適量Triton-100 buffer (0.5% Triton-100 - 5% Glycerol - 1 mM DTT - 1X protease inhibitor mixture - PBS) 於冰上作用15分鐘，隨後以4℃離心14,000 rpm、30分鐘，再將上清液取至新的1.5 ml離心管，置於-80℃長期保存。 2.西方轉漬法(Western blotting) 以Bio-Rad Protein Assay進行蛋白質定量後，取等量sample加入適量sample buffer (50 mM Tris, pH 6.8 - 2% SDS - 10% Glycerol - 2.5% β-mercaptoethanol - 0.005% bromophenolblue)，進行沸水浴5分鐘，接著以10% SDS-聚丙烯醯胺電泳(簡稱SDS-PAGE)依分子量大小分離蛋白質。隨後利用XCell IITM Blot Module (Invitrogen)及 transfer buffer (25 mM Tris - 0.2M Glycine - 20% methanol)將蛋白轉漬至硝化纖維膜 (nitrocellulose transfer membrane, Whatman)。於 blocking buffer (3% non-fat milk/PBS)浸泡1小時後，用washing buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 - 0.05% Tween 20)清洗膜約10分鐘。再加入一級抗體：稀釋3,000 倍的Mouse anti-1TBP18 (Abcam)與稀釋10,000倍作為控制組的Mouse anti-β-actin (Chemicon)，4℃作用隔夜。以每次15分鐘的方式清洗膜三次，再加入稀釋 10,000 倍的二級抗體 goat anti-mouse IgG (H&L) (Jackson)。於室溫作用1.5小時後，再次以每次15分鐘的方式清洗膜三. 13.

(24) 次，隨後加入冷光呈色試劑 (Millipore) 於膜上，以 ImagerReader LAS-3000軟體偵測蛋白表現的情形。上述蛋白質萃取實驗進行兩次重複，每次萃取的蛋白也同樣進行兩次重複的西方轉漬，最後利用 AlphaImager軟體進行四次呈色結果的定量分析。 (七)細胞螢光觀察用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養8 × 104的誘導式SCA17 細胞株於已經過poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理的coverslips (置於12孔盤中)，隔天加入1 μg/ml doxycycline，靜待48小時後，再加入1 μg/ml doxycycline靜待48小時。然後以PBS潤洗細胞兩次，再以4% paraformaldehyde/PBS作用10分鐘固定細胞，吸掉溶液後，加入0.1% Triton X-100/PBS作用20分鐘。再次以PBS潤洗兩次後，以blocking buffer (0.5% BSA - 20 mM Glycine - PBS)在4℃浸泡細胞過夜。隔天加入稀釋500倍的Mouse anti-1C2 (Chemicon)一級抗體，4℃作用過夜。接著以blocking buffer清洗coverslips，每次15分鐘，隨後加入稀釋500 倍的二級抗體：Alexa Fluor 488 (Invitrogen)，4℃避光作用2小時。再次以blocking buffer清洗coverslips，每次15分鐘後，加入稀釋1000倍的DAPI (4’-6-diamidino-2-phenylindole，細胞核染劑)，避光作用20~30 分鐘，之後以PBS清洗三次，進行封片。最後利用Leica TCS SP2螢光顯微鏡觀察細胞形態、聚集表現位置與團塊大小等。. 14.

(25) (八)流式細胞儀分析(FACS) 用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養5 × 105的誘導式SCA17 細胞株於6孔培養盤，隔天加入1 μg/ml doxycycline，靜待24小時後做缺血清處理24小時，再把細胞收進15 ml離心管。接著以PBS清洗兩次後，離心1,000 rpm、5分鐘，之後將離心管置於冰上，加入1 ml PBS 懸浮細胞，再緩慢滴入99.5% EtOH混勻。冰上作用15分鐘後，離心 1,500 rpm、5分鐘，在去除上清液後，加入PI染色溶液(50 μg/ml PI - 100 μg/ml RNase A - 1% Triton-100 - PBS) 37℃作用30分鐘。隨後加入3 ml PBS稀釋染劑並清洗細胞，再離心1,500 rpm、5分鐘，清除上清液後，加入 500 μl PBS 懸浮細胞。用 150 目絹框將細胞過篩後，利用 FACSCalibur (Bekton Dickison)進行細胞週期以及細胞凋亡情形的分析。上述流式細胞儀分析實驗進行兩次重複，再將數據結果做統計分析。 (九)ROS表現量分析 1.細胞培養用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養5 × 105的誘導式SCA17 細胞株於6孔培養盤，隔天加入1 μg/ml doxycycline，靜待24小時後做缺血清或50 μM tert-butyl hydroperoxide (簡稱TBH)處理24小時。 2. Dihydroethidium染色. 15.

(26) 加入5 μM Invitrogen的dihydroethidium (簡稱DHE) 37℃染色一小時，接著以200 μl 0.05% trypsin-EDTA使細胞懸浮，再加入800 μl細胞培養液緩和其作用，隨後將細胞收集進1.5 ml離心管。離心3,000 rpm、 5分鐘後，以PBS沖洗細胞團塊，再次離心3,000 rpm、5分鐘，接著加入230 μl PBS懸浮細胞。取出1 × 105細胞懸浮液，加入96孔螢光偵測盤中，再用SpectraMax Gemini XPS (Molecular Devices)以Ex/Em = 518 nm/605 nm及Ex/Em = 355 nm/420 nm偵測螢光表現，以便觀察ROS在細胞表現量。上述DHE染色分析進行三次重複，且每個sample讀取兩次螢光表現值。 3. Dichlorofluorescein染色加入5 μM Invitrogen的dichlorofluorescein (簡稱DCF) 37℃染色一小時，接著以200 μl 0.05% trypsin-EDTA使細胞懸浮，再加入800 μl 細胞培養液緩和其作用，隨後將細胞收集進1.5 ml離心管。離心3,000 rpm、5分鐘後，以PBS沖洗細胞團塊，再次離心3,000 rpm、5分鐘，接著加入230 μl PBS懸浮細胞。取出1 × 105細胞懸浮液，加入96孔螢光偵測盤中，再用SpectraMax Gemini XPS (Molecular Devices)以 Ex/Em = 485 nm/530 nm偵測螢光表現，以便觀察ROS在細胞表現量。上述DCF染色分析進行三次重複，且每個sample讀取兩次螢光表現值。. 16.

(27) (十)細胞存活率檢測 1. Hoechst 33342/PI雙螢光染色法用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養5 × 105的誘導式SCA17 細胞株於6孔培養盤，隔天加入1 μg/ml doxycycline，靜待24小時後加入50 nM staurosporine (簡稱 STS)。24小時後再加入0.1 μg/ml Hoechst 33342及1.5 μg/ml propidium iodide (簡稱PI)做細胞螢光染色，並於37 ℃避光作用20分鐘。以200 μl 0.05% trypsin-EDTA使細胞懸浮，再加入800 μl細胞培養液緩和其作用，隨後將細胞收集進1.5 ml離心管。離心3,000 rpm、5分鐘後，以PBS沖洗細胞團塊，再次離心3,000 rpm、 10分鐘，接著加入30 μl PBS懸浮細胞。最後以Leica DMI 4000倒立光學顯微鏡觀察細胞形態，並將每種細胞株及每個處理條件各以相機照下 3 個視野。再用 MetaMorph 軟體計算細胞存活率。上述 Hoechst 33342/PI雙螢光染色進行兩次重複，再將MetaMorph軟體所計算出的細胞存活率結果做統計分析。存活率計算公式為：活細胞數目/總細胞數目 = 細胞存活%。 2. Trypan Blue染色法用含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養2 × 105的誘導式SCA17 細胞株於24孔培養盤，隔天加入1 μg/ml doxycycline，靜待24小時後加入 100 nM STS 或做缺血清處理 24 小時。接著以 100 μl 0.05%. 17.

(28) trypsin-EDTA使細胞懸浮，再加入400 μl細胞培養液緩和其作用，隨後將細胞收集進1.5 ml離心管。離心3,000 rpm、5分鐘後，以PBS沖洗細胞團塊，再次離心3,000 rpm、5分鐘，接著加入50 μl PBS懸浮細胞。取出10 μl細胞懸浮液，加入10 μl Trypan Blue室溫反應5分鐘，再以 CountessTM Automated Cell Counter(Invitrogen)算出細胞存活率。上述 Trypan Blue染色進行三次重複，且每個sample讀取兩次存活率結果，再將機器所計算出的細胞存活率結果做統計分析。二、短暫表現SCA17細胞模式 (一)細胞培養以包含兩種篩選細胞之抗生素(3 mg/ml penicillin-10.5 mg/ml streptomycin)的10% FBS/DMEM培養293T細胞株於10 cm2 dish中，並將細胞置於37℃、5% CO2且溼度穩定之細胞培養箱。待細胞生長至 7、8分滿，以1:5 ~ 1:10的稀釋比例進行細胞繼代培養。 (二) HSPs重組質體構築 1. DNA片段純化利用Primer Express軟體設計可以夾出HSPs DNA片段，並於序列尾部帶有FLAG-tag的primer (表一)，再與293細胞所萃取並反轉錄之 cDNA進行94℃ 1分鐘 1個循環，94℃ 30秒鐘、70℃ 30秒鐘、72℃ 1 分鐘共30個循環，72℃ 10分鐘 1個循環，72℃ 30分鐘 1個循環的LA. 18.

(29) Tag PCR。其25 μl反應溶液包含50 ng/μl的RNA、2.5 μl 10X LA buffer、 0.4 μl 2.5 mM LA dNTP、2.5 μl 50 mM Mg2+、0.5 μl primer，以及0.2 μl LA Tag (Takara)。HSPA5和HSPA8 DNA片段的PCR條件相同，HSPB1 則為95℃ 5分鐘 1個循環，95℃ 30秒鐘、84℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘共 30個循環，72℃ 10分鐘 1個循環，72℃ 30分鐘 1個循環。將限制酵素作用過之質體DNA以及PCR產物進行洋菜膠電泳分離，切下所需的DNA片段後，用Gel Extraction Kit (Viogene)做膠體純化。先加入700 μl GEX buffer進行60℃ 10分鐘乾浴，使膠體溶解，再將溶液取至純化管柱中，離心13,000 rpm、1分鐘。去除廢液後，加入 500 μl wash I buffer，離心13,000 rpm、1分鐘，再去除廢液，隨後加入700 μl wash II buffer，離心13,000 rpm、1分鐘。去除廢液後，再次離心13,000 rpm、1分鐘，接著將管柱移至新的1.5 ml離心管，並加入 20 μl ddH2O。室溫靜置30分鐘後，再離心13,000 rpm、1分鐘，透明溶液即為純化完成的DNA片段，最後取純化後的DNA進行洋菜膠電泳檢查。 2.轉型勝任細胞(Competent cells)製備在1 ml含tetracycline的LB培養基中(10 g/l trypton - 5 g/l yeast extract - 10 g/l NaCl)接種大腸桿菌TOP-10 F'單一菌落，37℃、200 rpm 震盪培養3小時。之後倒入50 ml LB中，以37℃、200 rpm隔夜震盪培. 19.

(30) 養。然後平均分裝到四個250 ml錐形瓶中，繼續培養約至OD600達0.75 ~ 1.00。之後將菌液置於冰上15分鐘，再以4℃離心4,000 rpm、5分鐘，並去除上清液。加入250 ml預冷之ddH2O懸浮細胞，再次以4℃離心 4,500 rpm、5分鐘，並去除上清液，細胞懸浮和離心的動作共重複四次，最後加入3 ml 10% glycerol懸浮細胞，再以每管45 μl的體積分裝進1.5 ml離心管中，置於-80℃長期保存。 3.接合反應於16℃進行接合反應隔夜，其反應總體積為5 μl，內含10X buffer (300 mM Tris - HCl pH 7.8 - 100 mM MgCl2 - 100 mM DTT - 10 mM ATP)、適量純化的DNA片段，以及0.25 μl T4 DNA ligase (3U)。 4.細菌轉型作用(Transformation) 於接合反應完成後，以70℃乾浴10分鐘，終止T4 DNA ligase的酵素反應，再置於冰上。取2 μl重組質體DNA加入20 μl的勝任細胞混勻，再以BIO-RAD GENE PULSERII進行1.25 kV、25 μF、200 Ω的電穿孔(electroporation)轉型作用。加入500 μl LB後，於37℃水浴30分鐘，再將150 μl菌液塗至每盤含50 μg/ml ampicillin、0.5M IPTG和 100mg/ml X-gal的LB培養基中，置於37℃培養箱中培養16~18小時。 5.質體DNA小量製備以滅菌牙籤挑選單一的白色菌落，畫在含50 μg/ml ampicillin的. 20.

(31) LB培養基上保留菌株，同時將牙籤置入1.5 ml離心管裡，含50 μg/ml ampicillin的1 ml LB培養液中攪拌。接著將培養基與培養液置於37 ℃、200 rpm培養隔夜，之後離心13,000 rpm、1分鐘，去除上清液。隨後加入70 μl solution I (50 mM glucose - 25 mM Tris-HCl pH 8.0 - 10 mM EDTA pH 8.0)震盪懸浮菌液，再加入140 μl solution II (0.2 N NaOH - 1% SDS)反轉數次，接著加入105 μl solution III (3M potassium acetate)，溫和反轉數次，再離心14,000 rpm、10分鐘。將含有核酸之上清液取至心的1.5 ml離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，反轉數次後，離心14,000 rpm、1分鐘，去除上清液。以100 μl 70%酒精清洗多餘鹽類後，放置室溫自然乾燥，再以50 μl 10 μg/ml RNase/ddH2O回溶 DNA，接著置於37℃水浴10分鐘，最後以0.8%洋菜膠電泳檢查重組質體DNA的大小正確性，並以限制酵素切割確認插入片段是否正確，再將重組質體DNA送定序作進一步確認。 6.質體DNA大量製備將定序正確之重組質體DNA菌落培養於含50 μg/ml ampicillin的1 ml LB培養液中，於37℃、200 rpm培養3小時後倒入65 ml含50 μg/ml ampicillin的培養液中培養隔夜。接著利用Viogene Ultrapure Plasmid Midiprep System (Midi-prep-V100)大量抽取質體與純化DNA。先將菌液離心8,000 rpm、5分鐘並去除上清液，再加入4 ml VP1 buffer震盪懸. 21.

(32) 浮細菌，隨後加入4 ml VP2 buffer靜置5分鐘，再反轉數次。再加入4 ml VP3 buffer反轉數次，然後以4℃離心12,000 rpm、15分鐘。此時，先加入10 ml VP4 buffer取Midiprep - V100管柱潤洗管柱內膜，再將離心後的上清液倒入管柱，利用重力讓菌液過管。接著加入15 ml VP5 buffer清洗雜質，再加入5 ml VP6 buffer沖堤出重組質體DNA，然後加入0.75倍體積的異丙醇反轉數次，離心14,000 rpm、10分鐘。去除上清液後，加入1/20倍體積的5M NaCl，並離心14,000 rpm、1分鐘，再次去除上清液，加入99.5% 酒精。離心14,000 rpm、1分鐘後，去除上清液，再加70% 酒精，再離心14,000 rpm、1分鐘，加入200 μl ddH2O 回溶DNA。隨後置於37℃水浴槽10 分鐘，再以限制酵素切割確認重組質體DNA之正確性，最後以OD260測定DNA濃度，再置於-20℃保存。 (三) HSPs轉染(Transfection) 以含篩選抗生素的10% FBS/DMEM，培養2 × 105的293T細胞於於已經過poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理的coverslips (置於12孔盤中)。隔天取100 μl OptiMEM與4 μl脂質試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen)混勻，作用5分鐘，並利用等待的時間配製DNA混合液。取 100. μl. OptiMEM 加入總量為 4. μg 的 DNA. (pEF-TBP-Q36/61/79-IRES/hrGFP重組質體DNA：pcDNA3-HSPs-FLAG 重組質體 DNA. =. 1 ： 1) ，另以 pcDNA3 載體與. 22.

(33) pEF-TBP-Q36/61/79-IRES/hrGFP重組質體DNA共轉染，作為實驗的控制組。pEF-TBP-Q36/61/79-IRES/hrGFP重組質體DNA為將TBP-Q36/61/79基因片段以限制酵素EcoRI切位接進pEF-IRES/hrGFP載體上構築完成(李麗卿, 2009)。接著換置1.5 ml不含抗生素的10% FBS/DMEM於12孔培養盤中，並將Lipofectamine 2000混合液及DNA混合液加在一起混勻，作用20分鐘後，每孔各加入200 μl的混合液。37℃培養6小時之後，再換置含篩選抗生素的10% FBS/DMEM培養48小時。 (四)細胞螢光觀察以PBS潤洗12孔盤中的細胞兩次，再以4% paraformaldehyde/PBS 作用10分鐘固定細胞，吸掉溶液後，加入0.1% Triton X-100/PBS作用 20分鐘。再次以PBS潤洗兩次後，以blocking buffer (0.5% BSA - 20 mM Glycine - PBS)在4℃浸泡細胞過夜。隔天加入稀釋500倍的Mouse anti-1C2 (Chemicon)一級抗體，4℃作用過夜。接著以blocking buffer 清洗coverslips，每次15分鐘，隨後加入稀釋500倍的二級抗體：Cy5 (Zymed)，4℃避光作用2小時。再次以blocking buffer清洗coverslips，每次 15 分鐘後，加入稀釋 1000 倍的 DAPI (4’-6-diamidino-2-phenylindole，細胞核染劑)，避光作用20~30分鐘，之後以PBS清洗三次，進行封片。最後利用Leica TCS SP2螢光顯微鏡觀察細胞形態、聚集表現位置與團塊大小等。. 23.

(34) 肆、結果. ㄧ、誘導式SCA17細胞模式之建立利用 pcDNA5/FRT/TO 表現載體及包含全長 TBP cDNA (TBP-Q36/61/79)的重組質體(李麗卿, 2009)，來建立誘導式SCA17細胞模式。上述質體與pOG44載體共轉入Flp-InTM T-REXTM 293細胞株後，進行二週的抗生素處理，篩選誘導式SCA17細胞模式。接著利用同步定量 PCR 偵測外源性 TBP-Q36/61/79-HA 經 doxycycline 誘導後的 mRNA 表現情形，來檢視所送入的 TBP-Q36/61/79-HA基因的表現情形。如圖二所示：(A)為偵測內生性TBP 及外源性TBP-Q36/61/79-HA mRNA的表現，並將結果相對於HuHPRT mRNA表現量作圖，由圖可知，誘導表現0、2、4 天後，vector細胞的TBP/HuHPRT的相對表現量為0.29、0.31、0.41，TBP-Q36-HA細胞的TBP/HuHPRT 的相對表現量為0.73、10.99、11.58，TBP-Q61-HA細胞的TBP/HuHPRT 的相對表現量為0.71、9.75、11.98，TBP-Q79-HA 細胞的TBP/HuHPRT 的相對表現量為0.90、11.18、11.28。(B)為以無誘導當作1.0倍，計算TBP-Q36/61/79-HA基因的mRNA誘導表現倍數，從圖中可知TBP-Q36-HA基因在誘導表現2天後，mRNA增加約15倍；在誘導表現4天後，mRNA增加約16倍；而TBP-Q61-HA基因在誘導表現 24.

(35) 2天後，mRNA增加約14倍，4天後增加約17倍，TBP-Q79-HA基因則在誘導表現2天後，mRNA都增加約12倍，4天後增加約13倍。結果顯示：利用Flp-In T-Rex誘導系統所建立的SCA17細胞模式，在誘導表現 2~4天後，可表現TBP-Q36/61/79的mRNA，且倍數約為15倍。為了得知誘導式SCA17細胞模式之TBP-Qn-HA蛋白質誘導表現情形，將TBP-Q36/61/79-HA細胞於誘導2天後，利用西方轉漬法，以TBP 抗體偵測TBP-Qn-HA及內生性TBP蛋白表現，並以β-actin為蛋白質量的控制組，其結果如圖三所示。由圖可知：TBP抗體辨識到分子量約在43 kDa的蛋白，為細胞內生性的TBP蛋白，符合實際蛋白分子量大小。而經誘導表現2天的細胞株，TBP-Q36/61/79蛋白才會表現。因外源性基因後面相連HA-tag，所以能辨別TBP-Q36外源與內生性蛋白大小的差異。Vector為轉入空載體的對照組，因此僅有內生性的TBP蛋白被抗體所辨識。以上結果顯示：本篇研究所建立的誘導式SCA17細胞模式可穩定誘導表現TBP-Q36/61/79蛋白。長 Q 會導致不正確的蛋白質摺疊，並堆積於細胞內，因此進行 TBP-Qn-HA 蛋白聚集的觀察。Vector、TBP-Q36、TBP-Q61 和 TBP-Q79 細胞於誘導 4 天後，以 1C2 抗體結合並接上含綠色螢光的 Alexa Fluor 488 (Invitrogen)二級抗體，隨後用 DAPI 進行細胞核染色，以便使用螢光顯微鏡觀察細胞內 TBP-Q36/61/79 的蛋白聚集情形。由圖四可見： 25.

(36) 誘導 4 天後，vector 與 TBP-Q36 蛋白於細胞內表現呈均勻分散，無蛋白聚集產生。而 TBP-Q61 與 TBP-Q79 細胞內則可發現有少數細胞出現些微蛋白聚集的情形，但大部分細胞仍呈現均勻分散狀況。為了瞭解誘導式 SCA17 細胞模式的細胞週期表現情形，利用流式細胞儀分析 TBP-Qn 的細胞週期。Vector、TBP-Q36 和 TBP-Q61 細胞於誘導 1 天、去血清處理 1 天後進行 PI 螢光染色，並分析細胞週期。如圖五所示：(A)為細胞週期波峰圖，在含 10%血清的情況下，Vector、 TBP-Q36 和 TBP-Q61 的 sub G1%分別為 0.54、0.30、7.97，而缺血清處理 24 小時後，則分別為 4.41、5.09、10.07；(B)為細胞週期的量化圖，由圖中可發現：在做缺血清處理後 TBP-Qn 的 sub G1%都有提升的情形，而無論是否做缺血清處理，TBP-Q61 均呈現較高的 sub G1% (* P < 0.05)。二、SCA17 細胞模式之氧化壓力指標表現細胞在氧化壓力下，活性氧分子的表現量會提升。藉由 DHE 和 DCF 螢光偵測來觀察 ROS 的表現，可得知細胞是否真的面臨氧化壓力。 DHE 在正常情況下發藍光(Ex/Em = 355 nm/420 nm)，可與細胞質結合，而當細胞處於氧化壓力時，會產生許多活性氧分子，ROS 便會氧化 DHE 使之脫氫成 ethidium 與細胞核中的 DNA 結合，發紅螢. 26.

(37) 光(Ex/Em = 518 nm/605 nm)，利用這種因氧化而造成吸光值改變的特性，就可以來偵測細胞中 ROS 的表現量。 DCF 的發光原理與 DHE 類似。DCFH-DA 本身不會發螢光，可以自由穿過細胞膜。進入細胞內後，DCFH-DA 被胞內的酯酶水解生成 DCFH，而 DCFH 不能通透細胞膜，所以染劑就會停留在細胞內。當活性氧分子出現時會將 DCFH 氧化成發螢光的 DCF，因此，檢測 DCF 螢光就可以知道細胞內活性氧表現情形。從圖六中可以發現：在加入 doxycycline 誘導基因表現時，61Q 和 79Q，都有 ROS 表現量增加的情形。此外，以 doxycycline 誘導 24 小時，再做缺血清及氧化劑 TBH 處理 1 天後，可在 61Q、79Q 看見顯著高於 Vec、36Q 的 ROS 表現，而圖六(B)中，79Q 與 61Q 相較下，又有更高的 ROS 表現量(P < 0.05)。這張圖的結果暗示：在誘發長 Q 基因表現後，細胞中 ROS 將明顯增加，使細胞面臨氧化壓力的威脅。三、誘導式 SCA17 細胞模式之敏感性及耐受性測試 TBP-Qn-HA 細胞經 1 μg/ml doxycycline 誘導 24 小時，再處理 50 nM STS 24 小時，並以 Hoechst 33342/PI 雙螢光染色來觀察誘導式 SCA17 細胞株對藥物的敏感性。藍色為 Hoechst 33342 所染的所有細胞，紅色為 PI 所染的死細胞，由圖七可見：(A)在 50 nM STS 處理下，. 27.

(38) 無論 doxycycline 誘導與否，TBPQn-HA 之死細胞均有增加的情形，而 TBP-Q61 和 TBP-Q79 細胞株更於 doxycycline 誘導後有更多 PI 所染上的死細胞，且以 TBP-Q79 死亡的情形最為嚴重；(B)為(A) 的量化結果(* P < 0.05)。 TBP-Qn-HA 細胞經 1 μg/ml doxycycline 誘導 24 小時，再以 100 nM STS 或缺血清處理 24 小時，並以 Trypan Blue 染色來觀察誘導式 SCA17 細胞株對藥物的敏感性及對缺血清的耐受性。由圖八可見：(A) 在 100 nM STS 處理下，無論 doxycycline 誘導與否，TBPQn-HA 的存活率均有下降的情形，而 TBP-Q61 和 TBP-Q79 細胞株更於 doxycycline 誘導後有顯著降低的死亡率，且以 TBP-Q79 存活率最低；同樣在(B) 中也可以看見：在缺血清處理下，無論 doxycycline 誘導與否， TBPQn-HA 的存活率均有下降的情形，而 TBP-Q61 和 TBP-Q79 細胞株更於 doxycycline 誘導後有顯著降低的死亡率，同時 TBP-Q79 亦有存活率最低的結果(* P < 0.05)。四、過度表現 HSPs 對短暫表現 SCA17 細胞模式之影響在誘導式 SCA17 細胞模式的相關實驗中只能看見 TBP-Q61 和 TBP-Q79 少數細胞中些微的蛋白聚集，為了有更顯著的細胞模式來探討 polyQ 蛋白在細胞中形成的情形及藉助改善蛋白的聚集來達到研究疾病治療之目的，而進行短暫表現 SCA17 細胞模式的實驗，並共. 28.

(39) 轉入 HSPA5、HSPA8 或 HSPB1 觀察是否可達到減少毒性蛋白聚集的結果。pEF-TBP-Qn-IRES/hrGFP 重組質體 DNA 限制酵素圖譜切割確認結果如圖九所示：(A)為 pEF-TBP-Qn-IRES/hrGFP 重組質體構築的示意圖，利用限制酵素 NotI 及 SmaI 切位，將包含 36~79Q 的 TBP cDNA 接進 pEF-IRES/hrGFP 載體中(李麗卿, 2009)；(B)為以限制酵素 EcoRI 切割 pEF-TBP-Qn-IRES/hrGFP 重組質體，並進行 0.8%瓊脂膠體電泳的圖譜結果，Lane M 為 1 kb ladder 的大小標記。以 EcoRI 可切出 pEF 載體(約 7 kb)及 TBP-Qn，圖譜的結果正確無誤。 HSPA5、HSPA8 及 HSPB1 重組質體 DNA 限制酵素圖譜切割確認結果則如圖十所示：(A)為限制酵素 NotI、PvuII 和 AseI 在 HSPs 序列及 pcDNA3 載體上的切位示意圖；(B)為以限制酵素切割 HSPs 重組質體，並進行 0.8%瓊脂膠體電泳的圖譜結果，Lane M 為 1 kb ladder 的大小標記。以 NotI 可切出 pcDNA3 載體(5446 bp)以及 HSPA5 (2222 bp)、HSPA8(2038 bp)、HSPB1(764 bp)的插入序列，並用 PvuII 確認所插入的為正接序列，AseI 則用來確認載體圖譜，結果圖譜正確無誤。圖十一至圖十三為 pEF-TBP-Qn-IRES/hrGFP 重組質體 DNA 共轉染 HSPs 48 小時後的結果，並利用 DAPI 核染劑(藍)、1C2 抗體-Cy5 (紅) 和 IRES/hrGFP (綠)，以螢光顯微鏡觀察細胞中 TBP-Q 蛋白的表現位置與情形。三張圖的(A)皆顯示：轉入 TBP-Qn 時，TBP-Q61 及 TBP-Q79 29.

(40) 可發現細胞出現蛋白聚集的情形，而 TBP-Q36 有些微但幾乎看不見的蛋白聚集，control 則無任何聚集物可見；在共轉入 HSPA5、HSPA8 和 HSPB1 後，皆能顯著改善 TBP-Q61 及 TBP-Q79 蛋白聚集的情形。量化以後發現：三張(B)的 TBP-Q61 及 TBP-Q79 蛋白聚集的情形的確可以經由共轉染 HSPA5、HSPA8 和 HSPB1 而改善聚集物的產生(P < 0.05)，但在未轉入 HSPs 時，卻無法看到 TBP-Q79 有較 TBP-Q61 嚴重的蛋白聚集結果。. 30.

(41) 伍、討論. ㄧ、誘導式 SCA17 細胞模式之建立 SCA17 是一種因 polyQ 擴增所造成的疾病，常見的病理學特徵為：突變蛋白所構成的包涵體，這種包涵體位於細胞核中，會造成神經細胞的毒性，讓神經元的功能缺失，進而使細胞死亡(DiFiglia et al., 1997)。為了觀察 SCA17 CAG 的擴增是否會導致包內蛋白質的聚集，並降低細胞存活率，所以構築了全長 TBP-Q36/61/79-HA 重組質體，並將這些重組質體轉入 293 細胞中，藉此建立穩定表現 polyQ 的細胞株。由圖二和圖三的 mRNA 及蛋白表現結果，可得知全長 TBP-Q36/61/79-HA 融合蛋白表現的正確性及誘導表現之穩定性，這表示本篇研究成功建立全長 TBP-Q36/61/79-HA 誘導式的細胞株。此外，圖四的細胞螢光觀察，可以看到全長 TBP-Q61/79-HA 融合蛋白表現於胞內，並有些許細胞有融合蛋白聚集的情形，這在許多 polyQ 疾病研究中均有發現(Perez et al., 1998)；而 TBP-Q36 及 vector 則無任何蛋白質聚集的情形發生。因此推測：於全長 TBP-Q61/79-HA 細胞內表現的聚集融合蛋白，可能為擴增 polyQ 蛋白不正常摺疊所造成。而可能因細胞生理狀態或誘導時間長短的關係，在此細胞模式中無法看見擴增 polyQ 蛋白的細胞均呈現聚集的現象。雖然無法得到大. 31.

(42) 量蛋白聚集的結果，但正常 SCA17 早期病程進展本就為帶有 polyQ 突變的 TBP 蛋白開始聚集，與本細胞模式的蛋白聚集現象頗為貼近，值得進行相關研究。有研究指出：SCA3 和 SCA7 中，polyQ 的擴增會引起 caspases 3 的活化(Chou et al., 2006; Wang et al., 2006)，而 caspase 3 的活化是細胞走向凋亡途徑中訊息傳遞的末站。由本篇研究圖五中的細胞週期表現可以看出：TBP-Q61 的 sub G1%提升至 8%，與 vector (0.5%)及 TBP-Q36 (0.3%)相較之下高出許多，這表示此 polyQ 細胞株與前述 SCA3 和 SCA7 中的研究結果相同，SCA17 polyQ 的擴增也會引起細胞走向凋亡途徑。而 caspase 3 的活化情形，則在本實驗室於 2009 年由 Lee et al.所發表的研究結果中可以看到(Lee et al., 2009)。二、SCA17 細胞模式之氧化壓力指標表現 HepG2 細胞株的缺血清處理會導致細胞中大量 ROS 的累積 (Kang et al., 2003)，而 TBH 為氧化劑的一種，以 TBH 處理 PC-12 細胞株會導致細胞中 ROS 的表現量增加(Pias and Aw, 2002)。本研究圖六中 61Q 與 79Q 於基因誘導表現後有大量 ROS 表現量的增加，而圖六(B)中 79Q 相較於 61Q 又有更高的 ROS 表現量，這與 polyQ 擴增會直接誘發 ROS 的產生(Wyttenbach et al., 2002)有關。活性氧分子的主要型態包括：超氧化物陰離子(superoxide anion,. 32.

(43) O2 -)、氫氧自由基(hydroxyl radical, OH )、過氧化氫(H2O2) (Galli et al., ‧. ‧. 2005)。在得知以 doxycycline 誘導 polyQ 基因表現可使細胞 ROS 表現量提升後，誘導式 SCA17 細胞模式的細胞株將可用於研究 SCA17 疾病與氧化壓力的關係，並有利於改善氧化壓力的進一步研究，以便有效減緩 SCA17 的疾病進程或對疾病進行治療。三、誘導式 SCA17 細胞模式之敏感性及耐受性圖七及圖八(A)中顯示：當處理 STS 時，全長 TBP-Q61/79-HA 細胞株細胞存活率明顯降低，這表示：細胞表現全長 TBP-Q61/79-HA 時，對於 STS 較為敏感，而本篇的研究結果與 HD polyQ 擴增疾病的研究結果相同 (Cooper et al., 1998) ，說明帶有 polyQ 擴增的全長 TBP-Q61/79-HA 蛋白的表現，會影響細胞正常生理功能，因此在誘發細胞凋亡的藥物處理後，更易使細胞死亡率提高。此外，TBP-Q79 較 Q61 有較低的細胞存活率，而在 SCA2 polyQ 擴增長度的研究中可以發現，Q 越長對細胞的毒性相對較高(Ng et al., 2007)，這說明了 TBP-Q79 較高的死亡率。有研究指出：處理神經生長因子(NGF)之 PC12 細胞株在低濃度血清的生長環境下，74Q 相對於 23Q 有較低的存活率(Wyttenbach et al., 2001)。而圖八(B)中，61Q 和 79Q 在缺血清處理下，與 36Q 及 Vec 相較下，的確有較高的死亡率。其中，79Q 相對於 61Q 有更低的細. 33.

(44) 胞存活率，這可能與 Q 越長對細胞的毒性相對較高(Ng et al., 2007)有關。綜合以上論點可推測：不正常擴增的 polyQ，會影響到細胞對藥物處理(如：STS)的敏感性及對缺血清耐受性，且 Q 的長度與細胞毒性成正相關。此外，本篇研究所建立的誘導式 SCA17 細胞模式可用來針對藥物篩檢及 polyQ 擴增長度對疾病進展的影響做更深入的研究。四、過度表現 HSPs 對短暫表現 SCA17 細胞模式之影響圖九及圖十為共轉入 293T 細胞的 polyQ 和 HSPs 的重組質體 DNA 限制酵素圖譜切割結果，從電泳圖中可以看到，本研究中短暫表現 SCA17 細胞模式所使用的重組質體 DNA 為正確無誤的。在轉入 polyQ 時，圖十一至圖十三都顯示，TBP-Q61/79 會引起胞內蛋白質的不正常堆積並聚集，但在共轉入 HSPA5、HSPA8 和 HSPB1 皆能改善聚集的現象。 HSPA5 又稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein，簡稱 BiP)，或稱葡萄糖調控蛋白 78 (78 kDa glucose-regulated protein，簡稱 GRP78)，與內質網中蛋白質的摺疊和聚集有關，而共轉染 HSPA5 進 SCA17 細胞模式的研究證實：HSPA5 確實可以減少細胞中不正常蛋白聚集的情形(Lee et al., 2009)，這和本. 34.

(45) 篇研究結果相符(圖十一)。此外，HSPA8 又稱為熱休克同原蛋白 70 (heat shock cognate protein 70，簡稱 HSC70)，在正常細胞中持續表現，擔任監護並幫助其他蛋白摺疊、組裝及運送的工作(Hartl and Hayer-Hartl, 2002)，過度表現 HSPA8 能降低高溫壓力下的細胞死亡率(Belay and Brown, 2006)。而 SCA17 細胞中不正常蛋白的堆積對細胞具毒性，會造成細胞的死亡，本研究利用共轉入 HSPA8 進短暫表現 SCA17 細胞模式的方式(圖十二)證明：過度表現 HSPA8 可以減少不正常蛋白的聚集。有研究指出：過度表現 Hsp27 能夠對 polyQ 疾病模式的研究具保護作用(Friedman et al., 2007; Wyttenbach et al., 2002; Wen et al., 2003; Tsai et al., 2005)，這可能是由於不正常 TBP 的過度表現會降低 TFIIB 與 HSPB1 啟動子結合的能力所致。本篇研究圖十三中可發現：過度表現 HSPB1 能夠挽救異常 polyQ 蛋白聚集的形成，與前述已發表的論文研究結果相同。這些結果一再暗示：SCA17 細胞模式中蛋白質正確摺疊的能力受損，而透過 HSPs 的過度表現，可以改善此情形，減少不正常蛋白聚集的情況。此短暫表現 SCA17 細胞模式的研究方法，為快速、方便得到大量蛋白異常聚集的研究模式，適合用於 SCA17 疾病治療的探討。. 35.

(46) 陸、參考文獻. 李麗卿(2009)。第十七型脊髓小腦共濟失調症致病機轉：伴隨蛋白的保護功能與 TATA 結合蛋白 CAG 三核苷重複擴增造成不正常蛋白質折疊之研究。國立台灣師範大學生命科學系九十七學年度博士論文。 Albers DS, Beal MF (2000) Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in aging and neurodegenerative disease. J Neural Transm Suppl 59:133-154. Alonso I, Costa C, Gomes A, Ferro A, Seixas AI, Silva S, Cruz VT, Coutinho P, Sequeiros J, Silveira I (2005) A novel H101Q mutation causes PKCgamma loss in spinocerebellar ataxia type 14. J Hum Genet 50:523-529. Anttonen AK, Mahjneh I, Hamalainen RH, Lagier-Tourenne C, Kopra O, Waris L, Anttonen M, Joensuu T, Kalimo H, Paetau A, Tranebjaerg L, Chaigne D, Koenig M, Eeg-Olofsson O, Udd B, Somer M, Somer H, Lehesjoki AE (2005) The gene disrupted in Marinesco-Sjogren syndrome encodes SIL1, an HSPA5 cochaperone. Nat Genet 37:1309-1311. Bauer P, Laccone F, Rolfs A, Wullner U, Bosch S, Peters H, Liebscher S, Scheible. M,. Epplen. JT,. Weber. BHF,. Holinski-Feder. E,. Weirich-Schwaiger H, Morris-Rosendahl DJ, Andrich J, Riess O (2004) Trinucleotide repeat expansion in SCA17/TBP in white patients with Huntington's disease-like phenotype. J Med Genet 36.

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