U / kg body weight

（

（

（15））））胰島素耐受測試胰島素耐受測試胰島素耐受測試胰島素耐受測試 Insulin Tolerance Test (ITT)

藥品配製 藥品配製 藥品配製 藥品配製：：：：

藥品藥品藥品藥品 最終濃度最終濃度最終濃度最終濃度

Human insulin (Actrapid ^○R HM) 100 U / mL 0.1( mU / µL)

劑量給予劑量給予 劑量給予劑量給予

0.75 U / kg body weight

方法 方法 方法 方法：：：：

採血前不需禁食採血前不需禁食採血前不需禁食採血前不需禁食，，，於採血前一天秤量體重並計算每隻大鼠給予劑量，於採血前一天秤量體重並計算每隻大鼠給予劑量於採血前一天秤量體重並計算每隻大鼠給予劑量，於採血前一天秤量體重並計算每隻大鼠給予劑量，，，先採集先採集先採集先採集 0 分鐘血液

分鐘血液 分鐘血液

分鐘血液，，，，腹腔注射胰島素後腹腔注射胰島素後腹腔注射胰島素後，腹腔注射胰島素後，，，再採集再採集再採集 5、再採集 、、、10、、、、30、、、、60 分鐘之血液分鐘之血液分鐘之血液，分鐘之血液，，隨後，隨後隨後隨後 24hr 內用內用內用內用 市售試劑組測量各時間點血清葡萄糖濃度值

市售試劑組測量各時間點血清葡萄糖濃度值 市售試劑組測量各時間點血清葡萄糖濃度值 市售試劑組測量各時間點血清葡萄糖濃度值。。。。

（

（

（

（16））））禁食血清胰島素含量測定禁食血清胰島素含量測定禁食血清胰島素含量測定禁食血清胰島素含量測定

原理 原理 原理 原理

此 分 析 是 利 用 定 量 的 三 明 治 酵 素 免 疫 分 析 技 術此 分 析 是 利 用 定 量 的 三 明 治 酵 素 免 疫 分 析 技 術此 分 析 是 利 用 定 量 的 三 明 治 酵 素 免 疫 分 析 技 術此 分 析 是 利 用 定 量 的 三 明 治 酵 素 免 疫 分 析 技 術 (Sandwich enzyme immunoassay)。。。。將專一性的將專一性的將專一性的 Monoclonal mouse anti-rat insulin antibodies 事先塗在將專一性的 事先塗在事先塗在事先塗在 Microplate 上上上上，，，當，當當 Standards、當 、、、Blank 和和和和 Samples 注入注入注入注入 well 中中中中，，，，Mouse insulin 會和會和會和會和 Immobilized antibody 結合結合結合，結合，，，洗去沒有結合的物質洗去沒有結合的物質洗去沒有結合的物質，洗去沒有結合的物質，，，再加入對再加入對再加入對 Mouse 專一性的再加入對 專一性的專一性的專一性的 biotinylated polyclonal antibodies 到到到 Well 中到 中中中，，，接著，接著接著接著 wash 第二次第二次第二次第二次，，，，再加入再加入再加入再加入 horseradish peroxidase ，，，， 接 著 洗 去 移 除 掉 未 結 合 的接 著 洗 去 移 除 掉 未 結 合 的接 著 洗 去 移 除 掉 未 結 合 的接 著 洗 去 移 除 掉 未 結 合 的 enzyme conjugates ，，，， 再 加 入 受 質 溶 液再 加 入 受 質 溶 液再 加 入 受 質 溶 液再 加 入 受 質 溶 液

(Substrate solution) 到到到到 Well 中中中中反應呈色反應呈色反應呈色反應呈色。。。。酵素反應後酵素反應後酵素反應後酵素反應後，，，加入強酸終止反應，加入強酸終止反應加入強酸終止反應，加入強酸終止反應，，，讀取其讀取其讀取其讀取其

加入加入

（（

Western Chemiluminescent HRP Substrate（（（Amersham Biosciences, USA）（ ））偵測細）偵測細偵測細偵測細 胞質與細胞核的分子量

胞質與細胞核的分子量 胞質與細胞核的分子量 胞質與細胞核的分子量。。。。

（

（

（

（20））））脂肪組織切片脂肪組織切片脂肪組織切片脂肪組織切片

委託中興大學動物疾病診斷中心幫忙脂肪組織切片 委託中興大學動物疾病診斷中心幫忙脂肪組織切片 委託中興大學動物疾病診斷中心幫忙脂肪組織切片 委託中興大學動物疾病診斷中心幫忙脂肪組織切片。。。。

脂肪細胞計數 脂肪細胞計數 脂肪細胞計數 脂肪細胞計數

每組隨機選取每組隨機選取每組隨機選取每組隨機選取 3 隻已浸泡於固定液中的大鼠隻已浸泡於固定液中的大鼠隻已浸泡於固定液中的大鼠 RE 做為檢體隻已浸泡於固定液中的大鼠 做為檢體做為檢體，做為檢體，，每個檢體製作，每個檢體製作每個檢體製作 5 片每個檢體製作 片片片 切片切片

切片切片，，，用顯微鏡，用顯微鏡用顯微鏡用顯微鏡（（（（Olympus））））放大放大放大放大 100 倍觀察切片倍觀察切片倍觀察切片倍觀察切片，，，，以照相機以照相機以照相機以照相機（（（（Diagnostic））））將所得將所得將所得將所得 影像拍攝下來

影像拍攝下來 影像拍攝下來

影像拍攝下來，，，，再利用影像處再利用影像處再利用影像處再利用影像處理系統理系統理系統理系統（（（（Spot advanced））））在每個切片上圈選在每個切片上圈選在每個切片上圈選 3 個不同在每個切片上圈選 個不同個不同個不同 區塊區塊

區塊區塊，，，，計數細胞數目計數細胞數目計數細胞數目計數細胞數目。。。。

脂肪細胞平均直徑計算 脂肪細胞平均直徑計算 脂肪細胞平均直徑計算 脂肪細胞平均直徑計算

平均細胞面積平均細胞面積平均細胞面積平均細胞面積(µm²) = 選取面積選取面積選取面積選取面積 (µm² )/ 細胞數目細胞數目細胞數目細胞數目

直徑 直徑

直徑直徑(µm)= 【【【【√(平均細胞面積平均細胞面積平均細胞面積平均細胞面積/3.14)】】】】×2

（（ diluent 與與與與 Detection antibody 混勻而得混勻而得混勻而得混勻而得 biotinylated goat anti-mouse leptin。。。。Tween 20 加入

加入 加入

加入 PBS 製備成製備成製備成製備成 Wash buffer。。。 Color reagent A (含。 含含含 Hydrogen peroxide)和和和 B 和 (Tetramethylbenzidine)以等體積的比例混合均勻即得以等體積的比例混合均勻即得以等體積的比例混合均勻即得 Substrate solution。以等體積的比例混合均勻即得 。。。

加入加入加入加入 100 µL 的的的的 Standard 或或或或 Sample 加入到每一個加入到每一個加入到每一個加入到每一個 Well 中中中中（（（（已已已已 coating 好好好好 Goat

buffer 清洗清洗清洗 5 次清洗 次次次。。。。加入加入加入加入 100 µL 的的的的 Substrate solution 到每一個到每一個到每一個到每一個 well 中中中中，，，，貼上新的膠貼上新的膠貼上新的膠貼上新的膠 膜於室溫下避光反應

膜於室溫下避光反應 膜於室溫下避光反應

膜於室溫下避光反應 20 分鐘分鐘分鐘分鐘。。。。加入加入加入加入 50 µL 的的的的 Stop solution(含含含 sulfuric acid)到每一個含 到每一個到每一個到每一個 well 中中中，中，，慢慢地輕拍，慢慢地輕拍慢慢地輕拍 plate 確定混合均勻慢慢地輕拍 確定混合均勻確定混合均勻確定混合均勻(或放在或放在或放在或放在 Microplate vortex 上混勻上混勻上混勻上混勻)。。。。測量測量測量測量 450 nm 之吸光值之吸光值之吸光值之吸光值(波長校正設定波長校正設定波長校正設定 540 nm 或波長校正設定 或或或 570 nm)，，，以標準曲線來換算，以標準曲線來換算以標準曲線來換算以標準曲線來換算 Sample 內內內內 TNF-α 濃度濃度濃度濃度。。。。

（

（

（

（22））））大鼠血壓測定大鼠血壓測定大鼠血壓測定大鼠血壓測定

利用血壓機 利用血壓機 利用血壓機

利用血壓機（（（BP 200 ; Risitech Systems, Apex, NC, USA）（ ）））測量大鼠尾巴動脈測量大鼠尾巴動脈測量大鼠尾巴動脈測量大鼠尾巴動脈，，，， 紀錄尾巴血壓

紀錄尾巴血壓 紀錄尾巴血壓 紀錄尾巴血壓。。。 。

（

（

（

（23））））統計分析統計分析統計分析統計分析

實驗結果以 實驗結果以 實驗結果以

實驗結果以 mean ± SD 表示表示表示表示，，，，利用利用利用利用 Student’s t test 或或或或 Duncan’s multiple range test 比較組間差異比較組間差異比較組間差異。比較組間差異。。。所有數據通過常態分佈檢定所有數據通過常態分佈檢定所有數據通過常態分佈檢定所有數據通過常態分佈檢定，，，，若非常態則轉為對數值若非常態則轉為對數值若非常態則轉為對數值若非常態則轉為對數值。。。統計分。統計分統計分統計分 析以析以

析以析以 SAS (version 9.0, SAS institute, Cary, NC)套裝軟體進行套裝軟體進行套裝軟體進行，套裝軟體進行，，，當當當 p < 0.05 是為顯著當 是為顯著是為顯著是為顯著 差異差異

差異差異。。。。