3: ∆∆∆∆ rcsB 4: ∆∆∆∆ kvhA 5: ∆∆∆∆ fur 6: ∆∆∆∆ soxRS 7: ∆∆∆∆ pecS
8: ∆∆∆∆ pecM 9: ∆∆∆∆ mrkI 10: ∆∆∆∆ hdeB 11: ∆∆∆∆ hdeD 12: ∆∆∆∆ hdeB1 13: ∆∆∆∆ rpoS
圖十九：
圖十九：
圖十九：
圖十九：YfdX 表現量受到表現量受到表現量受到表現量受到 rcsB 以及以及以及 kvhA 影響以及 影響影響 影響
不同基因剔除菌株在 pH 5.0 LB 培養液靜置培養 24 小時後，使用超音波破 碎法取得全細胞溶液，以膠體電泳分離蛋白質後，透過西方點墨法偵測。上 圖為 YfdX 抗體，下圖為標誌抗體(甘油醛 3-磷酸脫氫酶抗體)。
A B C D A B C D A B C D
A: ∆∆∆∆ yfdX, supernatant C: ∆∆∆∆ yfdX + pRK415-yfdX, supernatant B: ∆∆∆∆ yfdX, pellet D: ∆∆∆∆ yfdX + pRK415-yfdX, pellet
KDa 70 55 45 35 -25 –
15 –
10
-pH 7 pH 5 pH 3
圖二十：圖二十：
圖二十：圖二十：YfdX 體內伴隨蛋白活性試驗顯示出微弱伴隨蛋白活性體內伴隨蛋白活性試驗顯示出微弱伴隨蛋白活性體內伴隨蛋白活性試驗顯示出微弱伴隨蛋白活性體內伴隨蛋白活性試驗顯示出微弱伴隨蛋白活性
酸鹼值 3 時，含有 YfdX 之膜間質蛋白存在較多可溶蛋白質，位於 45 KDa 之未知蛋白質保護效果最為顯著。細胞隔夜培養後，抽取膜間質蛋白質，以 鹽酸調整溶液酸鹼值至 pH 7、pH 5 或 pH 3 反應 15 分鐘後，以高速離心分 離蛋白質沉澱與上清液，呈現於膠體電泳。
(A) M 1 2 3 4 5 6 AB
M: marker
AB: Anti-YfdX antibodies 1: ∆∆∆∆yfdX, loading
2: ∆∆∆∆yfdX + pRK415-yfdX, loading 3: ∆∆∆∆yfdX, wash
4: ∆∆∆∆yfdX + pRK415-yfdX, wash 5: ∆∆∆∆yfdX, elution
6: ∆∆∆∆yfdX+ pRK415-yfdX, elution
70 -55
AB: Anti-YfdX antibodies 1: ∆∆∆∆yfdX, loading
2: ∆∆∆∆yfdX + pRK415-yfdX, loading 3: ∆∆∆∆yfdX, wash
4: ∆∆∆∆yfdX + pRK415-yfdX, wash 5: ∆∆∆∆yfdX, elution
6: ∆∆∆∆yfdX+ pRK415-yfdX, elution
圖二十一：免疫共沉澱實驗顯示
45
RcsF
RcsB
Mild acid Static culture
RcsC RcsD
p RcsB KvhA
KvhS
p KvhA
hdeB hdeD yfdX
hdeB1
附錄一附錄一
附錄一附錄一：預測：預測：預測：預測 YfdX 具有訊息胜肽具有訊息胜肽具有訊息胜肽具有訊息胜肽
使用生物資訊工具 SignalP 4.0 預測 YfdX 蛋白質具備訊息胜肽
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。顯示 YfdX 序列 1-22 胺基酸極可能 為訊息胜肽。
Time (h)
0 2 4 6 8 10
OD 600
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
WT kvhA rcsB yfdX
附錄二：附錄二：
附錄二：附錄二：yfdX 基因缺損對細菌在基因缺損對細菌在基因缺損對細菌在基因缺損對細菌在 5%膽鹽下的生長沒有影響膽鹽下的生長沒有影響膽鹽下的生長沒有影響 膽鹽下的生長沒有影響
細菌在隔夜培養後，加入稀釋至含有 5%膽鹽之 LB 培養液後，使其 OD 600 約為 0.15，置於 37℃培養，並在不同的時間點測量其吸光值(OD 600 )。
附錄三：
附錄三：
附錄三：
附錄三：yfdX 基因缺損不影響鐵載體基因缺損不影響鐵載體基因缺損不影響鐵載體基因缺損不影響鐵載體(siderophore)的分泌的分泌的分泌 的分泌
細菌在 LB 培養液隔夜培養後，取 10 ul 滴至 CAS 培養基，並置於 37℃培養 12 小時。
1 2 3 4 5 6 7 8
1: WT 2: ∆∆∆∆ rcsB 3: ∆∆∆∆ kvhA 4: ∆∆∆∆ yfdX 5: ∆∆∆∆ fur 6: ∆∆∆∆ phoP 7: ∆∆∆∆ rpoS 8: ∆∆∆∆ ompA
(B) (A)
24hr 12hr
附錄附錄
附錄附錄四四四四：：：：yfdX 基因缺損不影響離胺酸脫梭脢的功能基因缺損不影響離胺酸脫梭脢的功能基因缺損不影響離胺酸脫梭脢的功能基因缺損不影響離胺酸脫梭脢的功能
細菌隔夜培養後，取 20 µl 菌液至離胺酸脫梭脢培養液培養 12 或 24 個小 時，觀察顏色變化。培養 12 時時溶液顏色變黃，顯示酸鹼值降低；24 小時 時溶液變藍，顯示離胺酸脫梭脢正常作用使溶液酸鹼值回復。