C3=AD:CIA2 X BD:HAP5c
A1=AD:HAP5a
A2=AD:HAP5b
A3=AD:HAP5c
PC=positive control
35
圖四、CIA2 蛋白間交互作用檢測結果
CIA2 蛋白間交互作用檢測組別，分別於 YPD（左上）、營養缺失外加10 mM 3-AT 之篩選性培養基（中上）和 β-galactosidae 檢測（右上）之實驗結果。下圖 代表培養基上不同實驗組別之位置，組別1 為可表現 BD:CIA2 雜合蛋白之酵母 菌，組別2 為可同時表現 AD:CIA2 與 BD:CIA2 雜合蛋白的酵母菌，而組別 PC 為正控制組，其所使用酵母菌可同時表現AD:SV40 large T-antigen 與 BD:p53 雜 合蛋白。
36
B-galactosidase relative activity unit
0 1 2 3 4 5
β-gal relative activity unit
圖五、HAP5a 與不同 CIA2 片段檢測組別之 β-gal 定量
HAP5a 與不同長度的 CIA2 片段之交互作用檢測組別，其組別配合如圖左 所示，灰色格子表示欲檢測之CIA2 的 N、M 或 C 片段(片段資訊可參考表三說 明)。以具篩選力培養基培養，提供 ONPG 為受質，進行三重複，測量 β-gal 相 對活性單位，並以CIA2 全長與 HAP5a 的組別當基準 1，計算各檢測組別比值之 平均值及標準差，並繪製成條狀圖。
AD X BD N M C
M C N HAP5a
C N M C
M C N
C
HAP5a
Relative β-gal activity
37
B-galactosidase relative unit
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
β-gal relative activity unit
圖六、HAP5b 與不同 CIA2 片段檢測組別之 β-gal 定量
HAP5b 與不同長度的 CIA2 片段之交互作用檢測組別，其組別配合如圖左 所示，灰色格子表示欲檢測之CIA2 的 N、M 或 C 片段(片段資訊可參考表三說 明)。以具篩選力培養基培養，提供 ONPG 為受質，進行三重複，測量 β-gal 相 對活性單位，並以CIA2 全長與 HAP5b 的組別當基準 1，計算各檢測組別比值之 平均值及標準差，並繪製成條狀圖。
AD X BD N M C
M C N HAP5b
C N M C
M C N
C
HAP5b
Relative β-gal activity
38
B-galactosidase relative activity
0 1 2 3 4 5
β-gal relative activity unit
圖七、HAP5c 與不同 CIA2 片段檢測組別之 β-gal 定量
HAP5c 與不同長度的 CIA2 片段之交互作用檢測組別，其組別配合如圖左 所示，灰色格子表示欲檢測之CIA2 的 N、M 或 C 片段(片段資訊可參考表三說 明)。以具篩選力培養基培養，提供 ONPG 為受質，進行三重複，測量 β-gal 相 對活性單位，並以CIA2 全長與 HAP5c 的組別當基準 1，計算各檢測組別比值之 平均值及標準差，並繪製成條狀圖。
AD X BD N M C
M C N HAP5c
C N M C
M C N
C
HAP5c
Relative β-gal activity
39
1 60
ATCIL (1) ---MSSCAYSFELEMMKSPPSNN---TPS-PSSTIS---ETNS ATCIA2 (1) -MSACLSSGGGGAAAYSFELEKVKSPPPSSS---TTTTRATS-PSSTIS---ESSN OS1 (1) MSSSCIPTG---LRLDLDIVKAATSPG-AHSSPLRPAHSS--PSSTLS-EASNTSSS OS2 (1) MSSSCIPTG---LRLDLDIVKAATSPG-AHSSPLRPAHSS--PSSTLS-EASNTSSS ZM1 (1) MSSSCIPTG---LRLDLDMVKAAASPVGAHSSPLRPAHYSS-PSSTLSSEASNASSS ZM2 (1) MSSSCIPTG---LRLDLDMVKAAASPVGAHSSPLRPAHYSS-PSSTLSSEASNASSS ZM3 (1) MSSSCIPTG---LRLDLDMVKAAASPVGAHSSPLRPAHYSS-PSSTLSSEASNASSS OS3 (1) MASSCIPTG---LRLDLEMVKAAAPPG----GSSAAAHSS--ASSTLS-EASNSSSS MC (1) -MSSCFSGT--GGRTIGLDLDIVKSSPPCSW---SRTSQTSSSPSSTIS---ESSN PT1 (1) MSSPCISG---GGRTYGFDLEIVKS-SSTSS---TRTSHTSS-PSSTIS---ESSN PT3 (1) MSSPCISG---GGRTYGFDLEIVKS-SSTSS---TRTSHTSS-PSSTIS---ESSN RC (1) MSSPCLSG---GGRAYGFDLEIVKS-PS-TS---TRTSHTSS-PSSTLS---ESSN VV1 (1) -MSSCLSG---AGRTYGFELEIVKX-PSSTS---PRTSHSSS-PSSTIS---ESSN VV2 (1) -MSSCLSG---AGRTYGFELEIVKS-PSSTS---PRTSHSSS-PSSTIS---ESSN PP (1) ---MAGGGGIKGAVNNNVATAMAIAGRDSRACDVCGLHRARWYCSVDNAHLCRR Consensus (1) MSSSCI GG L DLEIVKA S R AHSSS PSSTIS ESS
61 120 ATCIL (34) PPFSISTRRPRTPRKRPNQTYDEAAALLSTAYPKIFSSKKAKTQIFGTNKS---PLS ATCIA2 (49) SPLAISTRKPRTQRKRPNQTYNEAATLLSTAYPNIFSSNLSSKQKTHSSSNSHFYGPLLS OS1 (51) SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVKKSPKTASRPPTRQLSGLSAVF OS2 (51) SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVKKSPKTASRPPTRQLSGLSAVF ZM1 (54) SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVNKSPKTAP-PRPPQLSVLAAAL ZM2 (54) SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVNKSPKTAP-PRPPQLSVLAAAL ZM3 (54) SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVNKSPKTAP-PRPPQLSVLAAAL OS3 (48) SVASLSLKRARTPRKRPNQTYNEAAALLASMYPSVFPVIKGAGTAP-PRLLGLATALADD MC (48) SPLAIYTTKPRTPRKRPNQTYNEAATLLNTAYPNLFSNPNLKTNPNHNNNKSTKL--EKA PT1 (46) SPLAISTRKSRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKHLTKSSKFTKPQDNSL--LLD PT3 (46) SPLAISTRKSRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKHLTKSSKFTKPQDNSL--LLD RC (45) SPLAISTRKPRTHRKRPNQIYNEAAALLSTAYPNIFSTTNPR---KFTKPHQDTL--LLD VV1 (45) SPIAISTRKXRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKNLKNPCKFTKSHDS----FLE VV2 (45) SPIAISTRKPRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKNLKNPCKFTKSHDS----FLE PP (52) CDQNVHSANALALHHERVRLDLQGNALHTPRKALKGNTSAPQNSLKSAAQMDHAAPSRKS Consensus (61) SP AISTRKARTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYP IFST KTA K S L
40
葡萄(VV)和陶立宛蘚(PP)。各分枝根部顯示數字為進行 1000 次 bootstrap 所得之 可信值。其分枝長度比例依照演化親緣距離繪製，其比例尺如左下所示。
41
(A)
(B)
圖十、HAP 及 CIA2 之突變株外表型比較
(A)各單基因突變株在 HAP3a、HAP3b、HAP5a、HAP5b、HAP5c 及 CIA2 上的 突變位置示意圖。以黑色實心方格表示exon，線段表示 intron。倒三角形為 T-DNA insertion，標有 SALK 編號。下箭頭顯示 cia2 突變株(30-2)中點突變之位置。
(B)野生形及各突變株之 12 天大的植株。30-2 葉片顏色偏淺，而其他突變株之顏
SALK_111422 ATG
Promoter
WT 30-2 SALK_109993
SALK_105064 SALK_080334 SALK_111422
42
附圖一、阿拉伯芥HAP2、HAP3 及 HAP5 蛋白之親緣關係樹(取自 Sifer et al., 2009)
使用MEGA4 軟體，以 neighbor-joining 方法，將 HAP2 (NF-YA family)、HAP3 (NF-YB family)及 HAP5 (NF-YC family)之胺基酸比對分析並繪製之親緣關係 圖。各分枝根部顯示數字為進行2000 次 bootstrap 所得之可信值。其分枝長度比 例依照演化親緣距離繪製，其比例尺如左下所示。