CIA2與HAP蛋白之交互作用

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(1)第一章、研究背景 1.1 細胞核基因與葉綠體發育之關聯性真核生物細胞除了最外層的細胞膜外，細胞內部亦含有許多被膜包圍的胞器。每一類胞器內部皆含有不同蛋白質，以執行不同功能。大部份蛋白質在細胞質合成，因此蛋白質被製造後，細胞必需有一套辨識及傳送蛋白質至正確之胞器的系統，此蛋白才能在適當的胞器正常地行使功能。在植物細胞中，葉綠體是進行光合作用重要的胞器，光合作用所製造的碳水化合物，除了提供植物本身生長所需外，也是人類食物主要來源。因此了解葉綠體發育和功能是很重要的研究方向。根據演化的內共生理論(endosymbiotic theory)，葉綠體存在於植物細胞中是起源於藍綠菌(cyanobacteria)經由胞吞作用(endocytosis)移至寄主細胞質中。然而高等植物的演化過程中，超過百分之九十的藍綠菌基因已經被轉送到植物寄主的細胞核內。而且這些細胞核基因的產物，必須被準確地送回葉綠體內，葉綠體才能維持正常的發育和代謝(Martin et al., 2002)。因此，葉綠體雖然具有自己的基因組，但葉綠體內所包含約 3000 種蛋白中，大約只有 100 種蛋白質是葉綠體基因組所編碼而成，大部分葉綠體所需的蛋白質仍需由細胞核基因轉錄，於細胞質中合成蛋白質後，再送入葉綠體中(Leister, 2003)。. 1.2 葉綠體轉運蛋白這些由細胞核基因經轉錄轉譯而來的葉綠體先驅蛋白質(chloroplastic precursor protein)，除了少數葉綠體外膜蛋白外，通常在胺基端含有一段轉運引導訊息之肽鏈(transit peptide)。當先驅蛋白被送到葉綠體表面時，訊息引子會被轉運蛋白(translocon)所辨認並藉由轉運機組的作用，先驅蛋白就會通過葉綠體的外膜及內膜而進到葉綠體基質內(Jarvis, 2008)。之後，胺基端的轉運引導訊息肽鏈會被酵素切除，進而形成分子量較小的成熟蛋白質。藉由交聯(cross-linking).

(2) 以及共免疫沉澱(coimmune precipitation)等方法，許多葉綠體轉運蛋白機組之成員蛋白被鑑定出來，在葉綠體外膜的轉運蛋白機組成員統稱為 Toc (translocon at the outer membrane of chloroplast)，內膜之轉運蛋白機組成員統稱為 Tic (translocon at the inner membrane of chloroplast)(Schnell et al., 1997)。. 1.3 CIA2 影響葉綠體蛋白之運輸前人以阿拉伯芥為材料，基因轉殖技術為策略，利用 EMS 致突變劑及抗藥性篩選法，篩選蛋白質輸入葉綠體相關機制發生缺失的突變株。經由此種技術找到ㄧ個與蛋白質輸入葉綠體有關的轉錄因子，其基因命名為 CIA2 (chloroplast import apparatus 2)(Sun et al., 2001)。 CIA2 經轉錄轉譯後，形成長度為 435 個胺基酸之多肽鏈。然而在 cia2 突變株中，由於 CIA2 基因發生點突變，導致轉譯過程中會提早遇到終止密碼，而產生不完整的 CIA2 蛋白。研究顯示，cia2 突變株葉子顏色較野生型偏淺綠色，其葉綠素 a 和 b 的總含量大約為野生型植物的 50%(Sun et al., 2009)；但與同時期野生型植株比較，cia2 突變株植株的葉與根在生長發育上，形狀與大小與野生型相似。另外，葉綠體蛋白輸入實驗顯示，cia2 突變株中蛋白質輸入葉綠體的效率較低(Sun et al., 2001; Sun et al., 2009)。由此可知，CIA2 與葉綠體蛋白質輸送過程有關，並可能影響葉綠素的累積。. 1.4 CIA2 為可調控 Toc33 和 Toc75 的基因表現之轉錄因子比對 CIA2 胺基酸序列，發現其 C 端具有 CCT motif (CONSTANS , CONSTANS-like , and TOC1)。CCT motif 具有細胞核定位訊息(nuclear localization signal)及蛋白質間交互作用(protein interaction)等功能，是植物中 CCT-class 轉錄因子特有的序列。以洋蔥表皮細胞為材料，利用 GUS 報導基因偵測 CIA2 蛋白之作用位置在細胞核中，所以 CIA2 於細胞核中極可能扮演轉錄因子角色(Sun et. 1.

(3) al., 2001)。利用 RT-PCR 比較 cia2 突變株與野生型植株葉子中的 Toc33 及 Toc75 的 RNA 表現量，可以發現野生型植株葉片中 Toc33 及 Toc75 的含量為 cia2 突變株的兩到三倍；且再將 CIA2 基因送回突變株的互補實驗(complementary experiment)中， Toc33 及 Toc75 的轉錄量則能回復至和野生型相當(Sun et al., 2001)。利用染色質免疫沉澱法(ChIP, chromatin immuneprecipitation)實驗，抽取表現 c-myc:CIA2 蛋白之轉殖株的 DNA，並以抗 c-myc 抗體做免疫沉澱，再利用 PCR 檢測 CIA2 結合之 DNA 片段，其結果證實 CIA2 可結合在 Toc33 和 Toc75 的啟動子序列(Sun et al., 2009)。Toc33 與其同源蛋白 Toc34 扮演葉綠體蛋白受體的角色，而 Toc75 為葉綠體上的外膜通道，因此正確的蛋白質辨識及運輸過程需要 Toc33 及 Toc75 的參與(Wallas et al., 2003)。以上結果顯示 CIA2 藉由調節轉運蛋白機組成員 Toc33 及 Toc75 之基因表現，進而調控葉綠體輸入蛋白質的效能，在蛋白質進入葉綠體的過程中扮演重要角色。. 1.5 HAP 蛋白複合體 HAP (Heme activation protein)蛋白複合體首度在酵母菌中被報導為一種轉錄因子，可調控合成鐵質的相關基因(Olesen et al., 1987)。之後陸續發現哺乳類動物、真菌、細菌以及植物等物種皆具有同源之 HAP 蛋白複合體，且調控的下游基因種類繁多，包括呼吸作用之酵素基因、細胞分裂相關基因和生長發育相關基因等(Li et al., 1992)。HAP 蛋白複合體之組成包括 HAP2、HAP3 與 HAP5 三種次單元，在哺乳動物中可找到其同源蛋白，分別為 CBF-B (CCAAT binding factor，或稱 NF-YA [nucleus factor])、CBF-A (或稱 NF-YB)與 CBF-C (或稱 NF-YC)(Olesen and Guarente, 1990)。HAP3 和 HAP5 會在細胞質中結合成 dimer，並進入細胞核中與 HAP2 結合形成完整的 HAP 複合體後，再結合至 CCAAT 序列上，也因此 HAP 又稱為 nucleus factor (NF)或是 CCAAT binding factor (CBF)。從不同物種的. 2.

(4) HAP 胺基酸序列比對中，可以發現每個次單元序列非常保守，其保守部份通常和 DNA 結合或是與其他蛋白質的交互作用有關。植物的 HAP2、HAP3 及 HAP5 是由一群基因家族所編碼，因此植物中的 HAP 複合體可能有多種組合方式，使基因調控更多元(Siefers et al., 2009)。而 HAP 複合體在植物中的確影響許多層面，如植物胚胎發育(Kwong et al., 2003)、根瘤之增生調控(Combier et al., 2008)、缺水逆境反應(Nelson et al., 2007)和開花調控 (Wenkel et al., 2006)等。HAP 不同次單元的基因表現具有組織專一性(Siefers et al., 2009)，此說明 HAP 對於植物基因調控是很重要的。. 1.6 CCT-class 蛋白與 HAP 蛋白的交互作用目前發現在阿拉伯芥中，CCT-class 蛋白成員涉及光週期開花調控(Putterill et al., 1995)、概日韻律(circadian rhythms)之調控(Salome et al., 2006)、光傳遞訊息 (Zobell et al., 2005)和調節糖合成相關基因表現(Masaki et al., 2005)等過程。而在其他開花植物物種，CCT-class 蛋白亦參與水稻或小麥光周期調控開花的機制中 (Yano et al., 2000) ;(Turner et al., 2005)，或大麥的春化作用(Yan et al., 2004)。其中 CONSTANS (CO)是最被廣為研究的。長日照下，CO 可累積至一定的量，進而活化花發育的相關基因，如 FT ( flowering locus T )等。日前有報導指出 CO 可與 HAP 蛋白複合體結合，並影響阿拉伯芥長日照光照週期之開花調控(Wenkel et al., 2006)。在 CO 的 CCT motif 與 HAP2 蛋白家族 C 端序列具有高度同源性，且從酵母菌雙雜交(yeast two-hybrid, Y2H)和免疫共沉澱的實驗證實 CO 可取代 HAP2 與 HAP3/HAP5 結合，形成較大的轉錄蛋白複合體，進而影響開花的調控。另外在 HAP3 雙突變株 nf-yb2/ nf-yb3 之開花時間與 co 突變株相同，有明顯延遲的現象(Kumimoto et al., 2008)；而過度表現 NF-YB2 會使開花時間提早(Chen et al., 2007)。以上證據皆說明 CO 可能與 HAP2 競爭與 HAP3/HAP5 結合的位置，而 HAP3/HAP5 提供 CO 與下游基因結合的平台，可活化光週期調控開花之相關基. 3.

(5) 因進而影響開花。 1.7 研究動機與目的 CIA2 與 CO 的 CCT motif 有高度的相似度，推測 CIA2 的 CCT motif 能和 HAP 蛋白複合體交互作用，並在下游基因啟動子上結合進行轉錄調控。因此本研究以阿拉伯芥 CIA2 為主題，比對分析 HAP2 與 CIA2 的 CCT motif 之同源性，並利用基因選殖及 Y2H 系統探討 CIA2 全長及不同大小片段和 HAP 蛋白質間的交互作用方式。. 4.

(6) 第二章、材料與方法 1. CIA2 和 HAP 基因選殖 1-1. 植物材料 (1) 消毒與種植阿拉伯芥種子取阿拉伯芥哥倫比亞(Col-0)種子(10 mg 約 500 顆)置於微量離心管，以 70 % 酒精消毒 10 分鐘後，吸除酒精。加入含 0.5 % Tween20 的 1.5 %漂白水(Clorox, Oakland, CA, USA)消毒 10 分鐘，吸除漂白水，再以無菌水清洗種子三次並吸除無菌水。將消毒好的種子置於 4°C 春化 2 至 3 天。經消毒及春化的種子置於無菌操作台內，以無菌水清洗 3 次後，加入 0.1 % agar 充分懸浮種子，再將種子均勻分佈在 MS 培養基(1X Murashige and Skoog salt mixture, Gamborg’s vitamin, 2 % sucrose. Murashige and Skoog, 1962)，以透氣膠帶封口，置於生長箱萌芽生長。 (2) 生長條件以日夜恆溫 22°C，光照週期為長日照 16 小時光照 8 小時黑暗，培養 14 天。 1-2. 阿拉伯芥核醣核酸(RNA)之萃取使用 TRIzol RNA 萃取液(MD Bio)抽取 RNA。全程所用的溶液，皆以 1 % DEPC 處理過之無菌水(DEPC-treated H2O)配製。實驗步驟如下：（1）取約 2 克的樣本粉末加入 10 mL 之 TRIzol 萃取液中。（2）室溫下 5 分鐘。（3）加入氯仿 4 mL，激烈震盪 1 分鐘後，靜置室溫 5 分鐘。（4）在 4°C 下以 4K rpm 離心 20 分鐘並取其上清液，加入 5 mL 之 isopropyl alcohol。（5）在 4°C 下以 4K rpm 離心 20 分鐘。（6）除去上清液，留下沉澱物，再加入 10 mL 酒精清洗。（7）在 4°C 下以 4K rpm 離心 15 分鐘。（8）亁置沉澱物。 5.

(7) （9）以 50 μL DEPC-treated H2O 回溶。（10）以分光光度計和 1.5 %瓊酯膠體電泳分別檢驗 RNA 的濃度和品質。（11）置-80°C 冰箱儲存。 1-3. 阿拉伯芥 cDNA 之合成使用 Promega 公司的反轉錄酶(M-MLV reverse transcriptase)，並以 10 μg 的核醣核酸為模板進行合成 cDNA 反應，其流程參照廠商建議：（1）加入 1 μL 之 10 mM oligo-( dT )15 至 10 μg 核醣核酸。（2）置 70°C 水浴 5 分鐘後，置冰浴 5 分鐘。（3）加入下列藥品： M-MLV RT 5X buffer ( Promega ). 5.0 μL. dNTP(10 mM ). 1.0 μL. M-MLV reverse transcriptase ( H- ). 1.0 μL. 最後加 DEPC-treated H2O 至總體積 25 μL。（4）置 42°C 處理 1 小時。（5）置 70°C 處理 15 分。（6）於-20°C 保存。 1-4. 聚合酶連鎖反應（1）在 TAIR (The Arabidopsis Information Resource)下載 CIA2 和 HAP 基因家族之編碼序列，並在合適位置設計一組引子，包括 forward 引子和 reverse 引子。（2）加入下列藥品 cDNA. 0.8 μL. dNTP (10 mM ). 0.5 μL. 10X Taq buffer ( Violet ). 2.0 μL. reverse primer (10 mM ). 1.0 μL 6.

(8) forward primer ( 10 mM ). 1.0 μL. Taq (Violet) ( 2.5 unit / μL ). 0.2 μL. ddH2O. 14.5 μL. 總體積為 20 μL。. （3）PCR 設定如下： 95°C. 2 min. 95°C. 20 sec. Tm°C（視引子而定） 20 sec 72°C. 2 min. 72°C. 2 min. 25°C. 1 cycle. 25 cycles. 1 cycle. ∞. （4）取 2 μL 在 1.5 %瓊酯膠體進行電泳反應檢視實驗結果。 1-5. 基因選殖及定序將純化的 PCR 產物接黏至 pGEM-T vector（Promega）。接合反應與選殖步驟如下：（1）配置下列混合液： 2X ligation buffer. 5 μL. pGEM-T vector. 0.5 μL. PCR product. 2 μL. ligase ( Promega ). 0.5 μL. ddH2O. 2 μL. 總體積為 10 μL。（2）於室溫 3 小時或 14°C 砂浴至隔夜。（3）製備 LB 固體培養基，其中包含如下：. 7.

(9) 50 μg/mL 的抗生素 Amp、200 μg/mL 的 IPTG （isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid）和 20 μg/mL 的 X-Gal （5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）。（4）取 3 μL 接合產物加至 50 μL DH5α 的勝任細胞（Biotec）。（5）熱休克 42°C 進行 45 秒。（6）塗抹 1/4 至 1/2 體積的菌液至 LB 固體培養基，置於 37°C 培養箱 16 小時。（7）選取在培養基呈現白色之菌種。（8）將含已選殖基因片段之菌種送至定序服務實驗室進行定序。. 2. 酵母菌雙雜交（Y2H）系統 2-1. 建構 CIA2 與 HAP 基因表現質體（1）用適當限制酶切割欲建構之質體（pAS2-1 和 pACT2）和 DNA 片段(包括 CIA2 和 HAP 編碼序列)。其建構策略參照附圖一。（2）以 1.5 %的瓊酯膠體電泳反應檢驗限制酶切割反應的品質。（3）將切割產物以 T4 DNA ligase (Promega)黏合成環狀 DNA，其反應配製所需溶液和酵素參照廠商建議。 2-2. 勝任細胞之製備以 YPD 培養液培養 CG1945 酵母菌株作為轉型勝任細胞，其製備過程參照標準流程(Guthrie and Fink, 1991)，其步驟如下：（1）取酵母菌 CG1945 (含有質體 pVA3-1)的單一菌落種於 2 mL SD/-Trp 培養液中，以 230~250 rpm 搖速於 30℃培養箱培養，培養酵母菌成長至飽和。（2）取 50 μL 飽和酵母菌至 50 mL 新的 SD/-Trp 培養液中，以 230~250 rpm 搖速於 30℃培養箱培養 12~16 小時。（3）測量菌液 OD600 值，若達到 0.4~0.6，表示酵母菌生長已達對數期(log 8.

(10) phase)，可準備製作勝任細胞。（4）室溫下以 1000 xg 離心 5 分鐘後，倒掉上清液。（5）加入 25 mL 滅菌過二次水使細胞懸浮，並激烈震盪 1 分鐘。（6）室溫下以 1000 xg 離心 5 分鐘後，倒掉大部分上清液，再離心 1 分鐘，用微量吸取器吸取剩餘的上清液。（7）以 1.5 mL 新鮮配置的 1X TE/LiOAc 懸浮菌液，至此勝任細胞製作完成。 2-3. 酵母菌轉型將單股 salmon sperm DNA 與欲轉型之質體混合，依序加入勝任細胞及 PEG/LiOAc 溶液，以熱休克方式將質體轉型進入酵母菌中。其轉型過程參照標準流程(Rosenberg, 1991)，其步驟如下：（1）準備 10 mL PEG/LiOAc 溶液。（2）將攜帶 DNA 加熱 95℃ 5 分鐘後，迅速插至冰上 2~3 分鐘，使攜帶 DNA 變性（denatured）。（3）於 1.5 mL 微量離心管依序混合下列藥劑： pTD1-1 質體或 pACT2 質體. 500 ng. 已變性的攜帶 DNA. 0.5 mg. 含 pVA3-1 質體的 CG1945 勝任細胞. 100 μL. PEG/LiOAc 溶液. 600 μL. （4）. 激烈震盪 1 分鐘使藥劑混勻後，以 230~250 rpm 搖速於 30℃培養箱培. 養 30 分鐘。（5）. 加入 70 μL DMSO，翻轉微量管數次使之均勻混合後，置於 42℃水浴. 槽中 20 分鐘，進行熱休克反應。（6）置於冰上 1~2 分鐘。（7）室溫下以 14000 rpm 離心 5 秒後，去除上清液，並以 0.5 mL 新鮮配置的 1X TE 懸浮細胞。. 9.

(11) （8）取 100 μL 菌液分別塗佈在 YPD、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu 及 SD/-Trp/-Leu/-His 之培養基上。（9）於 30℃培養箱培養。 2-4. 以營養缺失培養基及 β-galactosidase (β-gal)活性測試方法篩選蛋白質之交互作用（1）將欲測試蛋白其所屬之建構載體，經轉型作用送至酵母菌中，並塗布於缺少 Trp、Leu 或 His 胺基酸的培養基上，置於 30°C 培養箱生長 4~5 天。（2）若有菌落生長於此營養缺失的培養基上，將此菌落轉印至濾紙上，以液態氮急速冷凍並迅速回溫。（3）置於含 X-gal 的 Z buffer (1 mM Na2HPO4，1 mM NaH2PO4，10 mM KCl，0.344 mg/mL X-gal)中黑暗下反應 30 分鐘，檢視是否可與 X-gal 形成藍色複合物，若有藍色出現，表示兩蛋白質間有交互作用。 2-5. β-gal 活性分析利用 lacZ 為 Y2H 中蛋白質交互作用之報導基因，藉由 lacZ 基因表現 β-gal，分解 ONPG ( O-Nitrophenyl β-D - Galactopyranoside) 對蛋白質交互作用之定量。其定量過程參照標準流程(Rosenberg, 1991)，步驟如下所述：（1）. 取含有欲測試之質體的酵母菌 CG1945 的單一菌落種於 2 mL. SD/-Trp/-Leu/-His 培養液中，以 230~250 rpm 搖速於 30℃培養箱培養，隔夜培養酵母菌成長至飽和。（2）. 取隔夜培養菌液 1 mL 加入 4 mL YPD 中，於 30℃培養 4~6 小時至對. 數生長期中期 (OD600=0.6~0.8)。（3）. 紀錄 OD600，取 500 μL 菌液，室溫下以 14000 rpm 離心 30 秒後，去. 除上清液，並以 0.5 mL Z buffer 懸浮細胞。（4）. 室溫下以 14000 rpm 離心 30 秒後，去除上清液，加入 100 μL 的 Z. buffer 懸浮細胞，另設置等體積之空白液。. 10.

(12) （5）. 以液態氮急速冷卻 1 分鐘後，置於 30℃水浴槽中 1 分鐘。. （6）. 加入 400 μL 含 0.27 % (v/v) β-mercaptoethanol 的 Z buffer 於反應管和. 空白液。（7）. 加入 160 μL 4 mg/mL ONPG 溶液並開始計時，待顏色轉為黃色後加. 入 0.2 mL 的 1 M Na2CO3 終止反應，並紀錄反應時間。（8）. 室溫下以 14000 rpm 離心 10 分鐘後，測量並紀錄 OD420。. （9）. 相對活性計算公式：. β-gal 相對活性單位 = 1000 × OD420 / T × V × OD600 T：反應時間(分)，V：反應體積 (mL)。. 3. 親緣分析及其他生物資訊軟體從 TAIR 或 National Center for Biotechnology Information (NCBI(Altschul and Lipman, 1990)搜尋作為分析比對 CIA2 及同源蛋白、阿拉伯芥與酵母菌 HAP2 之胺基酸序列，並將序列輸入 MEGA4 軟體(Tamura et al., 2007)，進行比對分析以及繪製成親緣關係樹。本研究利用 ClustalX 軟體(Thompson et al., 2002)完成序列比對分析；並以 Neighbor-joining 以及 bootstrap 方法繪製親緣關係樹(Hall and Salipante, 2007)。此外，將 CIA2 全長序列輸入 Scansite 2.0 軟體(Obenauer et al., 2003a)，進行 protein domain 及特定磷酸化位點之預測。. 11.

(13) 第三章、結果 3-1. 阿拉伯芥之 HAP 基因家族從 TAIR 和 ArabTFDB (Arabidopsis Transcription Factor DataBase)資料庫中搜尋並整理阿拉伯芥中 HAP 基因家族成員，另外參考 Siefers 等(2009)的阿拉伯芥 HAP 家族成員命名，將 HAP2、HAP3 及 HAP5 三類基因家族成員的基因編碼 (accession number)和 AGI (Arabidopsis Genome Initiative)編號統整於表二。表中可發現 HAP 蛋白複合體每個單元體，皆是由一群基因所負責編碼而成；目前經序列同源比對推測或被研究報導指出，HAP2 基因家族有 10 個，HAP3 基因家族有 13 個，HAP5 有 13 個。. 3-2. CIA2 的 CCT-motif 和 HAP2 蛋白成員之 DNA 結合區域有較高的保守度 HAP2 包含兩個重要功能的 domain：HAP3/HAP5 交互作用 domain 以及 DNA 結合 domain，而兩者以一段 linker 相連(Xing et al., 1994)。HAP2 這兩個 domain 在植物和其他真核生物中高度保守，顯示在各物種間，HAP2 的蛋白質交互作用以及 DNA 結合的功能極為重要(Siefers et al., 2009)。前人研究發現 CO 中的 CCT-motif 之胺基酸序列亦與 HAP2 成員有高度保守性。 Y2H 實驗證實 CO 能取代 HAP2 的角色，與 HAP3 和 HAP5 成員交互作用，形成 CO/HAP3/ HAP5 複合體調控 FT，進而促進植物進入開花期(Wenkel et al., 2006)。因此從 CIA2 之 CCT-motif 與 HAP2 胺基酸序列比對著手是必要的。利用Vector NTI 10軟體，將十個阿拉伯芥HAP2成員胺基酸序列(NF-YA1~ 10)、酵母菌的HAP2胺基酸序列與CIA2的CCT motif序列進行比對分析(圖二)。發現八處保守胺基酸，在CIA2 CCT motif之相對位置分別為：R395、R408、A412、 R415、R417、G420、R421和F422 (如圖二「*」號標示)。其中CIA2的R395對應於所有HAP2成員的「HAP3/ HAP5蛋白交互作用區域」(其與HAP3及HAP5蛋白的結合有關)。在酵母菌的HAP2點突變分析中，鑑定出R178G的置換(用▲表示，. 12.

(14) 相當於CIA2中R395的位置)，會嚴重影響HAP複合體的形成，及其DNA結合能力 (Xing et al., 1994)。此結果說明CIA2的CCT-motif可能會與HAP3或HAP5有交互作用，形成CIA2/HAP3/ HAP5蛋白複合體，此推論需以Y2H方法證實，其結果參照下節。在圖二比對結果中，阿拉伯芥十個HAP2成員之「DNA binding序列」與CIA2 的 CCT motif序列有七處保守胺基酸，在CIA2的CCT motif之相對位置為R408至 F422。在其他CCT-class蛋白之CCT motif點突變分析中，TOC1及CO的Ala (Strayer et al., 2000)、Ppd-H1( Photoperiod-H1)的Gly (Turner et al., 2005)、CO和VRN2 (Vernalization 2)的Arg (Yan et al., 2004)，這三個CCT motif上的胺基酸被報導與 DNA結合功能有關，而這三個胺基酸在CIA2的CCT motif上的相對位置分別為 A412、G420和R421 (圖二中以▲表示)。此結果說明CIA2 CCT motif可能參與DNA 結合過程。以上證據顯示CIA2的CCT motif與HAP2 DNA結合區域呈現高度保守，且其保守胺基酸與CCT-motif行使蛋白間交互作用以及DNA結合可能有關。. 3-3. 在酵母菌中 HAP5a、HAP5b、HAP5c 與 CIA2 有蛋白質間交互作用為進一步測試 CIA2 是否和 HAP2 相同，可與 HAP3/5 蛋白交互作用，參考 Wenkel 等人(2006)報導，CO 可和 HAP3a (AT2G38880)、HAP3b (AT5G47640)、 HAP5a (AT3G48590)、HAP5b (AT1G56170)以及 HAP5c (AT1G08970)有交互作用，因此利用 PCR 技術增殖的此五個 HAP 以及 CIA2 (AT5G57180)的解碼序列片段，所使用之引子序列整理如表一。以含有合成胺基酸相關基因為篩選標誌之質體 pAS2-1 和 pACT2 為基礎，構築表現 HAP 蛋白或 CIA2 與 Gal4 binding domain 或 activation domain 雜合蛋白之質體，依序轉形進入 CG1945 品系酵母菌，用合適的營養基篩選，並利用 β-gal 檢測以確認蛋白質間之交互作用，其質體構築策略可參考圖一。結果顯示本研究檢測之五種 HAP 成員蛋白質中，兩個 HAP3 家族成員與. 13.

(15) CIA2 無法在缺少 Trp、Leu 及 His 外加 10 mM 3-AT 的培養基生長，且無法活化 lacZ 的表現（表三），說明 HAP3a 及 HAP3b 在酵母菌中無法與 CIA2 有交互作用。為了方便說明，今以「AD:X × BD:Y」的形式表示，在 Y2H 中檢測 X 和 Y 的蛋白質交互作用，實驗中所構築兩類載體；可表現 Gal4 activation domain :X 之雜合蛋白，以及 Gal4 binding domain :Y 之雜合蛋白。在 HAP5 的三個成員與 CIA2 全蛋白交互作用檢測結果中，「AD:HAP5 × BD:CIA2 全長」及「AD:CIA2 全長 × BD:HAP5」結果顯示可在有篩選能力之培養基生長，且可與 X-gal 形成藍色複合物(表三及圖三)；但是在對照組「AD:無序列 × BD:CIA2 全長」卻發現有交互作用(表四)，推測 CIA2 全長可能與 AD 有交互作用，才使得 negative control 為陽性結果。但對照組「AD:CIA2 全長 × BD:無序列」無交互作用，因此「AD:CIA2 全長 × BD:HAP5」結果仍可證實 CIA2 在酵母菌中可和 HAP5 三個成員有交互作用。綜合以上，HAP5a、HAP5b 和 HAP5c 與 CIA2 之間在酵母菌中有交互作用，可推測 HAP5 與 CIA2 可構成轉錄蛋白複合體，幫助活化特定之下游基因表現；在其他報導中發現，共免疫沉澱實驗結果顯示 CO 或 COL15 可與 HAP5 此三個成員有交互作用(Wenkel et al., 2006)。此報導結果可與我們 HAP5 與 CIA2 存在蛋白質間交互作用的實驗結果相佐證，說明 CCT motif 蛋白質可與 HAP5 形成轉錄因子複合物活化下游基因。然而在同樣報導中，CO 和 COL15 可與 HAP3a 和 HAP3b 兩個成員有交互作用，但 CIA2 並不能在酵母菌中與 HAP3a 和 HAP3b 結合，表示阿拉伯芥中 CIA2 有可能和其他 HAP3 成員結合，這也說明 HAP 成員與不同轉錄因子形成多種不同組合，可增加植物體內基因調節多元性。 3-4. 在酵母菌中 CIA2 蛋白間有交互作用許多蛋白質可形成同聚合體，利用同種蛋白質間的交互作用，互相結合形成 dimer、trimer、tetramer 或其它數目的多元體，而形成多元體對於植物生理調控 14.

(16) 亦扮演重要的角色。利用 Y2H 方式將可表現 AD:CIA2 與 BD:CIA2 雜合蛋白之載體轉型至酵母菌中，並以合適的營養基篩選和 β-gal 檢測，結果顯示 CIA2 間交互作用的檢測組別之酵母菌可在營養缺失 Trp、Leu 及 His 外加 10 mM 3-AT 的培養基生長，且可與 X-gal 形成藍色複合物(表三及圖四)。這結果說明酵母菌中 CIA2 的蛋白質間有交互作用。. 3-5. CIA2 蛋白的 N 端區域或 CCT-motif 對於 CIA2/HAP5 之交互作用扮演重要的角色 CIA2 蛋白長度為 435 個胺基酸，從 Scansite (Obenauer et al., 2003b)蛋白質比對及預測常見 motif 之軟體可發現其 N 端區域序列可能有多個磷酸化修飾位點， C 端區域序列有顯著保守的 CCT motif，而中間區域有多個連續 lysine 胺基酸。因此將 CIA2 分成三個區域討論，從 N 端至 C 端依序為 N 片段(a.a.1-189)、M 片段(a.a.190-360)和 C 片段(a.a.361-435)。構築可表現 AD 或 BD 與不同組合之 CIA2 片段之雜合蛋白的載體，並以 Y2H 方法鑑定 CIA2 片段種類對於 HAP5 蛋白交互作用的重要性。另一方面，利用 ONPG 為受質，作 β-gal 的相對活性測試，並藉此定量蛋白質間結合之強弱程度。在結果中，N、M 和 C 代表 CIA2 的片段，並以「+」表示 CIA2 片段不同組合。「AD:CIA2(M+C) × BD:HAP5a」以及「AD:CIA2(C) × BD:HAP5a」為陽性 (表三)，同樣組別在 HAP5b 和 HAP5c 亦為如此。而「AD:CIA2(N) × BD:HAP5c」在 Y2H 中為陽性結果，但是同樣組別在 5a 及 5b 是陰性的。此結果指出 CIA2 的 CCT-motif 的存在能與 HAP5a、HAP5b 和 HAP5c 結合；且從 β-gal 的相對活性的定量結果中，可觀察到「AD:CIA2(C) × BD:HAP5a」為「AD:CIA2(N+M+C) × BD:HAP5a」的 3 倍(圖五)，同樣組別在 HAP5b 高達至 7 倍(圖六)，HAP5c 為 2.5 倍(圖七)。這方面的結果可推測 CIA2 之 CCT-motif 可和 HAP5 交互作用，而其 N 端序列可能會抑制 CCT-motif 與 HAP5 的結合。從序列比對結果(圖二)推測 CIA2 的 CCT motif 可能與 HAP3/ HAP5 交互作用有關，此推測可支持此項 Y2H 15.

(17) 的結果。然而，AD 與 BD 互換的組別的結果卻引導出完全不同的結論。「AD:HAP5a × BD:CIA2(N+M+C)」及「AD:HAP5a × BD:CIA2(N)」結果顯示為陽性，而「AD:HAP5a × BD:CIA2(C)」及「AD:HAP5a × BD:CIA2(M+C)」則為陰性結果(圖三及表三)，此情形在 HAP5b 和 HAP5c 亦為如此。定量結果中，「AD:HAP5a × BD:CIA2(C)」和「AD:HAP5a × BD:CIA2(M+C)」組別顯示極低的 β-gal 的相對活性，約為 BD:CIA2(N+M +C)的千分之一倍或是無活性，同樣的情形亦發生於 5b 及 5c (圖五至圖七)。這個結果說明 CIA2 的 N 端區域的存在下，對於 HAP5 蛋白的結合有正向效果，可能 CIA2 蛋白以 N 端區域與 HAP5 蛋白結合。但將 HAP2 序列與 CIA2 之 N 端序列利用 Vector NTI 10 比對分析，並未發現有顯著的保守性(此結果未展示)，無法支持 CIA2 之 N 端序列具有和 HAP2 相同的功能，與 HAP5 結合的結論。然而，CIA2 的 N 端區域有許多磷酸化修飾預測位點，而在植物體內有許多蛋白質可藉由磷酸化修飾改變蛋白質構形，進而影響蛋白質的作用，如光系統 II (PSII)、水通道蛋白(aquaporin)和光敏素(phytocrome)等(Su and Lagarias, 2007)。據此推測 CIA2 的 N 端區域磷酸化修飾可能調節 CIA2 與其他蛋白如 HAP5 的交互作用。為了釐清 AD/BD 互換組別的分歧結果，是否受到表現質體本身序列的影響，所以設計 Y2H 之對照組，並將結果統整於表四。結果可得到除了「AD:無序列 × BD:CIA2 全長」結果為有交互作用外，其他對照組結果皆為無交互作用。這說明造成 AD/BD 互換的組別的結果不同的原因，不是質體本身所造成，推測可能的原因解釋如下：(1) Gal4 的 AD 或 BD 會改變 HAP5 或是 CIA2 之 N 端的蛋白質結構，進而影響 CIA2 和 HAP5 的交互作用結果。 (2) CIA2 的 N 端與 HAP5 結合可能受到磷酸化(或是其他未知的調節機制)所調控，而實驗過程存在未知但影響磷酸化的變因，造成磷酸化或其他調控機制的結果有差異，進而影響 CIA2 與 HAP5 的結合能力有所不同。 (3) CIA2 之間的交互作用(圖四)可能和 N 端或 C. 16.

(18) 端有關，且影響到 HAP5 的交互作用。 (4)CIA2 的 N 片段可能有 activation 的功能，而 C 片段有 DNA binding 功能。不論原因為何，CIA2 和 HAP5a、5b 和 5c 的結合，其詳細機制須待其他 in vitro 實驗證實。. 3-6. 植物的 CIA2 同源蛋白之親緣分析許多訊息傳遞、基因調控、囊泡運輸以及蛋白降解等過程中，需要特定蛋白的結合才得以完成，因此蛋白質間交互作用對於細胞生理是重要的，且此蛋白功能可能保守於各種物種間。若在植物中 CIA2 與 HAP 蛋白間交互作用扮演重要的角色，其 CIA2 功能區域可能在各物種間呈現保守。以阿拉伯芥 CIA2 胺基酸序列在 NCBI 以及 TAIR 等資料庫比對搜尋阿拉伯芥以及存在於其他植物之 CIA2 可能同源蛋白，將 e 值小於 10-18 的序列下載並比對分析。搜尋找到 CIA2 在阿拉伯芥中同源蛋白 CIL，另可在葡萄、水稻、玉米、苜蓿、赤楊以及陶立宛蘚等植物中搜尋到可能之 CIA2 同源蛋白，經由 Vector NTI 10 比對分析後可發現其 N 端區域(第 1~120 個胺基酸)約有 61%的相似性(比對分析結果參照圖八)，而 C 端區域都可發現具有保守的 CCT motif。此比對結果透露出除了 C 端 CCT motif 外， CIA2 的 N 端處可能具有功能性之 motif，並廣泛存在於各種植物間的 CIA2 同源性蛋白。初步推測此植物中 CIA2 之 N 端區域與 CCT motif 具有重要的功能性，且可能和 HAP3/5 蛋白質交互作用有關。將各同源蛋白序列之「全長序列」或是「N 端區域序列」輸入 MEGA4 軟體，完成同源比對並繪製親緣關係樹，結果分別如圖九 A 和 B 顯示。在「全長序列」之親緣關係樹中(圖九 A)，可發現單子葉植物的玉米及水稻之同源蛋白歸為一群，且雙子葉植物之同源蛋白歸為另一群(除了苜蓿之外)，透露出 CIA2 蛋白功能性演化事件發生於單雙子葉植物分化之後。且不同科植物中，同物種的同源蛋白(如阿拉伯芥、水稻、玉米、赤楊等)歸類為一群，此說明 CIA2 蛋白功能性演化事件發生於物種分科之後。比較同物種不同 CIA2 同源蛋白間的距離，可發現. 17.

(19) 阿拉伯芥的 CIA2 和 CIL 距離較長，說明阿拉伯芥的 CIA2 和 CIL (CIA2-like)胺基酸序列差異較大，CIL 的相關研究極少，無法切確得知其功能，但從此結果可推測 CIL 蛋白可能和 CIA2 蛋白有不同的蛋白性功能。在「全長序列」親緣關係樹中，不論是雙子葉植物或是單子葉植物的物種間分支，其 bootstrap 值皆大於 70(圖九 A)。然而，以 CIA2 同源蛋白之胺基酸「N 端區域序列」以相同方法比對分析並繪製親緣關係樹(圖九 B)，雙子葉分群中，物種間分支的 bootstrap 值皆偏低，大部分低於 60；但單子葉分群中，物種間分支的 bootstrap 值皆大於 94。這些結果說明雙子葉植物物種間，依照 CIA2 同源蛋白的 N 端胺基酸序列差異無法做有效的分群，推測 CIA2 的 C 端序列(CCT motif) 極可能參與植物重要的生理功能，而在演化歷程中發生特定的功能改變。且隨著單雙子葉植物分化，單子葉植物之 CIA2 同源蛋白隨著演化過程，可能存在不同於雙子葉植物的蛋白結構及功能。. 18.

(20) 第四章、討論關於 HAP 蛋白複合體的研究大多以酵母菌或是哺乳動物為主，其調控層面廣泛，包括呼吸作用之酵素基因、細胞分裂相關基因、生長發育相關基因等(Li et al., 1992)。但在植物中，近十年才陸續被報導，並發現植物的 HAP 蛋白成員以基因家族的模式存在，是哺乳動物以及酵母菌中所沒有的。從 TAIR 和 ArabTFDB 資料庫及前人研究統整阿拉伯芥的 HAP 基因家族，目前已發現的基因家族成員數目，HAP2 為 10 個、HAP3 為 13 個、HAP5 為 13 個(表二)。在植物中，關於 HAP 的蛋白功能資訊並不多。從阿拉伯芥之根部、輪生葉、花的構造之各 HAP 基因成員的表現模式結果顯示，HAP 複合體有多種排列組合方式，可提高組織專一性表現調控的複雜度，達到精確的調控生理功能(Siefers et al., 2009)。 CCT-class 蛋白是植物中特有的轉錄因子，而植物中的 CO 和 COL 是調控光週期開花的 CCT-class 蛋白，且研究認為此類 CCT-class 蛋白可和 HAP 有交互作用。在阿拉伯芥中，已藉由共免疫沉澱實驗證實 CO 和 COL15 和 HAP3a、HAP3b 以及 HAP5a、HAP5b、HAP5c 有交互作用(Wenkel et al., 2006)；另外藉由 Y2H 實驗，證明番茄的 CO 與 COL1-5 蛋白可與 HAP3/HAP5 交互作用(Ben-Naim et al., 2006)。這些研究結果顯示植物體中具有 CCT-motif 的轉錄蛋白可能取代 HAP2 蛋白角色，和 HAP3/5 蛋白結合調控基因表現。在本研究中，首先將阿拉伯芥 CIA2 的 CCT domain 序列與 10 個 HAP2 成員比對分析，結果如圖二所示。在八處胺基酸保守位點中，CIA2 CCT domain 的 R395 胺基酸殘基對應於 HAP2 的 HAP3/HAP5 交互作用區域，而 CIA2 的 R408、A412、R415、R417、G420、R421 和 F422 對應於 HAP2 之 DNA 結合區域。在酵母菌 HAP2 蛋白突變分析中指出， CIA2 的 R395、A412、G420 和 R421 四個保守胺基酸為 HAP3/HAP5 蛋白交互作用或結合 DNA 功能所必要的胺基酸。此結果強烈暗示 CIA2 的 CCT-motif 可參與 HAP3/HAP5 蛋白結合或 DNA 結合，達到基因調控的目的。蛋白結構上，十個阿拉伯芥 HAP2 成員中，「HAP3/HAP5 interaction 19.

(21) domain-linker-DNA binding domain」多位於前 1/2~3/5 的位置，而 CIA2 的 CCT motif 位於 C 端，兩者雖有八個重要的胺基酸相同，但在蛋白質的相對位置不同，表示兩者的蛋白結構可能不同。CO 和 CIA2 兩種蛋白與 HAP2 成員保守位置皆多數位於 HAP2 的 DNA 結合區域，但酵母菌中 HAP2 蛋白的 DNA 結合區域， His 為行使 DNA 結合功能之必要胺基酸(Xing et al., 1994)，但在 CIA2 蛋白並未有明顯保守，所以在植物體內是否能在植物中形成 CO/HAP3/ HAP5 或 CIA2/HAP 3/HAP5 複合體仍需待證實。因此，CIA2 若與 HAP 形成複合體，CIA2 之 CCT-motif 可能扮演與 HAP3/HAP5 結合或是 DNA-binding domain 相似的功能。CIA2 可能取代 HAP2，形成 CIA2/HAP3/HAP5 複合體，但 Y2H 的結果並未顯示 CIA2 可和 HAP3a 或 HAP3b 有交互作用(表三)，可見 CIA2 可能和 HAP3 中的其他成員結合。另外利用 RNAi 的技術，將水稻中 HAP3 成員 OsHAP3A 基因表現 knockdown 後，發現葉綠素 a 和 b 總含量下降為野生型的 1/2 至 1/3 倍(Miyoshi et al., 2003)，其與 CIA2 突變株的表現形相符，所以 OsHAP3A 可能與 CIA2 有相同的下游基因，極可能在水稻中，OsHAP3A 可和 CIA2 同源蛋白結合。而親緣關係樹中可發現 OsHAP3A 與阿拉伯芥中的 NF-YB8 和 NF-YB10 關係最接近(Miyoshi et al., 2003)，且阿拉伯芥的 HAP3 中，NF-YB8 及 NF-YB10 之間的親緣關係極為相近(附圖一)，因此可推測 CIA2 可能和 NF-YB8 或是 NF-YB10 有交互作用。利用 Y2H 證實 CIA2 可和 HAP5a、HAP5b 及 HAP5c 有交互作用(圖三)，這說明 HAP5 可和 CIA2 結合形成複合體，推測可能調控 CIA2 下游基因例如 Toc33 及 Toc75 基因，但這需要共免疫沉澱實驗進一步證明。Sifer 等人 2009 之報導中， HAP5 蛋白質序列的親緣關係圖中 (附圖一的 NF-YC family)，HAP5a (即 NF-YC1)、HAP5b (NF-YC2)及 HAP5c(NF-YC9)雖演化距離不遠，但親緣關係並非很接近。可是以基因表現而言，RT-PCR 實驗中發現 CIA2 基因僅在葉、花及果實表現，在根不表現(Sun et al., 2001)，而有研究利用 GUS 報導基因檢測 HAP. 20.

(22) 基因成員的表現模式，發現 HAP5a:GUS 和 HAP5c:GUS 的轉殖株中，在根部不表現，但在營養葉和花等器官中表現明顯(Siefers et al., 2009)，此表現模式與 CIA2 類似。綜合以上，可推測在植物體中，CIA2 蛋白可能和 HAP5a 或 HAP5c 交互作用，形成轉錄因子複合體調控 Toc33 或 Toc75 等 CIA2 下游基因表現。比對 CIA2 以及 HAP 突變株的外表形(圖十)，可發現 CIA2 突變株葉片顏色較淺，此與其他 CIA2 報導結果相符(Sun et al.,2001)。但 HAP5a 和 HAP5b 的 T-DNA insertion 單突變株中，並無特殊的外表形出現，理論上若是 HAP5a 或 HAP5b 可與 CIA2 蛋白質結合，HAP5 或是 CIA2 的突變株應有共通的外表形。根據上述，推測 HAP5 與 CIA2 蛋白結合過程中，HAP5a 和 HAP5c 可能扮演功能交疊的角色。雖然目前關於植物 HAP5 成員的報導極少，但在其他報導中，可發現 HAP 成員間扮演功能相似重疊的角色：在 HAP3 與 CO 突變株研究中，單突變株 nf-yb2 或 nf-yb3 皆沒有顯著延遲開花的現象，必需在雙突變株 nf-yb2/ nf-yb3 才觀察到開花時間明顯延遲，此現象可說明在 CO/HAP3/HAP5 複合體中， HAP3 的兩成員 NF-YB2 和 NF-YB3 扮演相似的角色，在與 CO 結合過程中，功能上有互補之現象(Kumimoto et al., 2008)。綜合以上，推測 HAP5 與 CIA2 蛋白結合過程中，HAP5a 和 HAP5c 可能扮演功能交疊的角色。 HAP2(即 NF-YA)調控植物生裡的報導極少，目前發現阿拉伯芥的 NF-YA5 可參與於缺水逆境的反應(Nelson et al., 2007)，而苜蓿的 HAP2 會調控根瘤的發育(Combier et al., 2008)。將 CO 和 CIA2 的 CCT motif，以及十個阿拉伯芥 HAP2 成員蛋白質序列繪製親緣關係樹，可發現 CO 和 CIA2 歸為一群，且十個 HAP2 成員中，與 NF-YA1 及 NF-YA9 之演化距離最為接近。若 CIA2 在植物中可取代 HAP2 的角色，則觀察 NF-YA1 和 NF-YA9 突變株之外表形是否與 CIA2 突變株相符是個很好的突破點。目前 CIA2 蛋白功能性資訊尚有許多不明之處，但根據胺基酸序列特性以及軟體分析將 CIA2 分成三片段：N 片段(a.a.1-189，多處被預測磷酸化修飾)、M. 21.

(23) 片段(a.a.190-360，高 lysine 含量)和 C 片段(a.a.360-435，CCT-motif)。本研究建構 CIA2 不同片段組合及 HAP 5a、5b、5c 的表現載體，轉型至酵母菌 CG1945 中表現蛋白，以營養篩選和 β-gal 的定性及相對定量檢測蛋白質交互作用，定性結果整理於表三，定量結果如圖五至七所示。實驗發現「AD:HAP5 × BD:CIA2」與「AD:CIA2 × BD:HAP5」的結果不同。前者指出 CIA2 的 N 端序列與 HAP5 蛋白的結合有關，而後者卻指出 CCT-motif 與 HAP5 交互作用有關(圖五至圖七)。另外在不同綠色植物的 CIA2 同源蛋白比對分析發現 N 端序列和 CCT-motif 皆為高度保守(圖八)，這些證據顯示 N 端和 CCT-motif 有重要的蛋白功能，包括蛋白質交互作用。利用 Y2H 實驗證明蕃茄和阿拉伯芥的 CO 及 COL 的 CCT motif 可和 HAP 蛋白交互作用，此結果支持 CIA2 的 CCT-motif 與 HAP5 交互作用之結論，但從比對分析不同植物 CIA2 同源基因之 N 端胺基酸序列發現，CIA2 蛋白 N 端區域序列保守(圖八)，說明 N 端的蛋白功能性是不容否認，且可能藉由磷酸化修飾調節 CIA2 與 HAP5 蛋白結合能力。同時本研究藉由 Y2H 證實 CIA2 間的存在交互作用(圖四)，CIA2 間的交互作用亦可能影響 HAP5 的交互作用。可見 CIA2 可能存在複雜的蛋白調控機制。期待更多 CIA2 蛋白功能研究，能進一步了解 CIA2 調節葉綠體蛋白的輸送機制。. 22.

(24) 第五章、參考文獻 Altschul, S.F., and Lipman, D.J. (1990). Protein database searches for multiple alignments. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 5509-5513. Ben-Naim, O., Eshed, R., Parnis, A., Teper-Bamnolker, P., Shalit, A., Coupland, G., Samach, A., and Lifschitz, E. (2006). The CCAAT binding factor can mediate interactions between CONSTANS-like proteins and DNA. Plant J 46, 462-476. Chen, N.Z., Zhang, X.Q., Wei, P.C., Chen, Q.J., Ren, F., Chen, J., and Wang, X.C. (2007). AtHAP3b plays a crucial role in the regulation of flowering time in Arabidopsis during osmotic stress. J Biochem Mol Biol 40, 1083-1089. Combier, J.P., de Billy, F., Gamas, P., Niebel, A., and Rivas, S. (2008). Trans-regulation of the expression of the transcription factor MtHAP2-1 by a uORF controls root nodule development. Genes Dev 22, 1549-1559. Hall, B.G., and Salipante, S.J. (2007). Measures of clade confidence do not correlate with accuracy of phylogenetic trees. PLoS Comput Biol 3, e51. Jarvis, P. (2008). Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytol 179, 257-285. Kumimoto, R.W., Adam, L., Hymus, G.J., Repetti, P.P., Reuber, T.L., Marion, C.M., Hempel, F.D., and Ratcliffe, O.J. (2008). The Nuclear Factor Y subunits NF-YB2 and NF-YB3 play additive roles in the promotion of flowering by inductive long-day photoperiods in Arabidopsis. Planta 228, 709-723. Kwong, R.W., Bui, A.Q., Lee, H., Kwong, L.W., Fischer, R.L., Goldberg, R.B., and Harada, J.J. (2003). LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regulators essential for embryo development. Plant Cell 15, 5-18. 23.

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(28) VRN2 gene is a flowering repressor down-regulated by vernalization. Science 303, 1640-1644. Yano, M., Katayose, Y., Ashikari, M., Yamanouchi, U., Monna, L., Fuse, T., Baba, T., Yamamoto, K., Umehara, Y., Nagamura, Y., and Sasaki, T. (2000). Hd1, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Plant Cell 12, 2473-2484. Zobell, O., Coupland, G., and Reiss, B. (2005). The family of CONSTANS-like genes in Physcomitrella patens. Plant Biol (Stuttg) 7, 266-275.. 27.

(29) 表一、本論文所使用的阿拉伯芥 HAP 基因專一性引子左欄為 HAP 基因名稱以及 AGI 號碼。中間欄位為引子核苷酸序列，F 表示正向引子(forward primer)，R 為反向引子(reversed primer)。右欄表示以引子進行聚合酶連鎖反應所放大的 DNA 片段長度。. HAP 基因. 引子序列(5’3’). 編碼序列長度(bp). AT2G38880 F CATGCCATGGCGGATACGCCTTCGAG (HAP3a) R GGAATTCTTACCAGCTCGGCATTTCTTCA. 426. AT5G47640 F CATGCCATGGGGGATTCCGACAGGGA (HAP3b) R GGAATTCTTAAGTCCTTGTCCTACCGGAG. 573. AT3G48590 F CATGCCATGGATACCAACAACCAGCAAC (HAP5a) R GGAATTCTTAACCTTGGCCGTCGG. 705. AT1G56170 F CATGCCATGGAGCAGTCAGAAGAGGG (HAP5b) R GGAATTCTTAAGACTCATCAGGGTGTTGC. 600. AT1G08970 F CGGGATCCGAATGGATCAACAAGACCATGC (HAP5c) R GCGTCGACTAATTTTCCTGGTCAGGTTGG. 696. 28.

(30) 表二、阿拉伯芥 HAP 基因家族由左至右欄位內依序為 HAP2、HAP3 和 HAP5 基因家族成員資訊，包括基因基因編碼(accession number)、AGI(Arabidopsis Genome Initiative)號碼以及基因別名。基因編碼之右上角若出現「*」的符號，表示本研究作為檢測與 CIA2 是否有蛋白質間交互作用之 HAP 家族成員。 HAP gene family in Arabidopsis HAP2 family. HAP3 family. HAP5 family. accession number (AGI). Other name. accession number (AGI). Other name. accession number (AGI). Other name. BT025801. NF-YA1, HAP2a. BT005536*. NF-YB1, HAP3a. BX823847*. NF-YC1, HAP5a. NF-YA2, HAP2b. BX830131*. NF-YB2, HAP3b. BX817882*. (AT5G12840). BT026062 (AT3G05690). BT008825 (AT1G72830). AY114711 (AT2G34720). AY081445 (AT1G54160) NM_112256 (AT3G14020). BT005561 (AT1G30500). BT033080 (AT1G17590). BX822776. NF-YA3 ,HAP2c NF-YA4 NF-YA5 NF-YA6 NF-YA7 NF-YA8 NF-YA9. (AT3G20910). BX832331 (AT5G06510). (AT2G38880) (AT5G47640). BT003684 (AT4G14540). BT029363 (AT1G09030). BT005081 (AT2G47810). AY138461 (AT5G47670). BT025276 (AT2G13570). BX821279 (AT2G37060). BX817959 (AT1G21970). NF-YA10. AK176827 (AT3G53340). BT004083 (AT2G27470). AK227164 (AT5G08190). AK317460 (AT5G23090). 29. NF-YB3 NF-YB4 NF-YB5 NF-YB6, L1L NF-YB7 NF-YB8 NF-YB9, LEC1 NF-YB10 NF-YB11 NF-YB12 NF-YB13. (AT3G48590) (AT1G56170). BX815011 (AT1G54830). AK317038 (AT5G63470). BX833675 (AT5G50490). BX833348 (AT5G50480). DQ056712 (AT5G50470). DQ056694 (AT5G27910). BX816908* (AT1G08970). BT025266 (AT1G07980). BX842121 (AT3G12480). BX833046 (AT5G38140) NM_123691 (AT5G43250). NF-YC2, HAP5b NF-YC3 NF-YC4 NF-YC5 NF-YC6 NF-YC7 NF-YC8 NF-YC9, HAP5c NF-YC10 NF-YC11 NF-YC12 NF-YC13.

(31) 表三、HAP與不同CIA2片段之交互作用 A.CIA2蛋白從N端開始分成N、M和C三種片段，N片段是從第1個胺基酸到第189 個，經Scansite軟體預測此片段可能具有數個磷酸化修飾位點。M片段是從第190 個胺基酸到第360個，此片段序列包含多個lysine residue。C片段是從第361個胺基酸到第435個，此片段序列為CCT domain。 B. 利用Y2H檢測HAP及CIA2蛋白與不同CIA2蛋白片段之交互作用，以營養缺失外加10 mM 3-AT篩選與β-galactosidase活性測試方式檢定結果，其“＋”代表陽性結果，“－”代表陰性結果。AD，代表Gal4 activation domain C端所接合(fusion) 之蛋白種類，其所使用之表現質體為pACT2；BD，代表Gal4 binding domain C端所接合之蛋白種類其其所使用之表現質體為pAS2-1。N、M和C所代表的CIA2蛋白片段參考圖A。 A.. CIA2 polypeptide N. N (a.a.1~189). M (a.a.190~360). C (a.a.361~435). C. B. SD/-Leu/-Trp/-His +. AD. BD. CIA2:(N+M+C). ＋. ＋. CIA2:(C). HAP5a HAP5b HAP5c. CIA2:(N). HAP5a HAP5b. －. －. HAP5c. ＋. ＋. CIA2:(N+M+C). －. －. CIA2:(N+M+C). ＋. ＋. CIA2:(M+C). －. －. CIA2:(N). ＋. ＋. CIA2:(C). ＋. －. CIA2:(N+M+C). ＋. ＋. CIA2:(M+C). HAP3a HAP3b HAP5a HAP5b HAP5c CIA2:(N+M+C). 3-AT selection. 30. β-galactosidase assay.

(32) 表四、Y2H 之對照組結果利用 Y2H 檢測 HAP 及 CIA2 蛋白與不同 CIA2 蛋白片段之交互作用實驗中，其對照組以營養缺失外加 10 mM 3-AT 篩選與 β-galactosidase 活性測試方式檢定結果，其“＋”代表陽性結果，“－”代表陰性結果。AD，代表 Gal4 activation domain C 端所接合(fusion)之蛋白種類，其所使用之表現質體為 pACT2；BD，代表 Gal4 binding domain C 端所接合之蛋白種類其所使用之表現質體為 pAS2-1。表中 pACT2 及 pAS2-1 代表不帶其他序列的質體。“X”則表示不轉形該質體至酵母菌中。N、M 和 C 所代表的 CIA2 蛋白片段參考表三圖 A。. SD/-Leu/-Trp/-His +. AD. BD. pACT2. X. －. －. X. pAS2-1. －. －. pACT2. pAS2-1. －. －. pAS2-1. －. －. CIA2:(N+M+C). ＋. ＋. －. －. －. －. ＋. －. －. －. ＋. ＋. 3-AT selection. β-galactosidase assay. CIA2:(N+M+C) CIA2:(M+C) CIA2:(C) CIA2:(N). pACT2. CIA2:(M+C) CIA2:(C) CIA2:(N). HAP5a HAP5b. pAS2-1. HAP5c HAP5a pACT2. HAP5b HAP5c. SV40 large T antigen. Murine P53. 31.

(33) 不同長度 CIA2 片段之解碼序列 TRP pAS2-1 plasmid HAP 蛋白之解碼序列. LEU pACT2 plasmid. HAP 蛋白之解碼序列. TRP1. HAP. pAS2-1 plasmid. 不同長度 CIA2 片段之解碼序列 LEU2. CIA2 pACT2 plasmid 圖一、Y2H 系統載體建構策略示意圖將不同長度之 CIA2 解碼序列以及欲檢測之 HAP 成員解碼序列分別黏合至 pAS2-1(含 Gal4 BD)和 pACT2(含 Gal AD)質體中，並轉形至 CG1945 進行檢測。. 32.

(34) HAP3/HAP5 interaction *. DNA binding. Linker *. * * *. ***. ▲. ▲▲. ]. ▲. 圖二、阿拉伯芥CIA2 CCT-motif與HAP2成員胺基酸比對分析示意圖使用 Vector NTI 10 軟體比對阿拉伯芥 CIA2 之 CCT motif（CIA2）、阿拉伯芥十個 HAP2 蛋白成員（NFYA1-10）和 Saccharomyces cerevisiae HAP2 (Yeast HAP2)之胺基酸序列，左排括號內顯示各序列排頭之胺基酸序號，其保守度由高至低分別以黃色、藍色及綠色背景表示。最末行顯示保守之胺基酸。最上方橫線上文字代表 HAP2 各區域片段之蛋白功能。CIA2 的 CCT motif 與 HAP2 成員完全保守的胺基酸以「*」表示於最上方；而在 HAP2 或 CCT-class proteins 突變分析指示與 HAP3/5 蛋白交互作用或 DNA 結合有關的胺基酸，其在比對結果的對應位置以「▲」表示於下方。. 33.

(35) B=BD:CIA2. A1=AD:HAP5a. C1=AD:CIA2 X BD:HAP5a. A2=AD:HAP5b. C2=AD:CIA2 X BD:HAP5b. A3=AD:HAP5c. C3=AD:CIA2 X BD:HAP5c. PC=positive control. 圖三、HAP5a、HAP5b 和 HAP5c 與 CIA2 蛋白交互作用檢測結果不同 HAP5 成員與 CIA2 蛋白交互作用檢測組別，分別於 YPD(左上)、營養缺失外加 10 mM 3-AT 之篩選性培養基(中上)和 β-galactosidae 檢測(右上)之實驗結果。下圖代表培養基上不同實驗組別之位置，組別 A1-A3 為可表現 AD:HAP5 雜合蛋白之酵母菌，組別 B 為可表現 BD:CIA2 雜合蛋白的酵母菌，組別 C1-C3 為可同時表現 AD:HAP5 與 BD:CIA2 雜合蛋白的酵母菌，而組別 PC 為正控制組，其所使用酵母菌可同時表現 AD:SV40 large T-antigen 與 BD:p53 雜合蛋白。. 34.

(36) 圖四、CIA2 蛋白間交互作用檢測結果 CIA2 蛋白間交互作用檢測組別，分別於 YPD（左上）、營養缺失外加 10 mM 3-AT 之篩選性培養基（中上）和 β-galactosidae 檢測（右上）之實驗結果。下圖代表培養基上不同實驗組別之位置，組別 1 為可表現 BD:CIA2 雜合蛋白之酵母菌，組別 2 為可同時表現 AD:CIA2 與 BD:CIA2 雜合蛋白的酵母菌，而組別 PC 為正控制組，其所使用酵母菌可同時表現 AD:SV40 large T-antigen 與 BD:p53 雜合蛋白。. 35.

(37) AD. X. BD N M C M C. HAP5a N. C N M C M C. HAP5a. N C 0. 1. 2. 3. 4. B-galactosidase relative activity unit. Relative β-gal relative β-galactivity activityunit. 圖五、HAP5a 與不同 CIA2 片段檢測組別之 β-gal 定量 HAP5a 與不同長度的 CIA2 片段之交互作用檢測組別，其組別配合如圖左所示，灰色格子表示欲檢測之 CIA2 的 N、M 或 C 片段(片段資訊可參考表三說明)。以具篩選力培養基培養，提供 ONPG 為受質，進行三重複，測量 β-gal 相對活性單位，並以 CIA2 全長與 HAP5a 的組別當基準 1，計算各檢測組別比值之平均值及標準差，並繪製成條狀圖。. 36. 5.

(38) AD. X. BD N M C M C. HAP5b N. C N M C M C. HAP5b. N C 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. B-galactosidase relative unit. β-gal relative activity unit Relative β-gal activity 圖六、HAP5b 與不同 CIA2 片段檢測組別之 β-gal 定量 HAP5b 與不同長度的 CIA2 片段之交互作用檢測組別，其組別配合如圖左所示，灰色格子表示欲檢測之 CIA2 的 N、M 或 C 片段(片段資訊可參考表三說明)。以具篩選力培養基培養，提供 ONPG 為受質，進行三重複，測量 β-gal 相對活性單位，並以 CIA2 全長與 HAP5b 的組別當基準 1，計算各檢測組別比值之平均值及標準差，並繪製成條狀圖。. 37.

(39) AD. X. BD N M C M C. HAP5c N. C N M C M C. HAP5c. N C 0. 1. 2. 3. 4. B-galactosidase relative activity β-gal relative activity unit Relative β-gal activity. 圖七、HAP5c 與不同 CIA2 片段檢測組別之 β-gal 定量 HAP5c 與不同長度的 CIA2 片段之交互作用檢測組別，其組別配合如圖左所示，灰色格子表示欲檢測之 CIA2 的 N、M 或 C 片段(片段資訊可參考表三說明)。以具篩選力培養基培養，提供 ONPG 為受質，進行三重複，測量 β-gal 相對活性單位，並以 CIA2 全長與 HAP5c 的組別當基準 1，計算各檢測組別比值之平均值及標準差，並繪製成條狀圖。. 38. 5.

(40) 1. 60. ATCIL ATCIA2 OS1 OS2 ZM1 ZM2 ZM3 OS3 MC PT1 PT3 RC VV1 VV2 PP Consensus. (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1). ----------MSSCAYSFELEMMKSPPSNN-----------TPS-PSSTIS-----ETNS -MSACLSSGGGGAAAYSFELEKVKSPPPSSS-----TTTTRATS-PSSTIS-----ESSN MSSSCIPTG------LRLDLDIVKAATSPG-AHSSPLRPAHSS--PSSTLS-EASNTSSS MSSSCIPTG------LRLDLDIVKAATSPG-AHSSPLRPAHSS--PSSTLS-EASNTSSS MSSSCIPTG------LRLDLDMVKAAASPVGAHSSPLRPAHYSS-PSSTLSSEASNASSS MSSSCIPTG------LRLDLDMVKAAASPVGAHSSPLRPAHYSS-PSSTLSSEASNASSS MSSSCIPTG------LRLDLDMVKAAASPVGAHSSPLRPAHYSS-PSSTLSSEASNASSS MASSCIPTG------LRLDLEMVKAAAPPG----GSSAAAHSS--ASSTLS-EASNSSSS -MSSCFSGT--GGRTIGLDLDIVKSSPPCSW-----SRTSQTSSSPSSTIS-----ESSN MSSPCISG---GGRTYGFDLEIVKS-SSTSS-----TRTSHTSS-PSSTIS-----ESSN MSSPCISG---GGRTYGFDLEIVKS-SSTSS-----TRTSHTSS-PSSTIS-----ESSN MSSPCLSG---GGRAYGFDLEIVKS-PS-TS-----TRTSHTSS-PSSTLS-----ESSN -MSSCLSG---AGRTYGFELEIVKX-PSSTS-----PRTSHSSS-PSSTIS-----ESSN -MSSCLSG---AGRTYGFELEIVKS-PSSTS-----PRTSHSSS-PSSTIS-----ESSN ---------MAGGGGIKGAVNNNVATAMAIAGRDSRACDVCGLHRARWYCSVDNAHLCRR MSSSCI GG L DLEIVKA S R AHSSS PSSTIS ESS. ATCIL ATCIA2 OS1 OS2 ZM1 ZM2 ZM3 OS3 MC PT1 PT3 RC VV1 VV2 PP Consensus. (34) (49) (51) (51) (54) (54) (54) (48) (48) (46) (46) (45) (45) (45) (52) (61). 61 120 PPFSISTRRPRTPRKRPNQTYDEAAALLSTAYPKIFSSKKAKTQIFGTNKS------PLS SPLAISTRKPRTQRKRPNQTYNEAATLLSTAYPNIFSSNLSSKQKTHSSSNSHFYGPLLS SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVKKSPKTASRPPTRQLSGLSAVF SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVKKSPKTASRPPTRQLSGLSAVF SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVNKSPKTAP-PRPPQLSVLAAAL SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVNKSPKTAP-PRPPQLSVLAAAL SATSVSLKRARAPRKRPNQAYNEAAALLASIHPSVFPVNKSPKTAP-PRPPQLSVLAAAL SVASLSLKRARTPRKRPNQTYNEAAALLASMYPSVFPVIKGAGTAP-PRLLGLATALADD SPLAIYTTKPRTPRKRPNQTYNEAATLLNTAYPNLFSNPNLKTNPNHNNNKSTKL--EKA SPLAISTRKSRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKHLTKSSKFTKPQDNSL--LLD SPLAISTRKSRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKHLTKSSKFTKPQDNSL--LLD SPLAISTRKPRTHRKRPNQIYNEAAALLSTAYPNIFSTTNPR---KFTKPHQDTL--LLD SPIAISTRKXRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKNLKNPCKFTKSHDS----FLE SPIAISTRKPRTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYPNIFSTKNLKNPCKFTKSHDS----FLE CDQNVHSANALALHHERVRLDLQGNALHTPRKALKGNTSAPQNSLKSAAQMDHAAPSRKS SP AISTRKARTPRKRPNQTYNEAAALLSTAYP IFST KTA K S L. 圖八、阿拉伯芥 CIA2 與其他同源基因之 N 端區域比對分析結果使用 Vector NTI 10 軟體比對阿拉伯芥 CIA2 和自資料庫搜尋下載之可能同源基因，其 CIA2 前 120 個胺基酸片段結果，其物種包括阿拉伯芥(AT)、水稻(OS)、玉米(ZM)、苜蓿(MC)、赤楊(PT)、蓖麻(RC)、葡萄(VV)和陶立宛蘚(PP)。左排括號內顯示各序列排頭之胺基酸順序序號，其保守度由高至低分別以黃色、藍色及綠色背景表示。最末行顯示保守之胺基酸，此結果有 74/120 (61%)的保守性。. 39.

(41) A. 94 61. 74 69. ATCIL ATCIA2 100 VV1 VV2 RC PT2 98 PT1 92 100 PT3 MC OS3. 91 ZM1 99 ZM2 97 ZM3 OS1 82 100 OS2 PP. 0 .0 5. B. 40. ATCIL ATCIA2. 36. 100 VV2 VV1 87 40 RC PT2 57 97 PT1 MC OS3 ZM3 99 ZM2 97 ZM1 OS2 95 99 OS1. PP. 0 .2. 圖九、CIA2 以及同源蛋白親緣關係樹使用 MEGA4 軟體，將阿拉伯芥 CIA2(ATCIA2)及其他同源蛋白之胺基酸 A.全長序列及 B.N 端序列(前 120 個胺基酸)比對分析並繪製之親緣關係圖，其比對物種包括阿拉伯芥(AT)、水稻(OS)、玉米(ZM)、苜蓿(MC)、赤楊(PT)、蓖麻(RC)、葡萄(VV)和陶立宛蘚(PP)。各分枝根部顯示數字為進行 1000 次 bootstrap 所得之可信值。其分枝長度比例依照演化親緣距離繪製，其比例尺如左下所示。. 40.

(42) (A). SALK_109993 ATG. T-DNA. HAP3a (AT3g38880). SALK_105064 ATG. T-DNA. HAP3b (AT5g47640). SALK_080334 ATG. T-DNA. SALK_111422. HAP5a (AT3g48590) ATG. T-DNA. HAP5b (AT1g56170). Promoter ATG. 30-2 TGGStop. CIA2 (AT5g57180). (B) WT. SALK_105064. 30-2. SALK_080334. SALK_109993. SALK_111422. 圖十、HAP 及 CIA2 之突變株外表型比較 (A)各單基因突變株在 HAP3a、HAP3b、HAP5a、HAP5b、HAP5c 及 CIA2 上的突變位置示意圖。以黑色實心方格表示 exon，線段表示 intron。倒三角形為 T-DNA insertion，標有 SALK 編號。下箭頭顯示 cia2 突變株(30-2)中點突變之位置。 (B)野生形及各突變株之 12 天大的植株。30-2 葉片顏色偏淺，而其他突變株之顏色與野生型相近。. 41.

(43) 附圖一、阿拉伯芥 HAP2、HAP3 及 HAP5 蛋白之親緣關係樹(取自 Sifer et al., 2009) 使用 MEGA4 軟體，以 neighbor-joining 方法，將 HAP2 (NF-YA family)、HAP3 (NF-YB family)及 HAP5 (NF-YC family)之胺基酸比對分析並繪製之親緣關係圖。各分枝根部顯示數字為進行 2000 次 bootstrap 所得之可信值。其分枝長度比例依照演化親緣距離繪製，其比例尺如左下所示。. 42.

(44)