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九十年度國科會專題計畫成果報告
計畫編號：NSC 90-2313-B-039-001
綠豆澱粉合成酵素的研究- 酵素鑑定與生化性質的探討(2/2)
Study of mungbean starch synthases - Biochemical properties and enzyme characterization (2/2)
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
主持人：柯源悌 中國醫藥學院營養系 e-mail: [email protected]
一、中文摘要:
綠豆(mungbean; Vigna radiata cv. KPS1)萃取 液(B7 crude)經 Native-PAGE， 再 以 磷 解 刺激的澱 粉分支酵素(starch branching enzyme; SBE)之原位 活性染色反應，會同時出現一電泳泳動慢的藍紫色 (SBEI)與兩個電泳泳動快的紅紫色(SBEIIa，IIb)蛋 白質族群。且 SBEI 於反應 2 小時即會出現，但 SBEIIa 要 16 小時後才會出現。SBEI 和 SBEIIa 族 群經 SDS-PAGE 及銀染得知分別主要包含 105、62 和 55 kDa 及 96、64 和 55 kDa 的蛋白質。 B7 crude 經 一 連 串 的 部 份 純 化 ， 發 現通過 Sephacryl S-200 管柱時，會分離得到 PI 和 PII 兩個 尖峰，且由活性染色實驗得知所分離出的 PI 是屬 於活染為藍紫的 SBEI 族群，而分離出的 PII 是屬於 紅紫的 SBEIIs 族群。最後分別經過 Q2 管柱，得到 純化倍數為 30.4 倍的 PIII 和 101.9 倍的 PIV。另 外，由電泳圖發現 SBEI 族群包含的 105、62 和 55 kDa 蛋白質之含量與活性有量相關性，並且也發現 SBEIIa 族群包含的 96、64 和 55 kDa 蛋白質之含量 亦有量相關性。 105 kDa 蛋白質經過 trypsin 水解與蛋白質質譜 鑑定得知與地瓜、玉米、稻米… .等有極高的相似 度 ， 推 測 為 綠 豆 之 澱 粉 磷 解 酵 素 (starch phosphorylase; SP)。以 62 kDa 蛋白質製備的抗體， 來進行免疫中和反應，發現抗體能中和 B7 crude 中 的 SBE 活性達 97 ﹪；且於西方點墨法發現此抗體 主要可辨識到 62、55 和 31 kDa 的蛋白質。而 55 kDa 的抗體亦可中和 B7 crude 且辨識到 62、55 和 31 kDa 的蛋白質。因此，推斷 62 和 55 kDa 蛋白質是屬於 SBEI 族群，其會與可能為 SP 的 105 kDa 蛋白質在 原始態下相互結合。 當三種不同發育時期綠豆種子之粗萃取液，以 磷 解 刺 激的SBE 之活性染色分析，發現顆粒大的 種子其 SBE 比活性會減小，且於活染顯影知道 SBEI 族群會減少而 SBEIIa 族群反而會增加，但是 SDS-PAGE 顯示 SBEI 族群之主要蛋白質的分子量 相同，包含 62 及 55 kDa，含量也相類似。由以上 結果可知，至少有三種不同的 SBE 異 構 在 綠豆種 子發育過程中，對澱粉的生合成扮演不同的重要角 色。 關鍵詞：綠豆、澱粉合成酉每、酵素純化、澱粉生合 成 Abstr act
Partially purified mungbean (Vigna radiata
var. KPS1) soluble fractions with starch branching enzyme (BE) activity detected by radioactive method were subjected to Native–PAGE and in situ activity
staining for enzyme analysis. When native gel was incubated with G-1-P and sodium citrate (pH 7.0) to react at 30℃ for 2 hrs followed by iodine staining, it visualized a blue-purple protein population with slow mobility. SDS-PAGE and silver staining showed that it was consisted of 105, 62 and 55 kDa proteins. The polyclonal antibody against the 62 kDa protein was able to immuno-neutralize 97% SBE activity and cross-react majorly with 62, 55 and 31 kDa proteins of mungbean crude extract by Western blotting. The polyclonal antibody against the 55 kDa protein also cross-reacted with 62, 55 and 31 kDa proteins. Tryptic peptide mapping and database searching for the 105 kDa protein demonstrated it to be low-affinity starch phosphorylase (L-SP) due to its high internal sequence homology with L-SP of sweet potato, corn, rice and potato. It suggested that mungbean L-SP is associated with 62 kDa and 55 kDa protein at native state. When native gel was incubated in the presence of phosphorylase a and AMP in addition to G-1-P and sodium citrate (pH 7.0) to react at 30℃ for 21 hrs,
2 two red-purple protein populations with high mobility were visualized by iodine staining, which was similar to the finding of rice BEIIa and BEIIb. Developing mungbeans of different seed size were analyzed by the phosphorylase-stimulated activity staining method and found that the density of SP-containing slow mobile population decreased and the high mobile population increased as the seed size increase. These results demonstrated that various mungbean BE isoforms may play important roles in starch accumulation during seed development.
二 二二、、、緣由與目的: 本 研 究 的 動 機 在 於 中 國 傳 統 食 品 綠 豆 (Vigna radiata)冬粉具有久煮不爛的韌性，化學 性質方面被綠豆澱粉的直鏈澱粉(amylose)含量 約為 32-35%，較一般澱粉的 15-30%為高，且 amylose 與 amylopectin 的分子構造特別，使其不 能為其他種類的澱粉所取代。對參與澱粉生合成 的 酵 素 ， 包 括澱 粉 合 成 (starch synthase, SS, EC
2.4.1.21) 、 澱 粉 分(starch branching enzyme, 支
SBE, EC 2.4.1.18) ， 與 澱 粉 磷 解 (starch phosphorylase, SP, EC 2.4.1.1)等，其在植物醣類 的代謝與能量儲存方面具生理上的必要性；不同 種 類 的 澱 粉 合 成 對 的澱 粉 結 構扮 性的 演 異 特 角色，然而國內外對於綠豆澱粉生合成酵素的研 究非常有限。 因此，本研究的目的在嘗試以傳統生化上慣用的 液相層析法來部分純化酵素，並配合非變性電泳、 電泳與原位(in situ)活性染色法來偵測與區分綠豆 的 SP 和 SBE。 三 三三、、、材材材料料料與與與方方方法法法 未成熟綠豆莢(KPS1)來自於亞洲蔬菜中心 (AVRDC)，由田間種植，採收開花 14 天(DAF14) 前 後 的 豆 莢 於-80℃冷凍儲存。使用儀器包括 Spectrophotometer (HITACHI U-2000)，β-Countor (Beckman LS-6500) ， 影 像 文 書 處 理 系 統 (AlphaImager 2200) ， pH meter (Minipore MP 220)，電泳裝置(Bio-Rad Mini-PROTEAN II&Ⅲ elutro-elutor) ， FPLC (Bio-Rad BioLogic LP system)，高速冷凍離心機(Hitachi CR21)等。 ( ((111)))製製製備備備綠綠綠豆豆豆溶溶溶解解解性性性區區區分分分：：： 未成熟綠豆粒小心自豆莢撥出後秤重紀錄，以 冰冷(4℃)的萃取液 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.25 mM DTT, 10 mM EDTA, 10% glycerol, 5 mM PMSF]以適量體積在研缽(使用前-20℃預冷)以杵 研磨均質化後，以 4℃、10,000 x g、離心 10 min， 取上清液即為 B7 粗酵素液(B7 crude)，並測其酵 素活性及蛋白質濃度。 ( ((222))) 部部部分分分純純純化化化層層層析析析：：： B7 crude 經硫酸銨劃分、再依序經過 DEAE Fast Flow、Sephacryl S-200 HR (Pharmacia)、Q2 (Bio-Rad) 管柱層析等步驟純化酵素。
(
((333)))BBBEEE活活活性性性測測測定定定：：：
以放射性法測試 (Hawker et al., 1974)，利用 0.1 M sodium citrate (pH 7.0)、1 mM AMP、6 U/ml phosphorylase a、50 mM [14C]G-1-P (1540 cpm/ul) 和 BE 共 200 ul 來反應。於加入 G-1-P 開始，在 30℃水浴、200 rpm 速度震盪反應 30 min 後，將 樣品滴在 G/A filter disc 上烤乾中止酵素反應，並 用抽氣過濾方式以沖洗液沖去 disc 上未反應基 質，隨後 disc 放入 counting vial 中加入閃爍計數 液(Cocktail)，以閃爍計數器測放射性量，活性 (U)=nmole/min。
(
((444))) 電電電泳泳泳：：：
變 性 電 泳 (Denaturing gel electrophoresis),
SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) (Laemmli 1970)根據 Bio-Rad 公 司 的 膠 體 製 備 及 操 作 步 驟 ， 跑 7.5-12% polyacrylamide gel 的膠體電泳，以 Coomassie blue 或 Silver stain 染色。非變性電泳 (Native gel electrophoresis) (Edwards et al. 1995), 和 SDS-PAGE 操作步驟相似，但不含 SDS。 ( ((555))) 原原原位位位活活活性性性染染染色色色：：： 根據 Yamanouchi et al. (1992)的方法加以修 飾，BE 反應液與活性測定法相同或只含 G-1-P 和 Sodium citrate, pH 7.0。而 SP 的反應液為 G-1-P 和 Sodium citrate, pH 6.0。生成的澱粉以 KI/I2溶
液染色顯影。 ( ((666))) 蛋蛋蛋白白白質質質電電電流流流洗洗洗脫脫脫：：： 根 據 Bio-Rad 公 司 的 Model 422 electro-elutor 操作方法。 ( ((777))) 抗抗抗體體體製製製備備備與與與免免免疫疫疫中中中和和和：：：
3 將 62，55 kDa 蛋白質對 Balc/C 小白鼠做免疫 注射收集腹水。將 B7 crude 與不同濃度的抗體於 室溫下反應 1 小時，以放射性法分析殘留 BE 活 性 ， 與 不 加 抗體 的控 制組 比較 ，換 算中 和率 (Vos-Scheperkeuter et al., 1989 )。 ( ((888))) 西西西方方方點點點墨墨墨法法法：：：
根據 Pharmacia 公司的 ECL reagent kit 操作 方法。
(((999))) 蛋蛋蛋白白白質質質質質質譜譜譜鑑鑑鑑定定定：：：
將 105 kDa 蛋白質以 trypsin 作 in-gel digestion 後 經 MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight MS) 得到質 譜圖，再進入 NCBI 的資料庫比對。 四、、、結果與討論: F FFiiiggguuurrreee 111... BBBEEE 異異異構構構 的的的活活活染染染顯顯顯影影影。。。B7 crude 跑 Native-PAGE，不同條件活染後，切下顯影的蛋白 質條紋跑 SDS-PAGE。
A. 不同活染條件反應 21 h B. 以 A.4 條件反應不同時間 C., D. BEI 和 BEIIa 之 SDS-PAGE 1 2 3 4 5 2 h 4h 8h 16h 24h BEI MW BE I IIa MW 1.Figure 1A 顯示只有 phosphorylase-stimulation assay(條件 4)可得到三種不同的 BEs (BEI、BEIIa、 BEIIb)，因 BEI 與 SP 的蛋白質位置相同，推斷 BEI 包含 SP；Figure 1B 顯示 BEIIa 於反應長時間後會 出現；將條紋切下搗碎跑 SDS-PAGE 得到 BEI 包 含 105、62 和 55 kDa 的蛋白質；而 BEIIa 包含 96、 62/62 和 55 kDa 的蛋白質 (Figure 1C, D)。 T TTaaabbblleele11.1..BBBEEE之之之部部部分分分純純純化化化表表表 FFiFiiggguuurrreee22.2..不不不同同同純純純化化化區區區分分分之之之活活活性性性染染染色色色圖圖圖 純化步驟 總蛋白 (mg) 總活性 (U) 比活性 (U/mg) 純化倍數 (fold) B7 cr ude 1365 53235 39 1 硫酸銨劃分 (AS 20-60% ) 242 45089 186 4.6
DEAE Fast Flow 27.7 13386 483 12.3
Sephacr yl S-200 P I P II 3.490.96 25982288 2383744 19.060.7 Q2 P III P IV 0.85 0.226 1015 905 1194 4001 30.4 101.9 2. Table 1 顯示 B7 crude 經 S-200 層析可分出兩個 BE 活性的 P I 和 P II，再分別經 Q2 層析可得到純 化倍數為 30.4 的 P III 及 101.9 倍的 P IV。Figure 2 顯示純化區分的 BE 比活性與碘染顯影的深度有相 關性，也分為藍紫和紅紫兩族群，且 BEI 主要在 P I，P III；BEIIa 和 BEIIb 在 P II，P IV。
T TTaaabbbllelee222...BBBEEEIII包包包含含含的的的110100555kkkDDaDaa蛋蛋蛋白白白質質，質，，經經經蛋蛋蛋白白白質質質質質質 譜 譜譜(((MMMAAALLLDDDIII---TTTOOOFFF)))鑑鑑鑑定定定為為為SSSPPP MOWSE Scor e Pr otein MW
(Da)/pI Accession # Species Pr otein Name
1.119e+00
5 108521/5.3 168276 IPOMOEA BATATAS (M64362) starch phosphorylase
6.613e+00
4 110434/5.6 6733896 ZEA MAYS (A85269) unnamed protein product
6.099e+00
4 104645/5.4
1319543
0 ORYZA SATIVA (AF327055) alpha glucan phosphorylase
3526 110701/5.2 313349 SOLANUM TUBEROSUM (X73684) starch phosphorylase
3.MOWSE Score 愈小，其內部序列質譜愈相 近，由 Table 2 得知 105 kDa 蛋白質與地瓜、玉米、 稻米和馬鈴薯的 SP 有極高的相似度，推測 105 kDa 蛋白質就是綠豆之 SP，其和 BE 在原始態下會相互 結合。 F FFiiiggguuurrreee33.3.. 免免免疫疫疫中中中和和和 FFFiigigguuurrreee444...西西西方方方點點點墨墨墨 A. Anti-62 kDa B. Anti-55 kDa
62 kDa抗體中和B7 crude活性 0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 10 抗體(62 kDa)體積(ul) Neutralization%
4.Figure 3、Figure 4A 是以 62 kDa 的抗體，對 B7 crude 進行免疫中和和西方點墨試驗，顯示 62 kDa 抗體可中和活性達 97%，且可辨認 62，55 和 31 kDa 的蛋白質。另外 Figure 4B 亦發現 50 kDa 的 抗體亦辨認到 62，55 和 31 kDa 的蛋白質，且亦可 中和 B7 crude (結果未示)。 F FFiiiggguuurrreee555...三三三種種種不不不同同同顆顆顆粒粒粒大大大小小小綠綠綠豆豆豆的的的BBB777cccrrruuudddeee之之之活活活 性 性性圖圖圖，，，與與與經經經NNaNaatttiivivveee---PPPAAGAGGEEE和和和活活活染染染所所所得得的得的的電電電泳泳泳圖圖圖 B. 不同顆粒綠豆比活性比較圖 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 1 2 3 綠豆大小 g/bean 0 50 100 150 200 S.A.(U/mg) g/bean S.A. (U/mg)
C. Native PAGE D. SDS-PAGE E. 活染條紋 BEI 之 SDS-PAGE
Coomassie blue 活染 1 2 3 1 2 3 1 2 3 MW MW 1 2 3 A. 1 2 3 B7 DEAE P II P IV AS P I P III BEI 藍紫 BEIIa 紅紫 BEIIb 紅紫 62 55 31 62 55 31 200 116 97 66 45 31 62 55 97 66 45 31 105 62 55
1. Coomassie blue stain
2. G-1-P+sodium citrate, pH6.0
3. G-1-P+sodium citrate, pH7.0 4. G-1-P+sodium citrate, pH7.0 + AMP + phosphorylase a
5. G-1-P+sodium citrate, pH7.0 + AMP 7.5% gel 10% gel Coomassie blue stain Silver stain
SP 藍紫 BEI 藍紫 BEIIa紅紫 BEIIb紅紫 200 116 97 66 45 200 116 97 66 45 105 96 62 55 BEI BEIIa
4 5. Figure 5 發現顆粒大的種子其 BE 比活性會減 小(Figure 5B)，且 BEI 族群會減少而 BEIIa 族群會 增加(Figure 5C，圖不明顯) ，於 SDS-PAGE 發現 三者蛋白圖譜相似，但量不同(Figure 5D)。三者 BEI 活染條紋之 SDS-PAGE 顯示主要蛋白質分子量相 同，包含 62，55 kDa 且量相似(Figure 5E)。
本研究已成功的初步鑑定出綠豆的 BE 及其異
構 ； 綠 豆 萃取Native-PAGE，再以刺激澱粉液 經
合 成 的 磷 解 反 應 及 碘 染 ， 會 同時 出 現 一 電泳慢的
藍紫色(BEI)與兩個電泳快的紅紫色(BEIIa，IIb)蛋白 質族群 (Figure 1.A)，其現象類似於稻米的 BE IIa 與 BE IIb(Yamanouchi et al., 1992)，預測即是綠豆之 BEs。BEI 和 BEIIa 族群經 SDS-PAGE 及銀染得知 分別主要包含 105、62 和 55 kDa 及 96、62 和 55 kDa 的蛋白質 (Figure 1.C , D)。62 kDa 抗體可免疫中和 B7 crude 的 BE 活性 (Figure 3)且西方點墨發現此抗 體和 55 kDa 抗體均可辨認 62，55，31 kDa，但不 會辨認 105 kDa (Figure 4)，顯示 55，62 kDa 蛋白質 就是綠豆的 BE 並具有同源性；而 105 kDa 蛋白質 經質譜比對，極可能就是綠豆的 SP (Table 2)，並且 於純化過程中和 BE 活性一起出現(Figure 2，P I ; P III)，顯示原始態下與 BE 相互結合，分別參與 amylose 與 amylopectin 的合成，使得 BEI 族群碘染 成為代表 amylose 的藍紫色，而 BEIIa,IIb 族群碘染 成為代表 amyolpectin 的紅紫色(Figure 1, 2)，而且 BEIIa 代表 55，62 kDa 蛋白質與 96 kDa 蛋白質結 合的族群來共同合成紅紫色的 amylopectin；96 kDa 的蛋白質含量與純化過程中 BE 活性有量相關(結 果未示)，應該是 BE 的 異 構 。 不 同 顆粒大小綠豆 的 B7 crude 之 BE 的比活性和顆粒大小成反比，但 是 62，55 kDa 的 BEI 量相似(Figure 5)，顯示 BEIIa 與 IIb 的族群可能扮演活性調節的角色，將更進一 步的確認。
五、、、計畫成果自評:
本計畫在執行期間完成對未成熟綠豆溶解 區分中澱粉分支酵素的純化步驟建立, 並以活性 染色法鑑定出 SBEI, SBEIIa, SBEIIb 族群, 並附 帶發現與 SBE 在原始態與 SP 結合緊密, 計劃結 果已於第四十屆年會之 B-08 壁報論文作發表, 目前在從事對 GBSS 及 SSS 的純化鑑定, 藉由活 染 顏 色 的 差 異 性 , 對 參 與 合 成 amylose 及 amylopectin 的酵素群及其對綠豆澱粉的合成有 進一步的瞭解, 自許本計畫的發現具有預期具體 的貢獻,。 六、、、參考文獻:
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10. 張敬宜。7-2002 綠豆澱粉分支酵素的鑑定。
