中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/46086

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(1)中國醫藥大學藥學院中國藥學暨中藥資源學系博士論文編號:ICPS-D78. 指導教授：林文川教授. 台灣金線連對小鼠高血糖及高血脂的改善作用. Ameliorative effect of Anoectochilus formosanus on hyperglycemia and hyperlipidemia in mice. 研究生：中文名吳岳文英文名 Wu Yueh-Wern. 中華民國. 101 年 6 月.

(2) 摘要先前的研究指出台灣金線連水萃取物具有抗氧化、降血糖及降血脂功用，這些結果顯示台灣金線可能具有減緩代謝症候群的效果。本論文進一步探討台灣金線連有效分劃 (AFEF)的降血糖作用機轉。另外，以同時具有高血糖及高血脂，肥胖及高血脂的動物模式探討 AFEF 的改善效果。 AFEF 對正常小鼠血糖及腎上腺素誘發高血糖沒有降糖作用。對小鼠葡萄糖耐受性試驗具有降血糖的效果。對 streptozotocin (STZ) 誘發高血糖小鼠，單一劑量投與 AFEF 具有降血糖作用。對 STZ 誘發高血糖小鼠，長期投與 AFEF，具有降血糖、糖化血紅素、膽固醇及三酸甘油脂的作用，對肝臟肝糖濃度有減少作用。西方墨點法的分析顯示 AFEF 能增強骨骼肌 Glucose transporter Type 4 (GLUT4)蛋白的表現。 RT-PCR 的分析顯示， AFEF 對骨骼肌 GLUT4 、 AMP-activated. protein. 及肝臟. kinase. phosphoenolpyruvate. carboxykinase mRNA 的表現有增強作用。對 STZ 糖尿病小鼠餵食高脂肪飼料同時誘發及高血脂，AFEF 具有降血糖、降膽固醇及降三酸甘油脂的作用。對此模型，AFEF 也能降低低密度脂蛋白，同時提升高密度脂蛋白。AFEF 對小鼠餵食高脂肪飼料，或酒精加高脂肪飼料所造成的肥胖沒有減輕的作用。. I.

(3) 結論，AFEF 具有降血糖、降血脂的作用，但對肥胖沒有改善的效果。AFEF 降血糖機轉是活化骨骼肌中 AMPK 而改善骨骼肌對葡萄糖的吸收。. 關鍵字: 台灣金線連; 高脂肪食物; 酒精; 降血糖; streptozotocin; 葡萄糖轉運蛋白第4型; AMP活化蛋白激酶; 高血脂. II.

(4) Abstract. Previous studies have indicated that aqueous extracts of Anoectochilus formosanus (AFE) have antioxidative, hypoglycemic and anti-hypertriglyceridemic effects. These studies suggest that AFE may have benefits for metabolic syndromes. In the present study, we further examined the anti-hyperglycemic mechanisms of A. formosanus effective fraction (AFEF). In addition, we also investigated the amelioratory effects of AFEF on the hyperglycemic and hyperlipidemic, and obesity and hyperlipidemic animal models. AFEF did not reduce the blood glucose levels in normal mice and epinephrine-induced hyperglycemic mice. AFEF suppressed the elevated blood glucose concentrations on glucose tolerance test in mice. Single administration of AFEF could inhibit the blood glucose levels in streptozotocin (STZ)-induced hyperglycemic mice. Chronic treatments with AFEF could reduce blood levels of glucose and glycated hemoglobin, and serum concentrations of triglycerides and cholesterol in STZ-induced hyperglycemic mice. AFEF also decreased the hepatic glycogen levels. In STZ-induced hyperglycemic mice, Western blot analysis showed that AFEF inhibited the glucose transporter type 4 (GLUT4) protein expression in skeletal muscle. AFEF also decreased the mRAN expression of GLUT4 and AMP-activated protein kinase in skeletal muscle, and suppressed hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA expression. In a model that combined high-fat diet-induced hyperlipidemia III.

(5) with STZ-induced hyperglycemia in mice, AFEF could attenuate the blood levels of glucose, triglycerides and cholesterol. In this model, AFEF not only decreased LDL cholesterol, but also increased HDL cholesterol. However, AFEF did not decrease the obesity induced by high-fat diet or by high-fat diet supplied with drinking water containing 10% alcohol. In conclusion, AFEF has anti-hyperglycemic anti-hyperlipidemic effects. But, AFEF has no anti-obesity activity. The hypoglycemic mechanisms of AFEF are due to activation of AMPK to improve the resistance of glucose uptake into skeletal muscle in diabetic mice.. Keywords:. Anoectochilus. Streptozotocin;. glucose. formosanus; transporter. anti-hyperglycemia; type. monophosphate kinase; hyperlipidemic high fat food. IV. 4;. adenosine.

(6) 目錄. 第一章緒論························································································· 1 第一節：研究背景及目的 ·································································· 1 第二節：台灣金線連文獻考察 ·························································· 4 一、藥用植物基原考察 ······································································ 6 二、成分考察······················································································· 9 三、藥理活性考察 ··············································································· 10 第三節：代謝症候群與高血糖、高血脂及肥胖之關係 ·················· 15 第二章台灣金線連降血糖機轉之研究············································· 22 第一節：研究材料與方法 ··································································· 23 第二節：研究結果 ··············································································· 33 第三節：討論························································································ 37 第三章台灣金線連對糖尿病高血脂之影響 ···································· 56 第一節：研究材料與方法 ··································································· 57 第二節：研究結果 ··············································································· 60 第三節：討論························································································ 63 第四章台灣金線連對肥胖之影響···················································· 77 第一節：研究材料與方法 ··································································· 80. V.

(7) 第二節：研究結果 ··············································································· 83 第三節：討論························································································ 87 第五章結論·························································································· 106 參考文獻································································································ 108. VI.

(8) 表目錄. Table 2-1 Primer sequences of PCR amplification.···························41 Table 2-2 Effect of AFEF on blood glucose in mice. ··························42 Table 2-3 Effect of AFEF on intraperitoneal glucose tolerance test in mice. ············································································43 Table 2-4 Effect of AFEF on blood glucose in epinephrineinduced hyperglycemic mice. ··············································44 Table 2-5 Effect of single dose administration of AFEF on fasting. blood. glucose. in. streptozotocin-induced. hyperglycemic mice. ·····························································45 Table 2-6 Chronic effect of AFEF on fasting blood glucose in streptozotocin-induced hyperglycemic mice. ····················46 Table 2-7 Chronic effect of AFEF on intestinal activities of disaccharides. enzymes. in. streptozotocin-induced. hyperglycemic mice. ·····························································47 Table 4-1 Effect of AFEF on body weight in mice with high fat diet-induced obesity.·····························································90 Table 4-2 Effect of AFEF on plasma triglycerides in mice with high fat diet-induced obesity. ··············································91 Table 4-3 Effect of AFEF on plasma cholesterol in mice with high fat diet-induced obesity. ··············································92 Table 4-4 Effect of AFEF on plasma AST and ALT activities in mice with high fat diet-induced obesity ·····························93 Table 4-5 Effect of AFEF on body weight in mice were fed a VII.

(9) HFD supplemented with 10% alcohol. ······························94 Table 4-6 Effect of AFEF on plasma triglycerides in mice were fed a HFD supplemented with 10% alcohol.·····················95 Table 4-7 AFEF on plasma cholesterol in mice were fed a HFD spplemented with 10% alcohol. ··········································96 Table 4-8 Effect of AFEF on plasma GOT and GPT activities in mice were fed a HFD spplemented with 10% alcohol. ··97. VIII.

(10) 圖目錄. Fig. 1-1 臺灣金線連組織培養。 ··························································18 Fig. 1-2 臺灣金線連移植培養土培養。 ··············································19 Fig. 1-3 臺灣金線連穗狀花序。 ··························································20 Fig. 1-4 Metabolic pathways underlying metabolic syndrome.·······21 Fig. 2-1 Chronic effect of AFEF on plasma triglycerides in streptozotocin-induced hyperglycemic mice.·······················48 Fig. 2-2 Chronic effect of AFEF on plasma cholesterol in streptozotocin-induced hyperglycemic mice.·······················49 Fig. 2-3 Chronic effect of AFEF on glycated hemoglobin in streptozotocin-induced hyperglycemic mice.·······················50 Fig. 2-4 Chronic effect of AFEF on liver triglycerides in streptozotocin-induced hyperglycemic mice.·······················51 Fig. 2-5 Chronic. effect. of. AFEF on. liver glycogen. in. streptozotocin-induced hyperglycemic mice.·······················52 Fig. 2-6 Chronic effect of AFEF on the GLUT4 protein expression. in. skeletal. muscular. in. streptozotocin-induced hyperglycemic mice.·······················53 Fig. 2-7 Chronic effect of AFEF on the AMPK and GLUT4 mRNA. expression. streptozotocin-induced. in. skeletal. muscular. hyperglycemic. mice.. in A,. Fragments were amplified by RT-PCR. The expression levels of AMPK (B), and GLUT4 (C) mRNA were measured and quantified densitometrically. Values were normalized to GAPDH mRNA expression.·················54 Fig. 2-8 Chronic effect of AFEF on the PEPCK mRNA IX.

(11) expression. in. liver. in. streptozotocin-induced. hyperglycemic mice. A, Fragments were amplified by RT-PCR. The expression levels of PEPCK (B) mRNA were. measured. and. quantified. densitometrically.. Values were normalized to GAPDH mRNA expression. ····55 Fig. 3-1 Effect of AFEF on blood glucose in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit. ··················66 Fig. 3-2 Effect of AFEF on glycated hemoglobin in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit. ··················67 Fig. 3-3 Effect of AFEF on urine volume for 24 hours in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit.····························································································68 Fig 3-4 Effect of AFEF on urine creatinine for 24 hours in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit.····························································································69 Fig. 3-5 Effect of AFEF on liver weight in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit. ··················70 Fig. 3-6 Effect. of. AFEF on. epididymal. fat. weight. in. STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit.····························································································71 Fig. 3-7 Effect of AFEF on plasma triglycerides concentration in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit. ······················································································72 Fig. 3-8 Effect of AFEF on plasma cholestrol concentration in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit.····························································································73 Fig. 3-9 Effect of AFEF on plasma low density lipoprotein concentration in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit. ··························································74 X.

(12) Fig. 3-10 Effect of AFEF on plasma high density lipoprotein concentration in STZ-induced hyperglycemia in mice were fed a high fat deit. ··························································75 Fig. 3-11 Glucose-accelerated atherosclerosis.·····································76 Fig. 4-1 Effect of AFEF on perinephic fat weight percentage (%) in mice with high fat diet-induced obesity. ··························98 Fig.4-2 Effect of AFEF on epididymal fat weight percentage (%) in mice with high fat diet-induced obesity. ··················99 Fig. 4-3 Effect of AFEF on visceral fat weight percentage (%) in mice with high fat diet-induced obesity.·······························100 Fig. 4-4 Effect of AFEF on liver weight percentage (%) in mice with high fat diet-induced obesity. ········································101 Fig. 4-5 Effect of AFEF on perinephic fat weight percentage (%) in mice were fed a HFD supplemented with 10% alcohol.······················································································102 Fig. 4-6 Effect of AFEF on epididymal fat weight percentage (%) in mice were fed a HFD supplemented with 10% alcohol.······················································································103 Fig. 4-7 Effect of AFEF on visceral fat weight percentage (%) in mice were fed a HFD supplemented with 10% alcohol.·····104 Fig. 4-8 Effect of AFEF on relative liver weight percentage (%) in mice were fed a HFD supplemented with 10% alcohol.······················································································105. XI.

(13) 第一章緒論. 第一節研究背景及目的. 隨著醫療科技的進步，台灣人的壽命也逐漸延長，根據內政部 100 年初步估計，國人零歲的平均餘命分別為男性 76.0 歲，女性 82.7 歲，與 10 年前相較，男性增加 1.9 歲，女性增 2.7 歲(1)。許多慢性疾病如肥胖、糖尿病、心血管疾病等慢性疾病發生率持續的增加。行政院衛生署 100 年統計國人主要十大死因依序為(1)：1. 惡性腫瘤佔 28.0%；2. 心臟疾病佔 10.9%；3. 腦血管疾病佔 7.1%；4. 糖尿病佔 6.0%；5. 肺炎佔 6.0%；6. 事故傷害佔 4.4%；7. 慢性下呼吸道疾病佔 3.9%；8. 慢性肝病及肝硬化佔 3.4%；9. 高血壓性疾病佔 3.0%；10. 腎炎、腎徵候群及腎性病變佔 2.9%，其中與代謝症候群 (metabolic syndrom) 所衍生之相關疾病如腦血管疾病、心臟病、糖尿病、高血壓等慢性疾病，皆居台灣十大死因榜中第 2、3、4、 9 位，代謝症候群已經成為我國及世界之新興重要公共衛生議題。代謝症候群是指數個與心血管疾病及第 2 型糖尿病有關的危險因子群聚之代謝異常現象，包括腹部肥胖、高血壓、高血糖、血酯異常合併胰島素阻抗等群集。近年來科技及醫療的發達，人口的老化，人民生活習慣多趨向於缺乏運動、高脂等不當飲食、肥胖等等因素導致 1.

(14) 代謝症候群的發生率逐年增加。在衛生署統計發現肥胖男性已由過去 10 年的 33.4％上升到 50.8％，男性在身體質量指數 (BMI) 超過 24 的比例達 50％，且在腰圍、高密度脂蛋白和三酸甘油脂等都有顯著惡化現象；而女性肥胖率則由 31.7％上升到 36.9％，顯示肥胖人口越來越多是(2)，這是代謝症候群增加的一個主要原因。代謝症候群形成的機制並未完全釐清，根據Natali 及 Feeranini 兩人的研究，顯示胰島素阻抗 (insulin resistance) 是肥胖、高血糖、高血壓、及高血脂之間共同相連的因子(3)，胰島素阻抗使低密度脂蛋白. (Low-density lipoprotein; LDL) 轉化高密度脂蛋白. (High-density lipoprotein; HDL) 的脂蛋白脂酵素活性下降，結果造成 LDL 上升及 HDL 減少(4)，增高的 LDL 氧化容易造成動脈粥樣硬化，逐漸形成心血管疾病。 HDL (其組成成分如 apolipoproteins 和磷脂質)具有抗發炎、抗氧化、抗凝集及抗凝結等等作用，可以改善血管壁活性，減少動脈粥樣硬化的產生(5)。產生的動脈粥樣硬化逐漸形成心血管疾病，以及胰島素阻抗逐漸形成糖尿病，兩者進一步交互作用，糖尿病造成更進一步高脂血症加速腦血管疾病、心臟病及高血壓的產生(6-7)。先前研究顯示臺灣金線連水萃取物對正常飼料餵食的大鼠具有抗氧化作用、降高血糖及高血脂，在本論文中將以小鼠誘導糖尿病、. 2.

(15) 糖尿病合併高血脂及肥胖等動物模式探討，台灣金線連對心血管疾病之治療效果是否存在及可能作用機轉。. 3.

(16) 第二節台灣金線連文獻考察. 臺灣金線連. (Anoectochilus formosanus Hayata) 為蘭科. (Orchidaceae) 金線連屬 (Anoectochilus) 之小型地生蘭，屬多年生藥用植物，全草皆可入藥，是民間極珍貴藥材。金線連屬植物全世界超過 35 種，印度、喜馬拉雅山脈、東南亞各國、印尼、新喀里多尼亞以及夏威夷一帶皆有分佈，臺灣金線連則為臺灣特有種。台灣金線連 (Anoectochilus formosanus Hayata) 及金線蓮 (Anoectochilus roxburghii) 長期做為金線蘭要用植物的來源《全國中草藥匯編》，它在民間使用範圍較廣，幾百年來作為民間常用草藥(8)。其功用如下所述﹕ 一、藥性：味甘，性平。二、功能：清熱涼血，除濕解毒，平衡陰陽、扶正固本，陰陽互補、生津養顏、調和氣血、五臟、養壽延年的功用。三、歸經：入腎、心、肺三經，能全面提高人體免疫力，增強人體對疾病的抵抗力。. 4.

(17) 四、主治：肺熱咳嗽，肺結核咯血，尿血，小兒驚風，破傷風，腎炎水腫，風濕痺痛，跌打損傷，毒蛇咬傷、支氣管炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、急慢性肝炎、風濕性關節炎腫瘤等疑難病症，也兼除青春痘五、歷代醫書總結金線連驗方(9)如下所示﹕ 1. 風氣膝痛：金線連 6 g，老母雞 1 隻，黃酒半斤沖燉服。 2. 風濕性關節炎：金線連 15-20 g，雞 1 隻，偏寒者加酒燉，偏熱者加水加冰糖，飲湯，渣外擦痛處《福建藥物志》。 3. 風濕性關節炎：金線連乾品 30 g，猪肉 120 g ，燉熟，沖入黃酒適量， 2 次服完《溫州地市中草藥臨床經驗交流資料》。 4. 咳嗽痰稠：金線連鮮品 30 g ，冰糖 30 g ，開水沖燉服，早晚 2 次服完《溫州地市中草藥臨床經驗交流資料》。 5. 肝火同癆：金線連鮮品 15 g，冬蜜 15 g ，開水燉服。 6. 風溼性心臟病：金線連乾品 9 g ，瘦肉 30 g ，燉服。 7. 跌打損傷：金線連鮮品 30 g ，紅糖 15 g ，沖燉服，藥渣搗爛敷患處《福州市民間草藥》。 8. 肺癰、肺萎、咳血吐膿：金線連乾品 15 g ，冬瓜糖 30 g ，開水沖燉服。 9. 腎炎、膀胱炎：金線連 60 g ，冰糖少許燉服。. 5.

(18) 10. 毒蛇咬傷：金線連鮮品 3-6g ，冷開水洗淨，搗爛開水送下，另用鮮品搗爛外敷。 11. 小兒驚風：金線連 3 g ，水煎服。 12. 糖尿病：金線連 3-9 g 水煎服。. 一、藥用植物基原考察. 1. 臺灣金線連之植物學分類分類地位：植物界（Plantae）被子植物門（Angiospermae）單子葉植物綱（Monocotyledonae）蘭目（Orchidales）蘭科（Orchidaceae）金線連屬（Anoectochilus）臺灣金線連（Anoectochilus formosanus）. 2. 台灣金線連屬植物考察. 金線連屬植物全世界超過 35 種，印度、喜馬拉雅山脈、東南亞. 6.

(19) 各國、印尼、新喀里多尼亞以及夏威夷一帶皆有分佈，臺灣金線連則為臺灣特有種。臺灣金線連分布於臺灣全島海拔 500-1500 m左右的闊葉林床，北自台北縣的北插天山，新竹縣竹東，苗栗縣南庄、大湖，台中縣武陵農場、青山、谷關、白冷，南投縣仁愛鄉、蘆山、溪頭，嘉義縣吳鳳鄉，南至高雄縣旗山、扇平、阿卑縣，屏東縣霧台、來義、潮洲萬金庄、南仁山，東至台東縣中央山脈之水波、金山、太麻里、關山而至花蓮縣玉里、鳳林、太魯閣等陰濕身森林內皆可見其蹤跡( 10 ) 。. 台灣自產金線連屬之植物有四種: 臺灣金線連( Anoectochilus formosanus Hayata ) 單囊開唇蘭( Anoectochilus inabai Hayata ) 高雄金線連( Anoectochilus koshunensis Hayata ) 二囊開唇蘭( Anoectochilus lanceolatus Lindl ). 「金線連」為臺灣重要的民間用藥，其基源植物以臺灣金線連為主，亦使用高雄金線連（恆春金線連），作生藥時兩者皆可採用，以臺灣金線連供鮮食較為普遍，目前可由組織培養大量繁殖(圖 1-1)。. 3. 台灣金線連屬之形態及生長特性 7.

(20) 臺灣金線連 ( Anoectochilus formosanus Hayata ) 之植物形態株高 20 ~ 30 cm (圖 1-2)，花序高可達 14.5 ~ 26.5 cm，主根肥厚，長約 4 ~ 5 cm；不定根數平均為 3 ~ 4 條。莖圓筒狀，肉質，基部直徑 2.8 ~ 5.0 mm。葉分開互生於莖具平滑的金色或銀色線條，葉呈橢圓型或卵型，表面為暗綠色，葉背為紫紅色，葉長約 3-4 cm，葉寬約 2-3 cm，全株葉片數約 8 枚，成株則剩約 4 ~ 6 枚，先端尖銳，基部擴大呈圓形為鞘而抱垂。花數少，頂生有 3 ~ 4 朵之穗狀花序(圖 1-3)，花序柄紅褐色，有白色柔毛，柄上具 2 ~3 片披針形鞘狀苞。萼片數 3 個，微紅色，外密被柔毛，倒卵形長約 6 mm，寬約 5 mm，銳頭。上部萼片與二較少小花辮形成兜狀，側生的萼片卵狀橢圓形，長約 9 mm，寬約 5 mm，唇瓣長伸，已相當特化，外形與花瓣迴異，基部有一短距長約 5 mm，距內有二腺體，唇瓣前端裂成 2 尖瓣，每片長約 6 mm，其中段爪部有細絲狀構造，兩邊各約 6 條，長短不一，外形很像梳子。花柱較短，柱頭 2 個，花葯帽卵形，花粉塊微黃色，粉質。每年約 9 月抽苔， 10 ~ 11 月開花，未授粉的小花可持續到 12 月底才凋謝。高雄金線連( Anoectochilus koshunensis Hayata )另稱恒春金線連，其根莖葉等植株外部形態與臺灣金線連極為相似，兩者主要的差. 8.

(21) 別在於花數及唇瓣構造，臺灣金線連之花數較少而唇瓣爪部為深梳狀，距長約 5 mm。高雄金線連之花數較多，唇瓣爪部為非梳狀，距較長，約 1 cm。兩者其他的區別點在於高雄金線連之節數較多，節間較長，且莖徑較細，莖色紫紅，故顯的植株較高，株色較深。此外高雄金線連的葉片長及寬都較小。. 二、台灣金線連成分考察. 台灣金線連全植株所含之營養成分約有脂質 2.7%、蛋白質 2.2%、醣類 6.4%、灰份 1.0%及粗纖維 0.7%；另外，每 100 公克乾物重中含有約 125 毫克的維生素 C ；其餘像是鎂、鉀、鈉、磷及鈣含量約有 252、640、206、163 和 192 毫克，微量元素鐵、錳、鋅、銅也各含有 53、16、11 及 3 毫克(11)。. 台灣金線連成分目前被分離出的成分如下所示︰金線連糖苷. (kinsenoside) 及. 3-glucosyloxy-γ-butyrolactone acid. nicoloside 之化合物結構、. 、 3-glucosyloxy-4-isoproxybutyric. 、 3-glucopyranosyloxy-γ-butyrolactone 、 α-. (α-tocopherol) 與. β- 生育酚. 生育酚. (β-tocopherol) 、 campesterol 、. stigmasterol 、 β-sitosterol 、 isosrborinol 9. 、 gastrodigenin ；.

(22) p-hydroxybenzyl alcohol 、槲皮素 (quercetin) 、二氫槲皮素 (dihydroquercetin)、異鼠李素 (isorhamnetin) 、等黃酮類成分及特殊的金線連酮 trans-β-carotene. (kinsenone) 、 pheophytin a 、 linoleic acid 、 8-hydroxycoumarin. 、. 及. 1,2-di-2-furanyl-1,2-ethenediol 等成分。. 三、藥理活性考察. 1. 增強學習記憶力高雄金線連可以純化出天麻素. [gastrodin ；. 4-(β-d-glucopyranosyloxy)benzylalcohol]，江芙美等人(12)研究也顯示台灣金線連水萃物也含有相當量的天麻素及天麻元 (gastrodigenin；p-hydroxybenzyl alcohol) ，鄭浩元等人研究也顯示台灣金線連水萃物確能減弱東莨菪鹼誘發的健忘作用，增強學習記憶的能力(13)。. 2. 抗氧化作用徐麗芬等 (14) 人的研究指出台灣金線連含有黃酮類成分及特殊的金線連酮 (kinsenone) ，具有很強的抗氧化作用。台灣金線連水萃物也被證實有很好的清除含氧自由基的作用以 10.

(23) 及改善高血脂倉鼠低密度脂蛋白的氧化(15)，可以保護 HL-60. 細胞. 株因 H 2 O 2 氧化造成的凋亡(16)。. 3. 降高血糖及高血脂金線連糖及其它相關的三個化合物有降高血糖及高血脂的作用 (17-18). 。. 台灣金線連水萃取物也被證實對 streptozotocin 誘發的糖尿病大鼠有降低血糖、膽固醇及三酸甘油脂濃度(19)。. 4. 保肝台灣金線連水粗取物能降低四氯化碳及 acetaminophen 引起的大鼠急性肝炎(20-21)，也能保護大鼠初代肝細胞對抗四氯化碳引起的損傷(22)。施純青等人的實驗也證實台灣金線連水萃取物能改善四氯化碳及二甲基亞硝胺 (dimethylnitrosamine) 所引起的慢性肝炎 (23)，促進二甲基亞硝胺肝損傷後的肝臟再生(24)。. 5. 免疫調節作用曾金章等人研究顯示體外試驗，台灣金線連水萃物能增強鼷鼠腹腔吞噬細胞的吞噬作用(25)。蔣建興等人證實台灣金線連分離出中性與 11.

(24) 酸性多醣區分，對人體週邊血液單核細胞均具有刺激產生腫瘤致死因子 (TNF-α) 與間白素-2 (IL-2) 的作用(26)。張文潔等人研究顯示台灣金線連純化出免疫調節蛋白，能活化多種免疫細胞(27)。徐致芬等人研究也顯示，台灣金線連多醣分劃使其腹腔巨噬細胞的吞噬作用明顯上升，體外實驗也顯示該多醣分劃能活化 RAW264.7 巨噬細胞的吞噬作用及釋出 nitric oxide 、間白素-2、 γ-干擾素等(28)。台灣金線連有效萃取物對卵蛋白誘發小鼠呼吸道過度反應之免疫調節作用可能會透過 CD25+/CD4+T 細胞作用的影響而達到免疫抑制的效果(29)。. 6. 對腸道益生菌的影響曾金章等人 (25)及施純青等人 (30) 的研究指皆出台灣金線連水萃物可直接促進腸道乳酸桿菌數明顯增加。. 7. 抗腫瘤台灣金線連水萃取物可加速 MCF7 乳癌細胞凋亡(31)，可經由減少谷胱甘太的量而抑制肝癌細胞 HepG2 的生長(32) ，可以強烈抑制 CT-26 colon cancer cells 皮下移植到 BALB/c 小鼠的腫瘤活性(33) 。. 8. 抗發炎及抗過敏 12.

(25) 台灣金線連分離出 pheophytin a、linoleic acid、trans-β-carotene 三個有效成分對 n-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) 引發嗜中性白血球釋放 β-glucuronidase 和lysozyme 的體外試驗和 compound 48/80 引發肥胖細胞釋放 β-glucuronidase 和 histamine 的體外試驗均有顯著抑制作用 (34)。. 9. 對花生四烯酸 (Arachidonic acid) 的代謝影響臺灣金線連分離出. 8-hydroxycoumarin. 及. 1,2-di-2-furanyl-1,2-ethenediol 兩個能抑制血小板 thromboxane A2 產生(35)。臺灣金線連水萃取物有抑制血小板 thromboxane A2 產生及促進動脈內皮組織 prostaglandin I2 產生(36)。. 10. 抗病毒詹前朕等人(37)的研究指出臺灣金線連水萃取物能抑制A 型流行性感冒病毒在細胞內的表現。. 11. 改善骨質疏鬆台灣金線連水萃取物對能減少去卵巢大鼠造成體重增加、以及第四腰椎骨質疏鬆及骨鈣含量的減少均有改善作用 (38) 。 13.

(26) 12. 金線連糖苷 (kinsenoside) 藥理作用可由金線連屬 (Anoectochilus) 之台灣金線連 (Anoectochilus formosanus) 及金線連 (Anoectochilus roxburghii) 分離出產量最多之成分，目前研究被證實藥理作用如下所示： 1.保肝作用(39-40) (1). 經由抑制 Kupffer cells 活化而減少四氯化碳引起的肝損傷。 (2). 經由減少H 2 O 2 誘導小鼠肝細胞細胞毒性。 2. 抑制發炎反應作用(41) 抑制多醣內毒素引起巨噬細胞發炎反應及減少小鼠休克死亡。 3.抑制脂肪沉積作用(22) (1). 抑制高脂肪誘導大鼠肥胖。 (2). 抑制 aurothioglucose誘導小鼠肥胖(42) 。 (43). 4.降血糖作用. 減少 streptozotocin 誘導大鼠糖尿病，改善脂肪代謝混亂。. 14.

(27) 第三節代謝症候群與高血糖、高血脂肪及肥胖之關係一、代謝症候群定義：. 代謝症候群是指數個與心血管疾病和第 2 型糖尿病有關的危險因子群集之代謝異常現象，可以預測罹患心血管疾病和 2 型糖尿病的發生機率。腹部的肥胖與胰島素阻抗 (insulin resistance) 是形成代謝症候群最主要的因素. (43-45). ，缺乏運動(46)、老化(47)、賀爾蒙失調如. 多囊性卵巢症候群(48)及睪丸固酮分泌不足(49)也是形成的原因。代謝症候群的症狀最早是在 1923 年由 Kylin 提出高血壓，高血糖及痛風此 3 種疾病的群集為一種症候群，1988 年Reaven 首次提出 X症候群 (syndrome X)(50)，此症候群為心血管疾病的危險因子的群集，包括高血壓、葡萄糖耐受不良、高三酸甘油脂血症、高胰島素血症，及低的高密度膽固醇濃度，並指出與胰島素阻抗有關，1998 年世界衛生組織 (WHO) 把此症候群正式命名為代謝症候群 (51) 。. 二、代謝症候群重要性. 代謝症候群的盛行率全球快速成長，在美國約有 40%的成人到達 60 歲時會罹患代謝症候群(52)，至少有四分之一的歐洲成人會罹患代謝症候群(53-55)，拉丁美洲的成人至少有四分之一會罹患代謝症候群 (56). ，在亞洲國家如新加坡、中國、日本及韓國代謝症候群盛行率男. 性約 8%–13%，女性約 2%–18%(57-59)，在台灣大於 20 歲成年人代謝症候群盛行率約男性為 20.3%，女性為行率約 19.3%(60)。. 三、代謝症候群標準： 15.

(28) 根據行政院衛生署國民健康局 2007 判定標準(61)：成人（ 20 歲以上）代謝症候群為以下 5 項危險因子中，若包含 3 項或以上者可判定之，其判別標準如下所示：. 1. 腹部肥胖：(腰圍:男性 ≧ 90 cm、女性 ≧ 80 cm)。 2. 高血壓：收縮血壓 (SBP) ≧ 130 mmHg/ 舒張血壓 (DBP) ≧ 85 mmHg。 3. 高血糖：空腹血糖值 (FG) ≧ 100 mg/dl。 4. 高密度酯蛋白膽固醇 (HDL-C)：男性 < 40 mg/dl、女性 < 50 mg/dl。 5. 高三酸甘油酯 (TG) ≧ 150 mg/dl。. 四、代謝症候群與高血糖、高血脂及肥胖之關係：. 1. 盛行率之關係依據國民健康局 2002 年及 2007 年台灣地區高血壓、高血糖、高血脂之追蹤調查研究結果顯示，女性腰圍大於 80 公分比率由 28.1% 增為 41.9%；男性平腰圍大於 90 公分的比率由 27.7%增為 36.6%。肥胖的腹部脂肪組織將會影響身體代謝，導致血液三酸甘油脂濃度、血糖升高，增加罹患心血管疾病和糖尿病的風險。腹部肥胖的民眾，其未來罹患代謝症候群風險，將是一般人的 4 至 6 倍。另外在腹部肥胖者中，亦有 50％機率會罹患代謝症候群，而代謝症候群的民眾未來罹患「糖尿病」、「高血壓」、「高血脂症」、「心臟病及腦中風」的機率，分別為一般人的 6 倍、4 倍、3 倍、2 倍(62)。. 16.

(29) 2. 代謝症候群產生原因之相關人體脂肪分為兩種：一是皮下脂肪較穩定，不會釋放游離脂肪酸，所以相對穩定，一是內臟脂肪，腹部肥胖者內臟脂肪較活躍，釋放出較多的游離脂肪酸。如圖 1-4 所示，脂肪組織易釋放游離脂肪酸及脂肪激素. (Adipokines) ，脂肪激素形成易發炎狀態. (proinflammatory state)、易血栓狀態 (prothrombotic state) ，游離脂肪酸增加在骨骼肌細胞中抑制胰島素作用造成胰島素阻抗 (insulin resistance ; IR) 以及提升血中葡萄糖濃度，長期高游離脂肪酸產生脂肪細胞毒性促使胰臟β細胞功能受損，以及經由糖質新生作用使肝中葡萄糖輸出量增加 (hepartic glucose output; HGO) 使血中葡萄糖更加上升，肥胖形成高血壓機轉尚未明確，肥胖形成易發炎狀態經由促使IR產生使預先有傾向產生前期糖尿病 (prediabetes) ，肥胖會形成血漿中三酸甘油脂 (triglyceride;TG) 濃度上升及減少高密度脂蛋白 (High-density lipoprotein; HDL)，形成易發炎狀態及易血栓狀態 (prothrombotic state) 易造成動脈瘢形成，逐漸產生心血管疾病(63)。. 五、代謝症候群治療： 1. 生活型態的改變藉由飲食控制及運動減少體重治療代謝症候群，文獻顯示減少重量 7%導致形成糖尿病的機率下降 58% (64) 。 2. 藥物治療以降低低密度脂蛋白 (Low-density lipoprotein; LDL) 為主要目標臨床上常使用 Statins、Fibrates、Omega-3 Fatty Acids (Fish Oils) 及膽酸等降低 LDL 濃度，減少動脈瘢的形成。 17.

(30) Fig. 1-1.. 臺灣金線連組織培養 ( 圖片取自. http://ecaaser5.ecaa.ntu.edu.tw/weifang/lab551/plant1.htm)。. 18.

(31) Fig. 1-2.. 臺灣金線連移植培養土培養 ( 圖片取自. http://www.inks.com.tw/html/front/bin/partprint.phtml?Part=vivi990 311-01&Category=&Style=3). 19.

(32) Fig. 1-3.. 臺灣金線連穗狀花序 ( 圖片取自. http://www.afa.gov.tw/Forward.asp?tableName=Publish&CatID=285 9&NewsID=). 20.

(33) Fig 1-4 Metabolic pathways underlying metabolic syndrome(63).. 21.

(34) 第二章台灣金線連降血糖機轉之研究. 前言. 糖尿病分為 2 型，胰島素缺乏 (insulin-depedent) 及胰島素阻抗 (insulin-resistance) ，第 1 型 (type1) 形成原因複雜，其中可能牽涉環境、基因遺傳及自體免疫等引起 T 細胞調節發炎的因素所形成 (65-67). 。胰島素缺乏主要特徵為胰臟蘭氏小島 β 細胞壞死、單核細胞. 浸潤之發炎，產生的原因與遺傳學的傾向、男性增加易感受性及抗胰臟內分泌細胞免疫調節這些因素有關(68)。第 1 型 (type1) 糖尿病因 β 細胞被完全破壞造成胰島素缺乏，無法抑制脂肪分解(69)、增加肝醣輸出(70)及減少骨骼肌肉利用血糖(71)，結果造成高血糖。誘導糖尿病動物模式中，腹腔多次注射低劑量streptozotocin (STZ) 誘導小鼠胰臟引起免疫性發炎 (pancreatic insulitis) ，其病理特徵相似於人類第 1 型 (type1) 糖尿病(72-74)。. 台灣金線連 (Anoectochilus formosanus Hyata) (plant family: Orchidaceae) 是台灣昂貴的原物種生藥，被稱為藥王，具有多種藥效：如治療骨質疏鬆(75)、抗肥胖(42)、抗疲勞(76)及保肝作用等等，目前在台灣已經成功以組織培養、大量繁殖，並且成功推廣成高經濟農. 22.

(35) 作物。先前研究已經證實台灣金線連水萃取物 (AFE) 具有降血糖效果，但是降血糖機轉尚未明瞭，因此本篇研究目的在於進一步探討台灣金線水萃取物進一步分層的有效分劃 (AFEF) 對以低劑量多次投與小鼠 streptozotocin 誘導糖尿病降血糖作用是否仍在，以及探討可能的降血糖機轉。. 第一節研究材料與方法. 一、試藥與儀器 1. Roche: triglyceride, cholesterol, Glycated hemoglobin。 2. Sigma: streptozotocin, KOH, Na 2 SO 4 , glucose, lactose, sucrose, galactose, triton 100, sodium dddecyl sulfate(SDS) , choloform, isopropanol, tri base, bradford reagent, heparin, bovine serum albumin。 3. Wako：methanol。 4. Novo：NovoRapid®, NovoMix®50。 5. 中國化學製藥：Epinephrine。 6. 福壽公司：正常飼料。 7. Panreac ：Absolute alcohol。 8. Invitrogen：trizol 。. 23.

(36) 9. Fermentas：MMLV RT 套組，PCR Master 套組，Ethidium Bromide。 10. Promega：Agarose gel 。 11. Perkin Elmer：冷光試劑。 12. Intron：蛋白質萃取試劑。 13. Amersco： 40% Acrylamide/bis-acrylamide (37.5:1) , Ammonium persulfate. (APS). ,. N,N,N’,N’;-tetramethylenediamine. (TEMED)。 14. Santa-Cruz：anti-GLUT4 antibodies, Goat anti-Rabbit IgG。 15. 血糖機 (model 1500: SideKick Analyzer: YSI, Tellow Spring, OH, USA) 。 16. 自動生化分析儀器 (Cobas Mira; Roche) 。 17. 酸鹼度計 (TOA pH Meter HM-5S) 。 18. PCR system 9700 (Applied Biosystem) 。 19. 離心機 (KUBOTA 3500) 。 20. Spectrophtometer (Hitachi) 。 21. 影像分析軟體 Western blotting detection system (ECL Plus, Amersham)。 22. 影像分析軟體分析 (Alpha Digi Doc 1201) 。. 24.

(37) 二、台灣金線連水萃取物有效分劃製備過程 (AFEF) 台灣金線連購自埔里有容農場栽培種，基原經由中國醫藥大學中國藥學暨中藥資源學系確認，樣品以編號 CMCP 1253 保存。新鮮整株台灣金線連以水煎煮萃取濃縮後，以乙酸乙酯 (ethyl acetate) 分層後取水層，去除乙酸乙酯層，所得即為台灣金線連粗抽出物的有效分劃 (AFEF) ，經過減壓濃縮後可得到濃縮浸膏劑。台灣金線連鮮品1 kg 乾燥後剩 90 g， AFEF 產率為鮮品 2%(77) ，即得乾燥重量為 20 g，金線蓮糖苷 (kinsenoside) 經由 HPLC 測得含量為 180 mg /g (AFEF 乾燥重量)。. 三、動物購自於財團法人國家實驗研究院實驗動物中心雄性小黑鼠 (C57BL/6J) 10 週大，體重 24-26 g，飼養於溫度維持 22 ± 2°C，相對濕度 45 - 65% 和半日照環境中，自由飲水及進食標準飼料，小鼠分組每組 6-8 隻。. 四、AFEF 對正常小鼠血糖之影響小鼠分為後，控制組給予去離子水，實驗組分別口服給予AFEF 0.5 、 1.0 及 1.5 g/kg ，及正對照藥胰島素組 (皮下注射 1U/kg , NovoRapid®) 。投藥後第 0，1，2，3，4 小時由眼眶靜脈採血，測 25.

(38) 定血糖值。全血使用血糖機 (model 1500: SideKick Analyzer: YSI, Tellow Spring, OH, USA) 以葡萄醣氧化酵素方法測定血糖濃度。. 五、AFEF 對正常小鼠腹腔注射葡萄糖耐受性測試實驗前小鼠先禁食 4 小時，控制組給予去離子水，實驗組分別口服給予AFEF 0.5、1.0 及 1.5 g/kg，及正對照藥胰島素組(皮下注射 1U/kg, NovoRapid®) 。藥物投與後 30分鐘，腹腔注射葡萄糖溶液 (2 g/kg) 。於葡萄糖溶液注射後第 0、60、90、120、180 分鐘由眼眶靜脈採血，測定血糖值。. 六、AFEF 對正腎上腺素 (epinephrine) 誘導小鼠高血糖之影響小鼠分組後，控制組給予去離子水，實驗組分別口服給予 AFEF 0.5 、 1.0 及 1.5 g/kg ，及正對照藥胰島素組 ( 皮下注射 1U/kg, NovoRapid®)。投藥後第 30 分鐘腹腔注射 epinephrine 溶液 (1 mg/kg)，epinephrine注射後第 0、1、2 小時由眼眶靜脈採血，測定血糖值。. 七、糖尿病誘導小鼠連續 5 天腹腔注射 STZ 40 m g/kg 誘導小鼠糖尿病(72)，腹腔注射前，先將STZ 溶解於 50 mM 檸檬酸鈉緩衝液中 (pH 4.0) ， 26.

(39) 所製備溶液須在 5 分鐘內注射完畢，小鼠誘導 1 週後血糖過低者須追加 2 劑，誘導 3 週後由小鼠眼眶採血，測定空腹血糖值。糖尿病小鼠標準須達到空腹血糖大於 200 mg/dl 以上。 1. AFEF 對 STZ 誘導糖尿病小鼠血糖之急性影響糖尿病小鼠分組後，分別給予去離子水、AFEF 0.5、1.0 及 1.5 g/kg 及對照藥物(皮下注射胰島素 3U/kg, NovoRapid®) 。於投藥後第 0、60、90、120、180、240 分鐘由眼眶採血，測定血糖值。. 2. AFEF 對 STZ 誘導糖尿病小鼠血糖之影響糖尿病小鼠分組後，分別給予去離子水、AFEF 0.5、1.0 及 1.5 g/kg 及對照藥物(皮下注射胰島素 5U/kg, NovoMix®50) 。每天 1 次為期 6 週。6 週後小鼠在乙醚麻醉下由腹腔靜脈採血(加入抗凝血劑)，取出肝，小腸，後腿冰凍保存，供進一步分析。. 3. 血漿中三酸甘油脂 (triglyceride) 及膽固醇 (cholesterol) 及糖化血紅素 (HbA1c) 全血離心 10 分鐘 (2100g, 4°C) 後，取上層液，使用自動生化分析儀器 (Cobas Mira; Roche) 以市售試劑 (Roche Diagnostics) 測定三酸甘油脂及總膽固醇。沉澱之血球加入生理食水混合、離心後，去除上清液，重複 3 次後將血球稀釋以市售試劑組 (Sigma Diagnostics) 27.

(40) 測定糖化血紅素。. 4. 肝中三酸甘油脂及肝醣之測定肝臟均質後測定肝中三酸甘油脂及肝糖含量。肝中三酸甘油脂含量以 Nassir 等人方法測定. (78). ，先將肝臟加入有機溶劑. chloroform-methanol (2:1) 後，以均質機均質、萃取後，以氮氣吹乾，乾燥物再溶解於異丙醇 (isopropanol) ，以市售三酸甘油脂測定試劑 (Roche) ，使用自動生化分析儀器測定。肝醣以 Lo 等人方法測定 (79). ，先將均漿加入 30% KOH 以 Na 2 SO4 飽和，煮沸 30 分鐘時間. 分解均漿，冷卻後再加入乙醇沉澱，沉澱物加入硫酸水解肝醣，分解的葡萄糖以分光光度計儀器測量。. 5. 小腸雙糖酵素測定以 Messer 和 Dahlqvist 的方法加以修飾後測定小腸乳糖、蔗糖及半乳糖分解酵素活性(80)。先將小腸黏膜均漿，分別加入乳糖、蔗糖及半乳糖於 37°C靜置 30 分鐘，分解的葡萄糖以血糖機器測定。小腸蛋白質以 Lowry 等人的方法測定(81)。. 6. 西方墨點分析骨骼肌肉葡萄糖轉運蛋白第 4 型 (glucose transporter type 4; GLUT4) 之蛋白質含量 28.

(41) 骨骼肌肉 GLUT4 蛋白質的表現以西方墨點法分析(82-83)，其步驟如下所示﹕. (1). 蛋白質萃取液態氮冰凍的組織 0.1 克加入蛋白質萃取試劑後，將組織均質後，置於冰上 30 分鐘，離心 1 小時 (38,000 rpm, 4°C) 後，取上清液即可。. (2). 蛋白質定量以胎牛血清蛋白質為標準品，稀釋為 0，5，10，25，50，100 μg/ml ，加入 200 μl Bradford 試劑，以波長 595 nm 測定吸光值，求出標準曲線 (standard curve ) ，蛋白質樣品以此檢量線計算濃度，並乘以稀釋倍數，以求得實際蛋白質濃度。. (3). 變性電泳 (SDS-PAGE) (12.5% 上膠層 (5%. 組成. 下膠層. (2 片膠量). Separation gel). Stacking gel). DDW. 2.15 ml. 3.65 ml. 1.5M Tris (pH=8.8). 2.1 ml. -. 0.5M Tris (pH=6.8). -. 625 μl. 10% SDS. 3.125 ml. 625 μl 29.

(42) 40% Acrylamide/Bis. 75 μl. 50 μl. 37.5 μl. 50 μl. 37.5 μl. 5 μl. (39:1) 10% Ammonium Persulfate(APS) TEMED. 上下 2 片膠體鑄好後，將樣品與樣品緩衝液混合總體積10 μl，上層蛋白質 (40 μg/10μl) ， 100°C 加熱 5 分鐘後，待冷卻，即可將樣品注入樣品槽中，以 150 伏特 (V) 跑 1 小時。. (4). 轉漬 (transfer) 將海綿及 3M 濾紙在轉漬緩衝液內浸濕， PVDF 轉漬膜以甲醇潤濕 15 秒，再浸泡於轉漬緩衝液，依序放上海綿、濾紙、膠片、 PVDF 轉漬膜、濾紙、海綿組成類似三明治結構，小心去除氣泡，放入轉漬夾，以 50 伏特， 300 mA ，1 小時為條件，進行蛋白質轉漬。將轉漬膜浸泡於 5%脫脂奶(溶於 0.1% tween 20/TBS 緩衝溶液) 室溫 1 小時進行阻斷非特異性反應步驟，以 0.1% tween 20/TBS 緩衝液清洗 5 分鐘，重複 3 次，取封口袋放入 2 ml 脫脂奶(溶於 0.1% tween 20/TBS 緩衝溶液) 加入 anti-GLUT4 抗體培養隔夜 (4°C) ，以 0.1% 0.1% tween 20/TBS 緩衝液清洗 5 分鐘，重複 3 30.

(43) 次，取封口袋放入 2 ml 脫脂奶(溶於 0.1% tween 20/TBS 緩衝溶液) 加入 Goat anti-Rabbit IgG 加入培養 1 小時 (37°C) ，以 0.1% 0.1% tween 20/TBS 緩衝液清洗 5 分鐘，重複 3 次，以 TBS 緩衝液清洗 5 分鐘後進行壓片，以柯達底片感光，之後放進顯影劑顯影，清水沖洗 1 分鐘，放入定影劑 3 分鐘，清水沖洗後底片晾乾，以影像分析軟體. Western blotting detection system (ECL Plus,. Amersham)測量，然後以NIH image program 定量強度大小。. 7、反轉錄聚合酵素鏈鎖反應 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 分析肝中及骨骼肌肉中. mRNA. 以. acid. guanidum. thiocyanate –phenol -chloroform(84) 萃取方式分離，其步驟如下所示：. (1). 肝中及骨骼肌肉中 mRNA 萃取取液態氮冰凍的肝中及骨骼肌肉組織 0.1克加入 1 mL trizol 試劑，將組織均質後，離心 (3700g、4°C) 10 分鐘後，取上清液加入 0.2 ml 氯仿 (choloroform) 劇烈震盪 15 秒後，靜置冰上 3 分鐘，離心 15 分鐘 (14700g、4°C) 後取上清液加入異丙醇 (isopropanol) 混合後靜置冰上 10 分鐘使 RNA 沉澱，再離心 10 分鐘後 (14700g、4°C) 留下沉澱物加入 75%酒精，靜置冰箱 30 分鐘(負 31.

(44) 30°C) ，離心 5 分鐘後 (9100g, 4°C) 倒掉上清液，加入適量 DEPC 水將 RNA 溶解，於波長 260nm 測定吸光值，計算 RNA 濃度。. (2). 合成 cDNA cDNA 的製備主要是採用 MMuLV reverse transcriptase (first strand cDNA systhesis) ，使用 MMuLV RT 套組， AMPK, GLUT4 及 PEPCK 的引子配對參照 Manoucheri et al 的設計(85)。取 1 μg mRNA 加入 1 μl the primer pairs，10μl DEPC 水，再加入 4 μl 5X MMLV RT 緩衝液、2 μl MMLV RT、2 μl 10 mM dNTP，混合後於 37°C反應 60 分鐘。. (3). 聚合酵素鍊鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 利用 PCR Master Mix 套組，將特定 cDNA 量化，取去離子水 9.5 μl、PCR Master Mix 12.5 μl、1 μl 10 mM 引子 (primer)、1 μl cDNA，反應過程為 5 分 at 95°C、30 sec at 95°C, 30 sec at 55°C and 30 sec at 72°C for 32 cycles in a Perkin Elmer 9700 Gene Amp PCR system.. (4). 確認DNA結果取5 μL cDNA 產物加入1 μl 6x DNA loading dye，以混合. 32.

(45) Ethidium Bromide 的 2%洋菜膠 (Agarose gel)，50 伏特、50 分鐘跑膠，結束後在暗箱以紫外線照射及攝影，以影像分析軟體分析 (Alpha Digi Doc 1201) ，每一樣品基因表現均會以 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA. 表現. 強度作對比，比值為目標基因/GAPDH，再以控制組表現為基準值，分析組別之間的表現差異。. 8. 統計分析(Statistical analysis) 數據結果以平均值(mean) ± 標準偏差 (standard diviation, SD) 表示，使用單尾變異數分析 (one-way analysis of variance) 及 Dunnett. 測試， p <0.05. 表示在統計學上具有顯著差異。. 第二節研究結果. 一、AFEF 對正常小鼠血糖之影響如表 2-2 所示，口服 AFEF 0.5、1.0 及 1.5 g/kg body weight 對小鼠血糖值沒有影響，但胰島素 (1 U/kg body weight) 皮下注射後第 1、2、3、4 小時明顯使血糖濃度下降 (p<0.05)。. 二、AFEF 對正常小鼠腹腔注射葡萄糖耐受性測試. 33.

(46) 如表 2-3 所示，控制組小鼠注射葡萄糖溶液後 30 分鐘血糖明顯上升，然後逐漸下降。給予 AFEF (1.0 及 1.5 g/kg body weight) 及胰島素 (1 U/kg body weight) 能降低血糖濃度之上升，且持續至 120 分鐘，降糖效果以胰島素最強。. 三、AFEF 對 Epinephrine 誘導小鼠高血糖之影響結果如表 2-4 所示，控制組小鼠腹腔注射 epinephrine 後 1 小時血糖升高至 336.8 ± 13.6 mg/dl ，口服 AFEF 0.5、1.0 及 1.5 g/kg body weight 無法將升高的血糖下降，但胰島素 (1U/kg body weight) 可以明顯減少 epinephrine 誘導的高血糖至 47.5 ± 14.6 mg/dl (p<0.01)。. 四、AFEF 對 STZ 誘導糖尿病小鼠血糖之影響 1. AFEF 對 STZ 誘導糖尿病小鼠血糖之急性影響如表 2-5 所示，STZ + H 2 O 組小鼠血糖上升至 285.1 ± 24.5 mg/dl，單次投與 AFEF 1.0 及 1.5 g/kg body weight 後的第 1 小時及 2 小時可以明顯降低糖尿病小鼠血糖濃度，對照組胰島素 (3 U/kg body weight) 單次皮下注射後第 0、1、2、3、4 小時皆可以明顯降低糖尿病小鼠血糖。降血糖效果以胰島素最強。. 34.

(47) 2. AFEF 對 STZ 誘導糖尿病小鼠血糖之慢性影響 (1). 血糖結果如表 2-6 所示，STZ + H 2 O 組小鼠血糖明顯上升，長期投與 AFEF 1.0 及 1.5 g/kg body weight 及胰島素 5 U/kg body weight，在第 7、14、28、 42 天測量空腹血糖，皆明顯降低糖尿病小鼠的血糖，而降糖效果仍以胰島素最強。. (2). 血漿中三酸甘油脂及膽固醇及糖化血紅素 STZ 誘導糖尿病小鼠三酸甘油脂 (圖 2-1 ) 、膽固醇 (圖 2-2 ) 及糖化血紅素(圖 2-3 )明顯上升，長期投與AFEF 1.0 及 1.5 g/kg body weight 及胰島素 5U/kg body weight 可以明顯降低糖尿病小鼠糖化血紅素及三酸甘油脂濃度。AFEF 1.0 及 1.5 g/kg body weight 可以明顯降低糖尿病小鼠血漿中膽固醇濃度，但是胰島素 5 U/kg body weight 對糖尿病小鼠升高血漿中膽固醇濃度則無影響。上述結果顯示 AFEF 1.0 及 1.5 g/kg body weight 降低糖尿病小鼠血漿中三酸甘油脂及膽固醇的強度大於胰島素 5 U/kg body weight。. (3). 肝中三酸甘油脂及肝醣含量如圖 2-4 所示， STZ 誘導糖尿病小鼠肝臟中三酸甘油脂濃度比控制組小鼠低，長期投與 AFEF 1.5 g/kg body weight 肝臟中三酸甘 35.

(48) 油脂濃度並無明顯回復作用。長期投與胰島素 5 U/kg body weight，肝臟中三酸甘油脂含量明顯回復。如圖 2-5 所示， STZ 誘導糖尿病小鼠肝臟中肝醣含量與控制組比較沒有差異，長期投與 AFEF 1.0 及 1.5 g/kg body weight，肝臟中肝糖含量明顯更低於糖尿病小鼠肝臟中肝醣含量。長期投與胰島素 5 U/kg body weight 肝臟中肝糖含量明顯較糖尿病小鼠肝臟中肝醣含量高。上述結果顯示 AFEF 與胰島素降血糖效果於肝臟的作用並不相同。. (4). 小腸雙糖酵素結果如表 2-7 所示，小腸乳糖、蔗糖及半乳糖分解酵素在控制組及糖尿病組並無差異性。投與 AFEF 或胰島素與糖尿病小鼠並無統計上差別. (5). 骨骼肌 GLUT4 蛋白之表現如圖 2-6 所示， STZ 誘導糖尿病小鼠骨骼肌中 GLUT4 蛋白表現量明顯較控制組低，長期投與 AFEF (0.5, 1.0, 及 1.5 g/kg body weight) 及胰島素明顯增加糖尿病小鼠骨骼肌中 GLUT4 蛋白表現量。. 36.

(49) (6). 骨骼肌 AMPK 及 GLUT4 及肝臟 PEPCK mRNA 的表現如圖 2-7 所示，糖尿病小鼠骨骼肌中 AMPK/GAPDH 、 GLUT4/GAPDH 比值比控制組低。長期投與 AFEF 1.5 g/kg body weight 及胰島素明顯增加糖尿病小鼠 AMPK 及GLUT4 mRNA 的表現量。如圖 2-8 所示，糖尿病小鼠肝臟中 PEPCK /GAPDH 比值和控制組比較沒有差異，長期投與 AFEF 1.5 g/kg body weight 能夠增加糖尿病小鼠PEPCK mRNA 表現量，胰島素則無此效果。. 第三節討論. 本篇研究顯示口服投與 AFEF 不會影響正常小鼠血糖，而胰島素對正常小鼠降血糖效果明顯。腹腔葡萄糖耐受性試驗中，單一劑量 AFEF 及胰島素投與可以減少葡萄糖誘導之血糖上升，同樣也可以減少 STZ 誘導糖尿病空腹高血糖。長時間投與 AFEF 可以減少糖尿病小鼠升高的血糖、三酸甘油脂、膽固醇、及糖化血紅素。長時間投與胰島素可減少糖尿病小鼠升高的血糖，糖化血紅素，三酸甘油脂，但是無法減少升高的膽固醇，這些結果顯示 AFEF 對糖尿病小鼠具有降血糖作用，但是藥效強度遠小於胰島素。. 37.