第二章 台灣金線連降血糖機轉之研究
第一節 ：研究材料與方法
一、試藥與儀器
1. Roche: triglyceride, cholesterol, Glycated hemoglobin。
2. Sigma: streptozotocin, KOH, Na2SO4, glucose, lactose, sucrose, galactose, triton 100, sodium dddecyl sulfate(SDS) , choloform, isopropanol, tri base, bradford reagent, heparin, bovine serum albumin。
3. Wako：methanol。
4. Novo：NovoRapid®, NovoMix®50。
5. 中國化學製藥：Epinephrine。
6. 福壽公司：正常飼料。
7. Panreac ：Absolute alcohol。
8. Invitrogen：trizol 。
9. Fermentas：MMLV RT 套組，PCR Master 套組，Ethidium Bromide。
10. Promega：Agarose gel 。 11. Perkin Elmer：冷光試劑 。 12. Intron：蛋白質萃取試劑。
13. Amersco： 40% Acrylamide/bis-acrylamide (37.5:1) , Ammonium persulfate (APS) , N,N,N’,N’;-tetramethylenediamine (TEMED)。
14. Santa-Cruz：anti-GLUT4 antibodies, Goat anti-Rabbit IgG。
15. 血糖機 (model 1500: SideKick Analyzer: YSI, Tellow Spring, OH, USA) 。
16. 自動生化分析儀器 (Cobas Mira; Roche) 。 17. 酸鹼度計 (TOA pH Meter HM-5S) 。 18. PCR system 9700 (Applied Biosystem) 。 19. 離心機 (KUBOTA 3500) 。
20. Spectrophtometer (Hitachi) 。
21. 影像分析軟體 Western blotting detection system (ECL Plus, Amersham)。
22. 影像分析軟體分析 (Alpha Digi Doc 1201) 。
二、台灣金線連水萃取物有效分劃製備過程 (AFEF)
台灣金線連購自埔里有容農場栽培種，基原經由中國醫藥大學中
國藥學暨中藥資源學系確認，樣品以編號 CMCP 1253 保存。新鮮
整株台灣金線連以水煎煮萃取濃縮後，以乙酸乙酯 (ethyl acetate) 分
層後取水層，去除乙酸乙酯層，所得即為台灣金線連粗抽出物的有效
分劃 (AFEF) ，經過減壓濃縮後可得到濃縮浸膏劑。台灣金線連鮮
品1 kg 乾燥後剩 90 g， AFEF 產率為鮮品 2%(77) ，即得乾燥重量
為 20 g， 金線蓮糖苷 (kinsenoside) 經由 HPLC 測得含量為 180
mg /g (AFEF 乾燥重量)。
三、動物
購 自 於 財 團 法 人 國 家 實 驗 研 究 院 實 驗 動 物 中 心 雄 性 小 黑 鼠
(C57BL/6J) 10 週大，體重 24-26 g，飼養於溫度維持 22 ± 2°C，相 對濕度 45 - 65% 和半日照環境中，自由飲水及進食標準飼料，小鼠
分組每組 6-8 隻。
四、AFEF 對正常小鼠血糖之影響
小鼠分為後，控制組給予去離子水，實驗組分別口服給予AFEF
0.5、1.0 及 1.5 g/kg，及正對照藥胰島素組(皮下注射 1U/kg , NovoRapid®) 。投藥後第 0，1，2，3，4 小時由眼眶靜脈採血，測
定血糖值。全血使用血糖機 (model 1500: SideKick Analyzer: YSI,
Tellow Spring, OH, USA) 以葡萄醣氧化酵素方法測定血糖濃度。
五、AFEF 對正常小鼠腹腔注射葡萄糖耐受性測試
實驗前小鼠先禁食 4 小時，控制組給予去離子水，實驗組分別
口服給予AFEF 0.5、1.0 及 1.5 g/kg，及正對照藥胰島素組(皮下注射
1U/kg, NovoRapid®) 。藥物投與後 30分 鐘，腹腔注射葡萄糖溶液 (2 g/kg) 。於葡萄糖溶液注射後第 0、60、90、120、180 分鐘由眼 眶靜脈採血，測定血糖值。
六、AFEF 對正腎上腺素 (epinephrine) 誘導小鼠高血糖之影響
小鼠分組後，控制組給予去離子水，實驗組分別口服給予 AFEF
0.5 、 1.0 及 1.5 g/kg ， 及 正 對 照 藥 胰 島 素 組 ( 皮 下 注 射 1U/kg, NovoRapid®)。投藥後第 30 分鐘腹腔注射 epinephrine 溶液 (1 mg/kg)，epinephrine注射後第 0、1、2 小時由眼眶靜脈採血，測定 血糖值。
七、糖尿病誘導
小鼠連續 5 天腹腔注射 STZ 40 m g/kg 誘導小鼠糖尿病(72)，腹
腔注射前，先將STZ 溶解於 50 mM 檸檬酸鈉緩衝液中 (pH 4.0) ，
所製備溶液須在 5 分鐘內注射完畢，小鼠誘導 1 週後血糖過低者須
追加 2 劑，誘導 3 週後由小鼠眼眶採血，測定空腹血糖值。糖尿病
小鼠標準須達到空腹血糖大於 200 mg/dl 以上。
1. AFEF 對 STZ 誘導糖尿病小鼠血糖之急性影響
糖尿病小鼠分組後，分別給予去離子水、AFEF 0.5、1.0 及 1.5
g/kg 及對照藥物(皮下注射胰島素 3U/kg, NovoRapid®) 。於投藥後 第 0、60、90、120、180、240 分鐘由眼眶採血，測定血糖值。
2. AFEF 對 STZ 誘導糖尿病小鼠血糖之影響
糖尿病小鼠分組後，分別給予去離子水、AFEF 0.5、1.0 及 1.5
g/kg 及對照藥物(皮下注射胰島素 5U/kg, NovoMix®50) 。每天 1 次為期 6 週。6 週後小鼠在乙醚麻醉下由腹腔靜脈採血(加入抗凝血
劑)，取出肝，小腸，後腿冰凍保存，供進一步分析。
3. 血漿中三酸甘油脂 (triglyceride) 及膽固醇 (cholesterol) 及糖化 血紅素 (HbA1c)
全血離心 10 分鐘 (2100g, 4°C) 後，取上層液，使用自動生化分
析儀器 (Cobas Mira; Roche) 以市售試劑 (Roche Diagnostics) 測定
三酸甘油脂及總膽固醇。沉澱之血球加入生理食水混合、離心後，去
除上清液，重複 3 次後將血球稀釋以市售試劑組 (Sigma Diagnostics)
測定糖化血紅素。
4. 肝中三酸甘油脂及肝醣之測定
肝臟均質後測定肝中三酸甘油脂及肝糖含量。肝中三酸甘油脂含
量 以 Nassir 等 人 方 法 測 定 (78) ， 先 將 肝 臟 加 入 有 機 溶 劑 chloroform-methanol (2:1) 後，以均質機均質、萃取後，以氮氣吹乾，
乾燥物再溶解於異丙醇 (isopropanol) ，以市售三酸甘油脂測定試劑
(Roche) ，使用自動生化分析儀器測定。肝醣以 Lo 等人方法測定
(79)，先將均漿加入 30% KOH 以 Na2SO4 飽和，煮沸 30 分鐘時間 分解均漿，冷卻後再加入乙醇沉澱，沉澱物加入硫酸水解肝醣，分解
的葡萄糖以分光光度計儀器測量。
5. 小腸雙糖酵素測定
以 Messer 和 Dahlqvist 的方法加以修飾後測定小腸乳糖、蔗糖
及半乳糖分解酵素活性(80)。先將小腸黏膜均漿，分別加入乳糖、蔗糖
及半乳糖於37°C靜置 30 分鐘，分解的葡萄糖以血糖機器測定。小腸 蛋白質以 Lowry 等人的方法測定(81)。
6. 西 方 墨 點 分 析 骨 骼 肌 肉 葡 萄 糖 轉 運 蛋 白 第 4 型 (glucose transporter type 4; GLUT4) 之蛋白質含量
骨骼肌肉 GLUT4 蛋白質的表現以西方墨點法分析(82-83)，其步驟
40% Acrylamide/Bis
次，取封口袋放入 2 ml 脫脂奶(溶於 0.1% tween 20/TBS 緩衝溶液)
加入 Goat anti-Rabbit IgG 加入培養 1 小時 (37°C) ，以 0.1%
0.1% tween 20/TBS 緩衝液清洗 5 分鐘，重複 3 次，以 TBS 緩衝 液清洗 5 分鐘後進行壓片，以柯達底片感光，之後放進顯影劑顯影，
清水沖洗 1 分鐘，放入定影劑 3 分鐘，清水沖洗後底片晾乾，以影
像 分 析 軟 體 Western blotting detection system (ECL Plus, Amersham)測量，然後以NIH image program 定量強度大小。
7、反轉錄聚合酵素鏈鎖反應 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 分析
肝 中 及 骨 骼 肌 肉 中 mRNA 以 acid guanidum thiocyanate –phenol -chloroform(84) 萃取方式分離，其步驟如下所示：
(1). 肝中及骨骼肌肉中 mRNA 萃取
取液態氮冰凍的肝中及骨骼肌肉組織 0.1克 加入 1 mL trizol
試劑，將組織均質後，離心 (3700g、4°C) 10 分鐘後，取上清液加入
0.2 ml 氯仿 (choloroform) 劇烈震盪 15 秒後，靜置冰上 3 分鐘，
離心 15 分鐘 (14700g、4°C) 後取上清液加入異丙醇 (isopropanol)
混 合 後 靜 置 冰 上 10 分 鐘 使 RNA 沉 澱 ， 再 離 心 10 分 鐘 後 (14700g、4°C) 留下沉澱物加入 75%酒精，靜置冰箱 30 分鐘(負
30°C) ，離心 5 分鐘後 (9100g, 4°C) 倒掉上清液，加入適量 DEPC 水將 RNA 溶解，於波長 260nm 測定吸光值，計算 RNA 濃度。
(2). 合成 cDNA
cDNA 的製備主要是採用 MMuLV reverse transcriptase (first strand cDNA systhesis) ，使用 MMuLV RT 套組， AMPK, GLUT4 及 PEPCK 的引子配對參照 Manoucheri et al 的設計(85)。取 1 μg
mRNA 加入 1 μl the primer pairs，10μl DEPC 水，再加入 4 μl 5X MMLV RT 緩衝液、2 μl MMLV RT、2 μl 10 mM dNTP，混合後於 37°C反應 60 分鐘。
(3). 聚合酵素鍊鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)
利用 PCR Master Mix 套組，將特定 cDNA 量化，取去離子水
9.5 μl、PCR Master Mix 12.5 μl、1 μl 10 mM 引子 (primer)、1 μl cDNA，反應過程為 5 分 at 95°C、30 sec at 95°C, 30 sec at 55°C and 30 sec at 72°C for 32 cycles in a Perkin Elmer 9700 Gene Amp PCR system.
(4). 確認DNA結果
取5 μL cDNA 產物 加入1 μl 6x DNA loading dye，以混合
Ethidium Bromide 的 2%洋菜膠 (Agarose gel)，50 伏特、50 分鐘 跑膠，結束後在暗箱以紫外線照射及攝影，以影像分析軟體分析
(Alpha Digi Doc 1201) ， 每 一 樣 品 基 因 表 現 均 會 以 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA 表現 強度作對比，比值為目標基因/GAPDH，再以控制組表現為基準值，
分析組別之間的表現差異。
8. 統計分析(Statistical analysis)
數據結果以平均值(mean) ± 標準偏差 (standard diviation, SD)
表 示 ， 使 用 單 尾 變 異 數 分 析 (one-way analysis of variance) 及 Dunnett 測試， p <0.05 表示在統計學上具有顯著差異。