行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
水溶性幾丁聚醣衍生物之抗菌作用及其於食品保存上之應
用(3/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2313-B-002-074- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學食品科技研究所 計畫主持人： 周正俊 報告類型： 完整報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 12 月 14 日
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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
水溶性幾丁聚醣衍生物之抗菌作用及其於食品保存上之應用 (3/3)
計畫編號：92-2313-B-002-074-
執行期限：90 年 8 月 1 日至 93 年 7 月 31 日
主持人：周正俊 國立台灣大學食品科技研究所
一、中文摘要 本研究探討幾丁聚醣雙醣 (麥芽糖、乳 糖與纖維雙醣) 之抗菌活性進行探討。結 果發現，不同種類雙醣與取代程度 (DS 20-30%，30-40%，40-50%) 的幾丁聚醣雙 醣 衍 生 物 對 於 Escherichia coli 和 Staphylococcus aureus CCRC 1116 均有顯 著性的抗菌作用。其中以幾丁聚醣麥芽糖 衍生物（取代程度為 30-40 %）對 Sta. aureus 的抗菌活性最強。對 E. coli，則以幾丁聚 醣纖維雙醣衍生物（取代程度為 30-40 %） 的抗菌活性最強。進一步以取代程度 30-40 ％ 之幾丁聚醣雙醣衍生物對三株病原菌：E. coli O157: H7 933 、 Listeria
monocytogenes ScottA 和 Salmonella
typhimurium 進行測試，也顯現出不同程度 之抗菌效果。金屬離子會降低幾丁聚醣麥 芽糖衍生物對 E. coli O157: H7 933 之抗菌 活性。其影響的強度依序為 Ba2+, Na+ > Ca2+ > Mg2+。此外隨著金屬離子濃度的提高其 降低幾丁聚醣麥芽糖衍生物抗菌活性之情 形也愈顯著。 進一步以 S. aureus CCRC 12657 為 試驗菌株進行探討，發現幾丁聚醣乳糖衍 生物濃度在 0~500 ppm 範圍內，對 S. aureus CCRC 12657 之抗菌活性隨著幾丁 聚醣乳糖衍生物濃度之增加而上升；其後 雖然濃度再提高但抗菌活性並無顯著上 升。幾丁聚醣乳糖衍生物之抗菌效果會因 溫度、pH 及菌體菌齡之不同而有差異。在 37 ℃ 時 所 表 現 之 抗 菌 效 果 比 在 低 溫 時 (5、22℃ 為佳，且抗菌效果在 pH 6.5 及 ) 7.0 比 在 pH 6.0 及 7.5 強 。 S. aureus CCRC 12657 菌齡對幾丁聚醣乳糖衍生物 之敏感性，依序分別為對數期末期、定常 期及對數期中期者。幾丁聚醣雙醣衍生物 會干擾菌體細胞膜之結構，造成胞內 280 nm 吸 光 物 質 之 洩 漏 ， 並 且 能 抑 制 S. aureus CCRC 12657 腸毒素之產生。加入 500 及 1000 ppm 之幾丁聚醣乳糖衍生物 於碎豬肉中，可抑制碎豬肉中細菌在 5 及 22℃ 之生長。經處理之碎豬肉在貯存期間 其總生菌數、金黃色葡萄球菌及低溫菌數 皆比未處理者低，具有保鮮之功效 。 關鍵字：幾丁聚醣, 雙醣衍生物， 抗菌活 性， pH， 溫度， 濃度 二、英文摘要
This study was conducted to investigate the antimicrobial activity of disaccharide (maltose, lactose, cellobiose) chitosan derivatives. Results revealed that the derivatives, regardless of the kinds of disaccharide linked to the chitosan molecule and degree of substitution (DS), exhibited marked antimicrobial activity against
Escherichia coli and aureus CCRC 1116. E. coli and S. aureus were most susceptible
to cellobiose chitosan derivative with DS 30-40 % and maltose chitosan derivative with DS 30-40 %, respectively, among the various chitosan derivatives examined. The chitosan derivatives were also found to examine various extents of antimicrobial activity on pathogens including E. coli O157: H7 933, Salmonella typhimurium and
Listeria monocytogenes ScottA. Metal ion
reduced the antibacterial activity of the maltose chitosan derivatives on E. coli O157: H7 933, the order of effectiveness being Ba2+, Na+ > Ca2+ > Mg2+. Besides, as the concentration of salt solution increased, the antibacterial activity of the maltose chitosan derivatives reduced.
Further study with chitosan lactose derivative on S. aureus CCRC 12657 revealed that the antimicrobial activity increased as the concentration of chitosan derivative increased up to 500 ppm. Further increasing the concentration of the derivative did not increase the antimicrobial activity. Temperature, pH and cell age were found to affect the antimicrobial of chitosan lactose derivative against S. aureus. The antimicrobial activity was stronger at 37℃ than at 5 and 22℃, in pH 6.5 and 7.0 than in pH 6.0 and 7.5 environment. Furthermore, cell of S. aureus in the late exponential phase were most susceptible to the chitosan derivative followed by cells in the stationary phase and mid-exponential phase. It was also noted that chitosan derivatives interfered the structure of cell membrane and caused the release of 280-nm-absorbing materials from
S. aureus cells. Addition of 500 and 1000
ppm chitosan lactose derivative to raw ground pork stored at 5 and 22℃ was found to retard the growth of bacteria. During storage period, counts of total bacterial, S.
aureus, and psychrotrophic bacteria noted
in raw ground pork added with chitosan derivative were lower than those observed in ground pork without chitosan derivative.
Key word: Disaccharide chitosan derivative,
Antimicrobial activity, pH, Temperature, Concentration. 二、緣由與目的 幾丁質 (chitin) 在自然界分布十分廣 泛，數量僅次於纖維素 (cellulose)，主要存 在於動植物及真菌中 (Knorr, 1982)。據估 計，全球每年幾丁質的產量約十五萬公 噸 ， 是 現 今 不 容 忽 視 的 天 然 資 源 之 一 (Allan et al., 1979)。幾丁聚醣 (chitosan) 是 幾丁質經高濃度的熱鹼處理，進行去乙醯 化 (deacetylation) 除去全部或部分乙醯基 所得產物。在食品工業上，幾丁聚醣廣泛 地被應用於生物可分解膜之形成、食品加 工廢棄物之回收、水之淨化、果汁之澄清 與去酸化用途上。此外因其具有抗菌作 用，故可用於食品之保藏上防止微生物所 引起之劣變。 幾丁聚醣在中性及高 pH 範圍之不溶解性 因而限制了它在實際上之被應用。利用雙 醣 (麥芽糖、乳糖與纖維雙醣) 進行幾丁聚 醣之修飾所得之衍生物可增進其水溶性。 本計畫擬進一步探討對這些幾丁聚醣雙醣 衍生物之抗菌作用包括影響其抗菌活性因 子如菌齡，金屬離子，溫度，pH 等及其在 食品保存上之應用。 三、結果與討論 1. 不同幾丁聚醣雙醣衍生物對不同菌種 之抗菌作用 探討幾丁聚醣雙醣衍生物抗菌活性之 結果發現，不同種類雙醣 (乳糖、麥芽糖 及纖維雙醣) 與取代程度 (DS 20-30%， 30-40%，40-50%) 的幾丁聚醣雙醣衍生物 對於 E. coli 和 S. aureus 均有顯著性的抗菌 作用。其中以幾丁聚醣麥芽糖衍生物（取 代程度為 30-40 %）對 S. aureus 的抗菌活 性最強。對 E. coli，則以幾丁聚醣纖維雙 醣衍生物（取代程度為 30-40 %）的抗菌活 性最強。進一步以取代程度 30-40 ％ 之幾 丁聚醣雙醣衍生物對三株病原菌： E. coli O157: H7 933 、 Listeria monocytogenes ScottA 和 Salmonella typhimurium 進行測 試，顯示經過 6 小時培養後，含衍生物培 養液中 E. coli O157:H7 933 之存活菌數與 控制組相比低了約 4.63~5.89 log CFU/mL;
S. aureus 之存活菌數與控制組相比低了約
4.0~5.05 log CFU/mL; L. monocytogenes ScottA 之存活菌數與控制組相比低了約 2.70~2.90 log CFU/mL; S. typhimurium 之 存活菌數與控制組相比低了約 4.40~4.92 log CFU/mL。顯示三種幾丁聚醣雙醣衍生 物對此四株病原菌均呈現顯著但不同程度 的抑菌能力。探討不同幾丁聚醣雙醣 (乳 糖、麥芽糖和纖維雙醣) 衍生物在去離子 中對於 S. aureus 抑菌活性，發現在培養 2 h 經統計分析結果顯示，乳糖與麥芽糖之抑 菌效果較好，其次是纖維雙醣；培養 4 h 與 6 h 經統計分析比較，不同衍生物之間對此 株菌抑菌能力並無差異，隨著培養時間延
3 長，三種衍生物之抑菌能力趨於並無差 異。惟對 E. coli CCRC 10675 之抗菌作用則 因衍生物不同而有所差別。 2. 不同濃度對抗菌活性之影響 三種衍生物中選擇乳糖衍生物進行後 續實驗，測試添加不同濃度 (250、500 及 1000 ppm) 對於幾丁聚醣乳糖衍生物對 S. aureus 抑菌效果之影響顯示幾丁聚醣乳糖 衍 生 物濃 度在 0~500 ppm 範圍內對 S. aureus 之抑菌活性隨著濃度的上升而增 強。其後雖然濃度再提高但其抗菌活性並 沒有顯著的上升。當幾丁聚醣乳糖衍生物 的濃度為 250 和 500 ppm 時，培養 8 h 後，
S. aureus 之菌數分別為 4.32 log CFU/mL
和 3.73 log CFU/mL，與控制組比較約下降 2.13 log CFU/mL 和 2.72 log CFU/mL。當 培養液中幾丁聚醣乳糖衍生物濃度上升至 1000 ppm 時 S. aureus 之菌數為 3.93 log CFU/mL，與濃度為 500 ppm 者並無顯著 的差異。 濃度對於幾丁聚醣乳糖衍生物抑菌能 力之影響在他人研究中亦有類似之發現。 楊 (2002) 指出，幾丁聚醣雙醣衍生物濃度 在 0-500 ppm 範圍內對 E. coli 之抑菌能 力隨著濃度的上升而增強。其後雖然濃度 再提高但其抑菌能力並沒有顯著的上升。 Papineau et al. (1991) 指 出 ， 水 溶 性 chitosan lactate 的濃度為 0.2 mg/mL 時對 E. coli V517 之抑菌能力較濃度為 1.0 和 5.0 mg/mL 強。Sudarshan et al. (1992) 也發 現水溶性 chitosan glutamate 和 chitosan lactate 的 濃 度 為 0.1 mg/mL 時 對 S. aureus MF-31 之抑菌能力較濃度為 2.0 和 5.0 mg/mL 者強。 3. 不同金屬對幾丁聚醣衍生物抗菌活性之 影響 以 E. coli O157: H7 為試驗菌株發現金 屬離子會降低幾丁聚醣麥芽糖衍生物對 E. coli O157: H7 933 之抗菌活性。其影響的強 度依序為 Ba2+ , Na+ > Ca2+ > Mg2+。此外隨 著金屬離子濃度的提高其降低幾丁聚醣麥 芽糖衍生物抗菌活性之情形也愈顯著。 4. 不同培養溫度對於抑菌效果之影響 在不同培養溫度下對 S. aureus 之抑菌 效果試驗中發現就控制組而言，S. aureus 在去離子水中培養 12 h，隨著培養時間的 延長呈現些許下降的趨勢，最多僅下降 1.0 log CFU/mL。添加幾丁聚醣乳糖衍生物的 實驗組中培養 12 h 溫度越高抑菌效果越 好，在 37℃ 抑菌效果最好 S. aureus 菌數 約降低 3.5 log CFU/mL，與控制組相比低 了約 2.5 log CFU/mL；在 25℃ 及 4℃ 的 培養溫度下，分別具有降低菌量約 2.0 log CFU/mL 及 1.0 log CFU/mL，最終菌數也 比控制組低。 溫度對於幾丁聚醣雙醣衍生物抑菌能 力之影響有類似的結果。Tsai and Su (1999) 指出，幾丁聚醣對 E. coli 之抗菌活性隨著 溫度的上升而增強 (在 37℃ > 25℃ > 15℃ > 4℃)。可推測幾丁聚醣雙醣衍生物 具有抑菌的效果，由於在較高培養溫度下 分子間作用的機會較高，則抑菌效果較為 顯著。 5. 不同培養 pH 對於抑菌效果之影響 在不含幾丁聚醣衍生物之控制組中， S. aureus 在去離子水中培養 12 h，隨著培 養時間的延長呈現些許下降的趨勢，最多 僅下降 0.5 log CFU/mL。添加幾丁聚醣乳 糖衍生物的實驗組中，幾丁聚醣乳糖衍生 物對 S. aureus 具有顯著抑菌能力，幾丁聚 醣乳糖衍生物在 pH 6.5 時抑菌活性最 強，經 6 小時培養後，即可降低 7.0 log CFU/mL。其次是在 pH 7.0 經 10 小時培 養後，也可降低 7.0 log CFU/mL。在 pH 7.5 及 pH 6.0 的培養液中培養 12 h，分別 降低菌量約 2.5 log CFU/mL 及 0.5 log CFU/mL，最終菌數也相對比其控制組低。 當 pH 值小於 6.5 時，幾丁聚醣乳糖衍生 物之抑菌能力隨著 pH 下降而降低。推測 可能幾丁聚醣與雙醣進行烷基化反應後其 衍生物的 pKa 與幾丁聚醣不同，導致在相 同的 pH 下幾丁聚醣與其衍生物之質子化 程度不同。此外在酸性 pH 中，幾丁聚醣 雙醣衍生物之抗菌活性較差，應歸因於 N-glycosidic linkage 在酸性 pH 下容易水
解 (Whistler and Daniel, 1985) 所致。 而本實驗之幾丁聚醣乳糖衍生物為水 溶性之物質且於近中性 pH 6.5~7.5 有較 好的抑菌效果，可增加其於中性 pH 值食品 的應用性。 6. S. aureus 在不同菌齡對幾丁聚醣乳糖衍 生物之敏感性 菌齡會影響 S. aureus 菌體對幾丁聚 醣乳糖衍生物之敏感性。添加幾丁聚醣乳 糖衍生物的實驗組中，顯示菌齡為對數末 期 (12 h) 之 S. aureus 最易被幾丁聚醣乳 糖衍生物抑制，培養 12 h 後約降低 6 log CFU/mL；其次為培養至定常期 (24 h) 之
S. aureus 約降低 4 log CFU/mL，而培養至
對數期中期 (6 h) 的菌體耐性最強，僅下 降 3 log CFU/mL。 幾丁聚醣乳糖衍生物由於帶有胺基因 此具有抑菌能力，在不同菌齡之 S. aureus 菌體之敏感性不同，仍推測應與菌體表面 所帶電荷有所相關性。 7. 幾丁聚醣乳糖衍生物對於金黃色葡萄球 菌之菌體細胞膜之傷害 測 試 幾 丁 聚 醣 乳 糖 衍 生 物 對 於 S. aureus 菌體細胞膜之傷害，以掃描式電子 顯微鏡拍照，觀察菌體細胞膜的改變發現 就控制組而言 S. aureus 在去離子水中培養 12 h，菌體形狀仍呈現圓球狀，且細胞表面 光滑；添加幾丁聚醣乳糖衍生物的實驗組 中，菌體的形態有明顯的改變，形狀上有 的是半圓形或不規則形狀，但大多仍是圓 球狀，且其細胞膜表面上，大多有明顯的 呈現凹凸不平的狀態。推測由於細胞膜有 所損傷，菌體內物質洩漏，而在黏附細胞 膜表面，因此可觀察出細胞膜表面會有凹 凸不平的狀態。 則更進一步測試是否有細胞內物質洩 漏的情形，將菌液離心所得之上清液進行 280 nm 吸光值得測定是否有胞內蛋白質 流失，發現在不含幾丁聚醣衍生物之控制 組，S. aureus 在去離子水中培養 12 h，菌 數隨著培養時間的延長呈現些許下降的趨 勢，最多僅下降 1.0 log CFU/mL，隨著菌 數的下降其菌液上清液在 280 nm 吸光值 僅上升約 0.005，可能是測試菌體之培養環 境在去離子水中，菌體內滲透較高因而菌 體破損，使一些細胞膜內物質流出。於含 有 幾 丁 聚 醣 乳 糖 衍 生 物 的 實 驗 組 中 S. aureus 之活菌數隨著作用時間的延長而下 降 ， 培 養 12 h 後 約 降 低 3.5 log CFU/mL。隨著菌數下降其菌液上清液在 280 nm 吸光值約上升 0.020，顯示隨著菌 體的菌量下降越顯著其 280 nm 吸光值上 升越明顯。故可推測由於幾丁聚醣乳糖衍 生物會干擾菌體細胞膜的結構，造成胞內 蛋白質大量流失，導致菌體死亡。 8. 幾丁聚醣乳糖衍生物對金黃色葡萄球菌 S. aureus 腸毒素產生之影響及其於碎 肉中之保鮮作用 將幾丁聚醣乳糖衍生物 (500ppm) 添 加於 BHI 中能抑制 S. aureus 腸毒素 A，D 之生產。加入 500 及 1000 ppm 之幾丁聚 醣乳糖衍生物於碎豬肉中，可抑制碎豬肉 中細菌在 5 及 22℃ 之生長。經處理之碎 豬肉在貯存期間其總生菌數、金黃色葡萄 球菌及低溫菌數皆比未處理者低，具有保 鮮之功效 。 四、參考文獻 1. 楊萃渚，2002，水溶性幾丁聚醣單、 雙醣衍生物之合成與其一些理化與功 能特性之探討，國立臺灣大學食品科 技研究所碩士論文。
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5 activity of shrimp chitosan against
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五、部分成果已接獲發表之論文 (兩篇) 1. Chen YL, Chou CC. 2005. Factors
affecting the susceptibility of Staphylococcus aureus CCRC 12657 to water soluble lactose chitosan derivative. Food Microbial. 22: 29-35. (P6-12). 2. Yang TC, Chou CC, Li CF. 2005.
Antibacterial activity of N-alkylated disaccharide chitosan derivatives. Int. J. Food Microbiol. 97: 237– 245. (P13-21).
