行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
中醫藥配合組織工程於神經再生的應用與評估
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2320-B-039-014- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學中國醫學研究所 計畫主持人： 陳悅生 計畫參與人員： 王海亭 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 10 月 14 日
中醫藥配合組織工程於神經再生的應用與評估
計劃編號：NSC91-2320-B-039-014 執行期間： 91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日 計畫主持人：陳悅生 共同主持人：姚俊旭 計畫參與人員：王海亭 執行單位：中國醫藥大學中國醫學研究所 一、中文摘要 要突破生醫材料於神經再生的應 用，組織工程相關技術的研發是勢在 必行的。其中，中醫藥配合組織工程 於神經科學的研發，勢必是未來相關 研究的主軸之一。此報告乃針對具神 經細胞保護功能之中藥，包含人參皂 甘 (ginsenoside) 、 黃 耆 皂 甘 (astragaloside) 及 銀 杏 葉 酯 (bilobalide) 對 Schwann cell 的生化作用進行探 討，並利用體外 Schwann cell 培養之方 式，以 Schwann cell 的分子標的物進行 藥性及藥效評估。 關鍵字：組織工程；神經再生；中醫 藥 AbstractTo further study the applications of biomaterials on nerve regeneration, developing novel techniques in tissue engineering is necessary. Among which, combining Chinese medical science with tissue engineering can be seen a major trend in studies of neuroscience. In this study, we tried to examine the biochemical effects of several herbal extracts, such as ginsenoside, astragaloside, and bilobalide, on
Schwann cells. We also studied the markers in cultured Schwann cells treated with aforementioned herbal extracts. We therefore are able to determine the optimal concentration of a certain herbal extract(s) on promoting the differentiation of Schwann cells, which can be used in our future research associated with nerve regeneration in-vivo.
Key Words: Tissue engineering; Nerve regeneration; Chinese medicine
二、緣由與目的 神經管接合術[1-4]是將神經兩斷端 手術縫合於一圓管的兩端，並利用此 圓 管 來 導 引 及 支 持 再 生 神 經 纖 維 成 長。現在已經有許多不同的生物材料 用來製作神經管[5-7]，矽膠管(silicone tube)就是其中之一。矽膠製神經管具 有高生物適應性及透明及高柔軟度等 優點，近年來已大量使用於神經再生 與修復的研究中[8]。另外，在神經管內 添加刺激神經再生的物質，能使管中 再生的神經在較短的時間內，跨過神 經間距完成再生。常使用的神經再生 刺 激 物 質 有 ： 神 經 生 長 因 子 (nerve growth factor, NGF) ， 膠 原 蛋 白
(collagen)，昆布氨酸(laminin)及纖維網 蛋白(fibronection)的混合物等等[9,10]。 除此之外，要突破生醫材料於神經再 生的應用，組織工程相關技術的研發 是勢在必行的。其中，中醫藥配合組 織工程於神經科學的研發，勢必是未 來相關研究的主軸之一。此結論報告 為針對具神經細胞保護功能之中藥， 包含人參皂甘(ginsenoside)、黃耆皂甘 (astragaloside) 及 銀 杏 葉 酯 (bilobalide) 對 Schwann cell 的生化作用進行探 討，並利用體外 Schwann cell 培養之方 式，以 Schwann cell 的分子標的物進行 藥性及藥效評估。 三、結果 實驗過程所遇問題及解決方法 1. 起 初 做 這 個 實 驗 時 使 用 的 是 150-200 g 的 SD rat，在細胞數量 上一直無法有明顯的增加。解決 方法：a. 增加老鼠的隻數，b.使用 出生 3 天的小鼠，c.使用出生 3-5 天的小鼠；其中則以 c.的方法可 以獲得較多數量的細胞數。 2. 原本是使用 coated collagen 的培 養皿，培養數天後都會出現污染 的狀況，發現因為在中和 collagen 的過程很難達到無菌，所以在培 養過程中很容易出錯，後來改用 coated Poly-L-lysine 的培養皿就 不會有此種狀況，且細胞數也有 明顯的增加。 3. 添加有絲分裂促進劑若依照 paper 的劑量會有抑制的狀況，降低劑 量來測試細胞增生的狀況以便找 出最佳濃度。 經修改部分實驗步驟後，本組成功的 培養及純化出 Schwann cells，經 S-100 染色並在倒立式顯微鏡下觀察，細胞 體呈菱形，核為橢圓形，胞體兩側有 兩 個 細 長 突 起 。 相 較 於 細 胞 體 為 扁 平，不規則形、核圓型，胞體有兩個 或多個短突起的纖維母細胞，之間的 型態相差甚多（圖一）。 圖一：Schwann cell 細胞體為菱形，核為橢圓 形，胞體兩側有兩個細長突起。纖維母細胞細 胞體則為扁平，不規則形、核圓型，胞體有兩 個或多個短突起的細胞 圖二則為黃蓍、銀杏和人參標準品加 入培養基，再經 XTT 測定之結果。 (a) 圖二：(a)人參、(b)黃蓍、(c)銀杏標準品加入 培養基，再經 XTT 測定之結果
(b) (c) 結果發現，人參及銀杏在 24 小時作用 時間內均有一最佳濃度，分別為 50 µM 及 6.25 µM，對 Schwann cell 增生有促 進作用。黃耆則在觀察期中，對 Schwann cell 增生並無促進作用。 四、討論 在神經管中添加刺激神經再生的 物質，會使再生神經在較短的時間內 跨過截斷神經間距，而到達遠斷端。 這些物質包括例如膠原蛋白、昆布氨 酸及纖維網蛋白等等。除了單純的利 用生醫材料配合投遞不同的神經刺激 藥物來促進神經再生外，組織工程應 用於神經科學技術的開發與應用，愈 發受研究界重視，其中又以本實驗中 所純化之 Schwann cell 與材料結合的 概 念 被 認 為 最 為 可 行 。 這 是 由 於 Schwann cell 具有相當促進神經再生 的能力，於是將 Schwann cell 植於受損 的神經組織中，來促進神經再生的方 法已被廣泛的運用。在確定各中藥成 分及其對 Schwann cell 產生最佳促進 增生濃度之後，本組於 92 年國科會計 劃中則利用 collagen 來包覆由大鼠分 離培養的 Schwann cell 及已確認之中 藥，並將此混合物填入矽膠神經管中 來接合大鼠的截斷坐骨神經。同時， 為了確認 Schwann cell 及中藥成分對 神經再生的促進作用，計劃中加長截 斷坐骨神經的間距至 1.5 公分，並於實 驗期 8 星期後針對再生神經的型態及 其電生理功能來評估結果。此連續兩 年期的實驗結果除了可以評估何種中 藥可以促進 Schwann cell 的活化程 度，而達到增強受損神經再生的能力 之外，在動物實驗中更能進一步的確 認 利 用 中 藥 作 為 Schwann cell 之 neurotrophin 的可行性。總結，此次計 劃中最主要的目的是希望能結合組織 工程、生醫材料及藥物釋放等技術， 期能對神經修復技術的開發能有所突 破，以造福神經損傷之患者。 五、計畫成果自評 實驗結果已達到計劃書中之目 標。
六、參考文獻
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