行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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有機毒物對藻類光合作用之毒性研究
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計畫類別：個別型計畫
計畫編號：NSC90－2211－E－009－021
執行期間：90 年 08 月 01 日至 91 年 10 月 31 日
計畫主持人：陳重元教授
計畫參與人員：許智雄
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□ 赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□ 出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立交通大學環境工程研究所
中
華
民
國 91 年 10 月 23 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
有機毒物對藻類光合作用之毒性研究
Toxicity study of or ganic chemicals using algal photosynthetic test
計畫編號：NSC 90-2211-E-009-021
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 10 月 31 日
主持人：陳重元 執行機構及單位：國立交通大學環境工程研究所
一、 中文摘要 本 研 究在 發 展 BOD 瓶密閉式藻類 （Raphidocelis subcapitata）毒性試驗，並 評估三類非極性麻醉有機物之毒性，包括 氯苯、含氯乙烷及含氯甲苯類毒物。 在試驗終了時，量測光合作用參數即 溶氧變化量（Based On DO）及傳統的生物 質量（Based On Biomass）兩種試驗終點， 以 Probit model 分析其 EC50 值。除了 1,1,2,2,-四氯乙烷和六氯乙烷外，以溶氧為 試驗終點時皆得到較敏感之 EC50 值。在 QSAR 方面，兩種試驗終點之 R2為 0.8868 （ Based On DO ） 與 0.861 （ Based On Biomass），顯示毒性與 logP 有良好之相關 性。而物種間之毒性數據的比較，亦呈現 良好之相關性（介於 0.7 到 0.9 之間）。因 此，BOD 瓶藻類毒性試驗敏感性、再現性 及可靠性佳。而且方法簡單、方便又經濟， 並可用於偵測揮發性有機物毒性。 關鍵詞：密閉式藻類毒性試驗、非極性麻 醉有機物、BOD 瓶、logP、揮發性有機物 Abstr actIn this study, we use BOD bottles to
perform a close-system algal (Raphidocelis
subcapitata) test assessing the toxicity of
three kinds of non-polar narcotic chemicals including chlorobenzene, chloroethane and chlorotoluene.
The toxicity endpoint was measured based on DO and Biomass Methods, then using the Probit model to estimate the values of EC50. We found the EC50 values based
on DO was more sensitive except
1,1,2,2,-tetrachloroethane and
hexachloroethane. As for the QSAR, the R2
values of two endpoints are 0.8868 ( based on DO ) and 0.861 ( based on Biomass ) respectively, so the toxic values present good correlation with logP values. Between different species, we also found high
correlation coefficient that R2 values were
between 0.7 and 0.9. Therefore, the toxic values have well sensitivity, reproducibility and confidence by using BOD bottle test. In addition, this method was very easy, convenient and economic to analyze high vaporizing organic chemicals.
Keywor d: close-system algal test, non-polar
narcotic chemicals, BOD bottle, LogP, high vaporizing organic chemicals
二、計畫緣由與目的 藻類毒性試驗常被應用於比較相對毒 性。但還沒有一個標準或廣泛使用的藻類 毒性試驗可應用在偵測揮發性有機物毒性 [1]。主要是由於大部分試驗為開放式系 統，揮發性物質濃度隨著試驗期拉長逐漸 降低，故需以密閉系統進行試驗。 一個藻類毒性試驗密閉式系統，需考 慮下列兩項要素：1. 要提供足夠的碳源， 以避免藻類因為碳源不足而生長受到抑 制。2. 確保試驗毒性物質於試驗期間維持 在穩定之濃度。在先前文獻中[2,3,4]之密閉 系統毒性試驗，存在過大 Head Space 或離 子強度太強導致生長抑制等缺點。但本研 究以 BOD 瓶為密閉系統，使用 CO2－N2 曝氣來除去水中溶氧，除可提供充足碳 源，而 Head Space 亦將減至最低或甚至沒 有 Head Space 以防止揮發導致濃度降低。 故可求得更精準之毒性試驗數據。 本研究目的在利用連續式培養下高敏 感度藻類，以光合作用產氧量(DO)和傳統 生物質量(biomass)參數探討下列問題。 (1) 利用 BOD 瓶進行藻類毒性試驗，分別 以溶氧和細胞密度為試驗終點，比較兩種 試驗終點對毒性試驗的影響。 (2) 將所得之毒性試驗結果和 QSAR 中之 重要參數進行統計分析，討論其相關性。 (3) 將所得之結果和其他物種之毒性試驗 比較，討論相關性及本毒性試驗之可行性。 三、研究方法 1、實驗材料 本研究中，採用月芽藻（Raphidocelis subcapitata）。而試驗毒物為苯類、氯苯類、 氯乙烷類、甲苯和氯甲苯類之有機毒物。 皆為麻醉毒性之非反應性毒物。 2、實驗步驟 (1) 連續式母槽之培養 藻類於四升的連續式母槽培養，曝氣 量 250ml/min ， 光 照 強 度 64.5 ± 10 ﹪ ìEm-2s-1。溫度 24 ±1 o C。營養基質參照 U.S. EPA，但 EDTA 濃度降為原本之 10﹪，
而氮、磷濃度降為 50%。稀釋率 0.25 day-1。 每日量測母槽中細胞濃度、平均細胞體 積、pH 值、溢流率等數值。連續三天之上 述參數值在一定控制範圍內即達穩定態。 (2) 藻類毒性試驗 進行毒性試驗每次為七個 300ml 之 BOD 瓶，一瓶為控制組，不加毒性物質， 另外六瓶則加入不同濃度毒性物質，並進 行三重複。毒性試驗之前需進行 TOC 量 測 。 營 養 基 質 參 照 U.S. EPA， 但 不 含 EDTA。加入 BOD 瓶之初始細胞密度為 1.5 ×104 cells/ml。再加入曝氣好之純水、營養 基質及毒性物質以達到所需濃度。測量各 瓶溶氧值是為初始溶氧值，溫度 24 ±1℃， 光照強度 64.5 ±10﹪ìEm-2 s-1之白冷光，震 盪頻率 100rpm。於 48 個小時後量測 BOD 瓶溶氧值為最終溶氧值。接著用顆粒計數 器量測 BOD 瓶的藻類細胞密度。 (3) 統計分析
使用 Probit 模式計算 EC50。以 One sample t-test 及 Dunnett's test 計算 NOEC。
四、結果與討論 1. BOD bottle 溶氧試驗分析 由表 1.及表 2.中 1,3-二氯苯之實驗結 果計算 EC50 分別是 2.68 mg/l ( on DO )與 3.34 mg/l ( on biomass )，因此以溶氧增加量 為試驗終點較敏感。
表 3.是以溶氧變化量為試驗終點時之 EC50 值及 logP，顯示氯化乙烷類毒性較 低 ， 最 低 的 1,2-DCE 之 EC50 值 為 193.38mg/l。氯化苯類和氯化甲苯類毒性差 異不大，最高為 HCB (EC50=0.37mg/l)。以 log(1/EC50)為縱軸 LogP 為橫軸繪製相關 性比較圖(圖 1)，所得之迴歸關係式為： log(1/EC50)=0.8014 log P+1.6827；R2 = 0.8868，表 4.則是以生物質量變化量為試驗 終點之 EC50 值，其中氯化乙烷類中之 1,2-DCE 毒性最低，其 EC50 值為 209.33 mg/l。氯化苯類和氯化甲苯類毒性差異不 大，毒性最高的是 HCB (EC50= 0.65mg/l)。 以 log(1/EC50)為縱軸 LogP 為橫軸繪製成 相關性比較圖(圖 2)，可得迴歸關係式為：
log (1/EC50)=0.7782 log P+1.6684；R2 =
0.861，故毒性數據與 Log P 具良好相關性。 除了本研究物種外，另外選了九種其 他常見的物種來探討相關性。由表 6. 觀察 R2可知與本研究相關性最高的是和本研究 同一物種的 Raphidocelis subcapitat 的批次 式實驗，兩種試驗終點的相關性分別為 0.898（On DO）和 0.921（On Biomass）。 而相關性最低的為 Polytox 的 0.655（On DO）和 0.701（On Biomass）。本研究所
得到的 R2大多介於 0.7 到 0.9 之間，故本 研究所得到的毒性數據值得信賴。 在敏感性方面，觀察表 5.和表 6.，可 知批次式的 R. subcapitat 和 D. magna 與本 試驗敏感度差異不大；而 S. ambiguum 和 C.cf. dubia 的敏感則優於 R. subcapitat。此 外，其它物種敏感度皆不如 R. subcapitat， 因本研究與 S. ambiguum 的試驗皆為密閉 系統，皆可獲得相當高敏感性。證明本試 驗非常適合用在揮發性毒物之毒性試驗。 2. NOEC 的比較 表 1.與表 2.以 1,3-DCB 為例，兩試驗 終點以 One-sample t test 得到的 NOEC 皆為
1.40mg/l，而 Dunnett’s test 得到的 NOEC 皆為 0.70mg/l。故 Dunnett’s test 可以準確 決定出較低的 NOEC 值。 3. 重複試驗 表 7.對 benzene 和 4-chlorotoluene 進行五次 和四次重複試驗，EC50 的部分，所求得最 大 C.V.值為 benzene 以溶氧增加量為試驗 終點的 10.91%，最小為 4-chlorotoluene 以 生物質量為試驗終點的 6.77%；EC10 的部 分 C.V.值較大，最大的是 benzene 以生物 質 量 為 試 驗 終 點 的 41.19% ， 最 小 為 4-chlorotoluene 以生物質量為試驗終點的 7.45%，其變異性較 EC50 結果增加許多。 五、計畫成果自評 本研究所得之毒性數據與 Log P 有良好 之相關性，也證明了兩種試驗終點之間具 有良好之相關性。在物種間相關性研究所 得的 R2大多介於 0.7 到 0.9 之間，故實驗 毒性數據值得信賴。在敏感度方面，亦證 明本研究敏感度高，C.V.值的結果則顯示本 研究再現性高，由此可知本試驗非常適合 應用在揮發性毒物的毒性試驗上。整個試 驗方法之量測簡單、方便又經濟，對於試 驗時間過長、試驗過程繁瑣之生物毒性試 驗方法，本研究方法不失為一可替代之試 驗方法。研究成果基本上完全達成預期目 標，研究內容與計畫亦符合，應用價值高， 將於近期內投稿至國際學術期刊。 六、參考文獻
1. Br ack, W. and Rottler, H. (1994), In:
Environmental Science and Pollution Research, 4:23-228.
2. R. Kuhn and M. Pattar d (1990), In:
3. S. Galassi and M. Vighi (1981), In:
Chemosphere, 10:1123-1126.
4. D.C. Her man, W.E. Inniss and C.I. Mayfield (1990), In: Aquatic Toxicology, 18:87-100. 七、圖表 y = 0.8014x + 1.6827 R2 = 0.8868 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 log P lo g (1 /E C 50 ) 圖 1.以溶氧增加量為試驗終點與 log P 之相關性 y = 0.7782x + 1.6684 R2 = 0.861 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 log P lo g (1 /EC 50 ) 圖 2.以生物質量增加量為試驗終點與 log P 之相關性 表 1. 1,3-二氯苯以溶氧為試驗終點之實驗數據
Conc. Initial DO Final DO Delta DO inhibition rate (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) On DO Control 1.15 7.48 6.33 0.000 7.00 2.48 2.83 0.35☆ * 0.945 4.20 2.00 2.67 0.67☆* 0.895 2.80 1.69 4.62 2.92☆ * 0.538 2.10 1.49 6.33 4.85☆ * 0.234 1.40 1.43 6.95 5.52* 0.128 0.70 1.36 7.24 5.88 0.072 EC50= 2.68
☆ : The value is over control level of control chart (between 4.96 to 6.97) ﹡: Statistically different (P<0.05) from controls using one-tail Dunnett's test
表 2. 1,3-二氯苯以生物質量為試驗終點之實驗數據
Conc. Initial Biomass
Final Biomass
Delta Biomass inhibition rate (mg/l) (cells/ml) (cells/ml) (cells/ml) On Biomass Control 15000.00 361400.00 346400.00 0.000 7.00 15000.00 31666.67 16666.67☆ * 0.765 4.20 15000.00 37833.33 22833.33☆* 0.709 2.80 15000.00 91800.00 76800.00☆ * 0.431 2.10 15000.00 176766.67 161766.67☆ * 0.225 1.40 15000.00 254500.00 239500.00* 0.110 0.70 15000.00 324566.67 309566.67 0.034 EC50= 3.34
☆: The value is over control level of control chart(between 2.31×105
to 3.82×105
) ﹡: Statistically different (P<0.05) from controls using one-tail Dunnett's test
表 3. BOD bottle test 以溶氧變化量為試驗終點之數據
Based on DO
EC50 95% Confidence Molecular Chemicals ( mg /l) Limit Weight logP Log ( 1/EC50 )* Benzene 20.86 16.17 - 34.74 78.11 2.13a 3.59 Chlorobenzene 9.80 7.90 - 14.67 112.56 2.84a 4.06 1,2-DCB 3.28 2.89 - 4.02 147.00 3.38a 4.65 1,3- DCB 2.68 2.71 - 4.16 147.00 3.6a 4.74 1,4- DCB 3.17 2.68 - 3.83 147.00 3.52a 4.67 1,2,3- TCB 1.15 0.69 - 4.49 181.45 4.05c 5.20 1,2,4- TCB 1.19 0.99 - 1.56 181.45 4.02a 5.18 1,3,5- TCB 3.11 3.01 - 3.21 181.45 4.15c 4.77 1,2,3,4- TCB 0.76 0.46 - 1.59 215.89 4.54c 5.45 1,2,4,5- TCB 2.26 2.12 - 2.41 215.89 4.63c 4.98 HCB 0.37 0.29 - 0.47 284.78 5.31a 5.89 1,1-DCE 44.83 43.31 - 46.25 98.96 1.79c 3.34 1,2- DCE 193.38 170.13 - 218.73 98.96 1.48a 2.71 1,1,1- TCE 96.40 74.03 - 124.50 133.40 2.49a 3.14 1,1,2- TCE 129.28 111.95 - 149.19 133.40 2.07b 3.01 1,1,1,2- TCE 9.00 7.38 - 10.61 167.85 3.03b 4.27 1,1,2,2- TCE 41.88 39.05 - 45.36 167.85 2.39a 3.60 PCE 7.22 6.02 - 8.73 202.30 3.05b 4.45 HCE 1.66 1.12 - 3.52 236.74 3.82a 5.15 Toluene 16.45 9.81 - 28.76 92.14 2.73a 3.75 4-CT 12.45 9.59 - 15.54 126.58 3.33c 4.00 2,4-DCT 4.16 3.81 - 4.61 161.03 4.24c 4.59 *:EC50 unit：mol/l
a:CRC Chemistry Handbook ( 1996 )[9] b:Howard PH ( 1991 )[10]
表 4. BOD bottle test 以生物質量變化量為試驗終點之數據
Based on Biomass
EC50 95% Confidence Molecular Chemicals ( mg / l ) Limit Weight logP Log ( 1/EC50 )* Benzene 28.70 24.63 - 32.98 78.11 2.13a 3.40 Chlorobenzene 11.88 6.97 - 21.20 112.56 2.84a 3.98 1,2-DCB 3.77 3.55 - 4.08 147.00 3.38a 4.59 1,3- DCB 3.34 2.07 - 3.83 147.00 3.6a 4.64 1,4- DCB 3.34 3.20 - 3.49 147.00 3.52a 4.64 1,2,3- TCB 1.49 1.27 - 1.83 181.45 4.05c 5.09 1,2,4- TCB 1.41 1.30 - 1.54 181.45 4.02a 5.11 1,3,5- TCB 4.64 4.08 - 5.63 181.45 4.15c 4.59 1,2,3,4- TCB 1.04 0.90 - 1.18 215.89 4.54c 5.32 1,2,4,5- TCB 2.71 2.43 - 3.10 215.89 4.63c 4.90 HCB 0.65 0.59 - 0.72 284.78 5.31a 5.64 1,1-DCE 47.40 45.31 - 49.35 98.96 1.79c 3.32 1,2- DCE 209.33 182.82 - 233.76 98.96 1.48a 2.67 1,1,1- TCE 126.16 114.74 - 139.07 133.40 2.49a 3.02 1,1,2- TCE 160.35 146.78 - 177.48 133.40 2.07b 2.92 1,1,1,2- TCE 17.72 15.22 - 20.42 167.85 3.03b 3.98 1,1,2,2- TCE 33.79 27.08 - 45.95 167.85 2.39a 3.70 PCE 8.86 7.84 - 10.13 202.30 3.05b 4.36 HCE 1.30 1.20 - 1.41 236.74 3.82a 5.26 Toluene 20.50 16.07 - 26.28 92.14 2.73a 3.65 4-CT 14.94 13.28 - 16.44 126.58 3.33c 3.92 2,4-DCT 5.29 3.96 - 7.36 161.03 4.24c 4.48 *:EC50 unit：mol/l
a:CRC Chemistry Handbook ( 1996 )[9] b:Howard PH ( 1991 )[10]
c:Mark T.D. Cronin, T. Wayne Schultz (1997 )[6]
表 5.其它物種毒性試驗數據
表 6. BOD bottle 毒性試驗與其他物種毒性試驗之關係
Base ON DO Base On Biomass 試驗物種 迴歸方程式 R2 迴歸方程式 R2 Raphidocelis subcapitat Y = 0.8522X + 0.6340 0.898 Y = 0.8494X + 0.5769 0.921 Fathead minnow Y = 1.1114X - 0.2827 0.851 Y = 1.1640X - 0.5427 0.887 Activated sludge Y = 0.9408X + 1.2878 0.803 Y = 0.9751X + 1.1202 0.856 Polytox Y = 0.8364X + 1.5220 0.655 Y = 0.8687X + 1.3577 0.701 Spirostomum ambiguum Y = 0.9002X - 0.5032 0.776 Y = 0.9035X - 0.6085 0.787 Ceriodaphina cf. dubia Y = 0.8192X + 0.3938 0.873 Y = 0.8396X + 0.1974 0.870 Methanogens Y = 0.7770X + 2.3458 0.769 Y = 0.8029X + 2.1657 0.791 Microtox Y = 0.7659X + 1.1758 0.855 Y = 0.7542X + 1.1561 0.861 Daphnia magna Y = 0.9434X + 0.2253 0.816 Y = 0.9395X + 0.1734 0.829 表 7.苯和 4-氯甲苯之重複實驗數據
based on DO based on Biomass chemicals
EC50 C.V. EC10a C.V. EC50 C.V. EC10a C.V.
19.23 7.50 31.52 14.01 20.69 7.45 30.88 13.01 23.27 10.91% 9.04 27.09% 27.49 9.00% 8.51 41.19% 23.02 8.15 28.46 8.71 Benzene 18.11 3.91 25.17 4.09 mean 20.86 7.21 28.70 9.67 12.91 7.01 15.40 6.19 12.66 6.80 14.76 6.50 10.83 5.05 13.62 5.43 4-chlorotoluene 13.39 9.00% 6.93 14.51% 15.98 6.77% 6.13 7.45% mean 12.45 6.45 14.94 6.06 A: by Weibul model
