行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
製備級液相層析法分離精製水果中之花青素
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2622-E-002-009-CC3 執行期間： 92 年 06 月 01 日至 93 年 09 月 30 日 執行單位： 國立臺灣大學化學工程學系暨研究所 計畫主持人： 黃世佑 計畫參與人員： 盧秀青 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫為提升產業技術及人才培育研究計畫，不提供公開查詢中 華 民 國 94 年 5 月 30 日
國科會補助提升產業技術及人才培育研究計畫成果精簡報告
學門領域：化學工程
計畫名稱：製備級液相層析法分離精緻水果中之花青素
計畫編號：NSC92-2622-E-002-009-CC3
執行期間：92 年七月一日至 93 六月三十日
執行單位：台灣大學化學工程學系
主 持 人：黃世佑
參與學生：
姓 名
年 級
(大學部、碩
士班、博士
班)
已發表論文或已申請之專利
(含大學部專題研究論文、碩博
士論文)
工作內容
盧秀青 碩士班
萃取、快速層析、
FRAP、HPLC
合作企業簡介
合作企業名稱：嘉年生化產品有限公司
計畫聯絡人：林景寬
資本額：二千六百萬元
產品簡介：酵素、天然色素、微生物製劑、生化肥料、植物萃取物
網址：http://cbcpclin.tripod.com/framec.htm
電話：(04)23609036
研究摘要：
本研究從桑椹果中萃取分離出花青素，並進行抗氧化活性測定。將桑椹果之甲醇萃 取液通入快速液相層析儀(Flash chromatograph)作初步分離，以 25%甲醇(含 1%醋酸)及 50% 甲醇(含 1%醋酸)溶離出 F25、F50 兩部分，再利用 Reverse Phase Liquid Chromatography 分 析其中之花青素，並以半製備級高效液相層析管柱分離純化出花青素，再經由 LC/MS 確認 鑑定花青素之結構。抗氧化活性測定方面，以 FRAP(Ferric Reducing Ability of Plasma)及抑 制 H2O2誘發老鼠腦漿脂質過氧化(Lipid peroxidation)等方法，評估甲醇粗萃取物及快速層析 儀分離出的 F25 和 F50 之抗氧化活性。人才培育成果說明：
參與學生能熟悉天然物萃取分離的操作、抗氧化活性能力的測定，及其中相關的原 理。對於天然物的萃取分離方面，學生能運用溶劑的極性不同及 pH 值的差異萃取、分離目 標化合物；在儀器操作方面，能熟悉快速層析儀、高效液相層析儀、分光光度計……等等 相關儀器的操作及原理；在抗氧氧化活性測定方面，藉由了解自由基在人體的機制，明白
目前多種抗氧化活性測定方法的原理與操作，例如：FRAP、TEAC、ORAC……等等，在動物 細胞的實驗上，亦有接觸了解的機會，例如，實驗中所使用的 H2O2誘導老鼠腦部均質液過 氧化的操作及原理。
技術研發成果說明：
1. 20 克新鮮桑椹果實使用 200ml 甲醇萃取，可得甲醇粗萃取物。甲醇粗萃物經快速液相 層析作進一步分離，快速層析儀流動壓力設定為 0.05 MPa。先以 200ml 5% methanol (1% acetic acid) (Tedia, U.S.A.)沖洗管柱，做預平衡，再將濃縮液通入填充有 Cosmosil 75C18-OPN gel (Nacalai Tesque, Japan) 120*40mm 的管柱中，以 250ml 5% methanol (1% acetic acid)融離 出醣類及其他水溶性化合物；再以 700ml 25% methanol (1% acetic acid)融離，標示為 F25； 其次以 450ml 50% methanol (1% acetic acid)融離，標示為 F50；然後以 400ml 100% methanol (0.1% HCl)清洗管柱，最後使用 500ml 50% methanol 進行管柱再生。粗萃物經由快速層析 儀，可得 F25 111.4mg 、F50 16.8mg。2. FRAP：(Ferric Reducing Ability of Plasma)
利用 FRAP 測定 F25、F50、粗萃物之還原亞鐵離子能力。FRAP 是利用將 Fe3+和 TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine)(Sigma,U.S.A.)的錯合物還原成 Fe2+的形式，且 Fe2+與 TPTZ 的錯 合物在波長 593nm 時有最大吸收值。將樣品與 FRAP 試劑反應 4 分鐘後，測量其在 593nm 下吸收值的變化，與 Fe2+檢量線作比較，評估樣品還原 Fe3+的能力。結果顯示如圖一，每 克 F25 乾粉末可還原 210.7 mol Fe2+ ，每克 F50 可還原 103.4 mol Fe2+ ，每克粗萃物可還原 25.4 mol Fe2+。 圖一、 利用 FRAP 測定 F25、F50、粗萃物的結果
3. H2O2-Induced Lipid Peroxidation in Rat Brain Homogenate：
以 H2O2 誘 導 老 鼠 腦 部 均 質 液 脂 質 過 氧 化 ， 多 元 不 飽 和 脂 肪 酸 裂 解 產 生 0 50 100 150 200 250 300 F25 F50 甲醇粗萃物 每克乾物質 F er rous ion ( m ol )
malonaldehyde(MDA)，MDA 與 4-hydroxyalkenols (4-HAD)的反應生成物在 586nm 下有最大 吸收值。利用吸收度的變化，評估花青素抑制脂質過氧化的能力。結果如表一所示。 表一、過氧化脂質抑制效果 Sample IC50(μg) 粗萃取物 41 F25 2 F50 1.7 Cyanidin chloride 0.4 Trolox 4.3 3. 利用 HPLC 分析 F25、F50 所含花青素：
分析級管柱 5C18-AR-Ⅱ，4.6*250mm，注入量 10µl，流速 1ml/min，移動相組成 A：2%
acetic acid，B: methanol，梯度 B: 0→15%(5min)→18%(5min)→22%(5min)→24%(2min)→ 50%(28min)→100%(10min)；半製備級管柱 5C18-AR-Ⅱ，20*250mm，注入量 0.5ml，流速
6ml/min，動相組成 A：2% acetic acid，B: methanol，梯度 B: 0→15%(5min)→20%(10min) →35%(15min)→38%(5min)→50%(5min)→100%(5min)。溫度均為 30℃，偵測波長為 530nm。 分析級 HPLC 圖譜如圖二、圖三所示。
圖二、F25 之分析級 HPLC 圖譜，peak1(16.56min)為 cyanidin 3-glucoside，peak2(18.95min) 為 cyanidin 3-glucoside-p-coumaric acid
0 10 20 30 40 Time [min.] 0 200 400 600 800 Voltage [m V] 16.56 18.95
圖三、F50 之分析級 HPLC 圖譜
4.利用 LC-MS 分析 F25 之花青素，結果如圖四、圖五所示。由圖四的資料顯示，peak1 為 cyanidin 3-glucoside。由圖五的資料顯示，peak2 為 cyanidin 3-glucoside 與 p-coumaric acid 脫掉一分子水所形成之化合物，結構式如圖六所示，此化合物為自然界中新發現之花青素 結構。 圖四、Peak1 之 LC-MS 圖譜 10 20 30 40 50 Time [min.] 0 25 50 75 100 125 Voltage [m V] 6.89 9.93 16.80 18.96 21.89 23.54 26.24 28.05 29.29 31.32 31.89 33.77 35.01 36.70 42.10 43.97 47.41 48.57 50.28 50.91
圖五、Peak2 之 LC-MS 圖譜 O O H OH OH OH O O H O OH O O H O OH
+
圖六、Peak2 之結構式技術特點說明：
經由快速層析可以大量且快速有效分離出花青素；快速層析所分離出之 F25 相較於粗 萃物，FRAP 的表現上可提高 8.3 倍，在抑制 H2O2-Induced Lipid Peroxidation 的表現上，F25可利用之產業及可開發之產品：
花青素除為重要的食品呈色劑外，亦是當前備受關注之抗氧化活性劑。已有許多研究 指出，花青素對於預防心血管疾病，減少 DNA 氧化傷害，防止突變，抑制癌細胞生長，治 療眼部疾病及幫助胰島素分泌都有良好的效果。推廣及運用的價值：
本研究對於業界大量製備花青素，提供了製備的條件與方法。在評估桑椹中花青素含 量方面，也有實驗室初步的數據，對於未來開發生產桑椹相關之保健食品，提供了一個有 用的參考資料。研究結果中也顯示，在抑制 H2O2-Induced Lipid Peroxidation 的實驗裡，經由快速層析所分離出之 F25、F50 效果皆優於 Trolox (維他命 E)，且為 Trolox 的兩倍。
已發表論文：
I. Matsushita, T. Kaneyuki, K. Yao and S. Y. Huang, “The Preparation Method of Flash Chromatography and HPLC,” J. Japanese Soci. Of Food Engineering, 24(2), 51-56 (2004)
