行政院國家科學委員會專題研究計畫期末報告
利用逆微胞自醱酵液中分離幾丁聚醣 及生產
幾丁寡醣(2/3)
計畫編號：NSC 90-2214-E-002-043
執行期限：90 年 08 月 01 日至 91 年 07 月 31 日
主持人：蔣丙煌 教授 台灣大學食品科技研究所
計畫參與人員： 蕭伊茜、林育蔚 台灣大學食品科技研究所
一、中文摘要 本研究乃探討如何利用逆微胞系統之特性，調 整微胞內酵素、受質及水之含量比，來促進酵素之 逆合成反應而能生產較具有生理功能之高聚合度 幾丁聚醣。同時，本研究亦探討如何利用膜反應器 之操作特性，將初水解成寡醣之產物以超過濾膜分 離出反應器，而能避免其被進一步水解成低分子量 寡糖使產品含較多之高聚合度寡醣。在逆微胞反應 器實驗方面，本研究發現粗酵素在逆微胞中有合成 四、五、六醣現象，但由於水解反應和逆合成反應 會相互競爭，以致於難以解釋所觀察到之現象。進 一步將粗酵素分離成三個純化酵素，分別命名為 CBC I、CBC II、CBC III，探討其於逆微胞中之反 應，結果雖然觀察到轉糖反應，但是目前仍然無法 完全掌控反應之進行。在膜反應器之研究方面，已 經初步了解 E/S 比與產物中高聚合度寡醣含量之關 係，將進一步研究其他加工條件，以生產出較多的 高聚合度寡醣。 關鍵詞： 逆微胞、幾丁聚醣酉每、幾丁寡醣、酵素逆合成反應 二、英文摘要This study was to use reverse micelle (RM) system to enhance the enzymatic reverse synthesis reaction of chitosanase in order to produce highly polymerized chitooligosaccharides (COS) by adjusting enzyme, substrate and water ratio inside the RM. Meanwhile, ultrafiltration membrane reactor was also studied for the same purpose. The membrane separated chitosan hydrolysate continuously to avoid the high molecular weight product being further hydrolyzed to low molecular weight COS. In the RM system, it was found that crude enzyme could synthesize tetra-COS, penta-COS and hexa-COS. However, the hydrolysis and the reverse synthesis reactions occurred simultaneously in the RM, and it was difficult to
Although it was found that the transglycosylation reaction did occurred in the RM system, the reactions still could not be fully controlled. In the membrane reactor system, the relationship between E/S ratio and high DP COS was established. Further study will focus on other processing factors for increasing the content of high DP COS in the product.
三、緣由與目的 幾丁聚醣酉每為極具應用性之酵素，它可水解幾 丁聚醣而生產具生理活性之幾丁寡醣。然而，一般 之幾丁聚醣酉每水解幾丁聚醣所獲得之產物多為生理 活性較低的低聚合度寡醣（二至五醣）。因此如何 利用適當的酵素反應方法與條件生產具較高生理 活性之寡醣（六至八醣）為本研究之主要目的。 由於在逆微胞系統中可藉由控制微胞中心之 水分含量而使酵素水解反應朝逆方向（合成方向） 進行，所以本研究乃探討如何將逆微胞視為一酵素 反應器，利用其生產高聚合度之幾丁寡醣，同時探 討此一酵素反應之機制。據此，本研究於第一年已 經成功的找出利用逆微胞自醱酵液中分離出幾丁 聚醣酉每之操作條件。第二年研究之工作項目包括： （一）以幾丁聚醣酉每為生物催化劑，以低分子量幾 丁寡醣（三醣或四醣）當受質，利用逆微胞系統之 特性調整微胞內酵素及受質濃度及水含量比（Wo） 來促使酵素朝水解逆反應方向進行，生產較具有生 理活性功能的高分子量幾丁聚醣（六醣至八醣）， 同時探討反應機制。（二）利用膜反應器為工具進 行水解反應，由於膜反應器可以將初水解成寡醣之 產物經膜分離系統帶出反應器，避免其被進一步水 解成低分子量寡醣，因此能夠生產出較多的高聚合 度寡醣。分別探討逆微胞酵素反應器膜反應器之表 現後，則進行比較。以下為初步之研究結果與討論。
由於本實驗採用之逆微胞系統是以 Direct Injection 方式進行，與前一年的 phase transfer 方式 不同，故針對直接注入法對於 chitosanase 的分離效 果再做進一步的探討，結果如表一所示。
表一 使用 Reverse micelle 將Bacillus cereus
NTU-FC-4 幾丁聚糖 純化之效果
Enzyme Total Total Specific
Activity Protein activity Purification Yield ( units ) ( mg ) (units/mg ) ( fold ) ( % ) Crude enzyme 25.87 3.29 7.86 1 100 Purified enzyme 19.01 1.175 16.18 2.06 73.5 結果發現利用 Direct injection 的方式可將粗酵 素純化，純化倍數為 2 倍；而第一年所採用的 Phase Transfer 法則可將比活性提高至 2.63 倍。但 是若要以逆微胞當作寡醣反應之微小反應器，則以 採用 Direct Injection 法形成逆微胞較易控制反應之 進行。 （ 二 ）與 幾 丁 聚 醣 於 逆 微 胞中 幾 丁 二 醣 及 醣 之 三 反應 採用受質為幾丁二醣與幾丁三醣之標準品，等 比例混合配製成受質溶液，以適當活性之酵素液控 制 E/S ratio = 0.03 units/mg substrate，在 40℃下反應 四小時。 圖一顯示，粗酵素在逆微胞中有合成四、五、 六醣現象，但由於水解反應和逆合成反應會相互競 爭，以致於難以解釋所觀察到之現象。因此，將粗 酵素進行純化，再執行酵素反應實驗。 圖一 逆微胞中粗酵素與幾丁二醣及三醣於 40 ℃時之反應結果 （三）粗酵素之純化 參考陳 ( 1995 ) 利用陽離子交換樹脂，將粗酵 素進行純化，依照鹽梯度溶離出之先後順序將其命 名為 chitosanase I, II, III （CBC I、CBC II、CBC III）。經過濃縮之後，以 SDS-PAGE 檢定其蛋白質 組成及分子量，可以得知 chitosanase I 主要的蛋白 質分子量約為 41 kDa；chitosanase II 所包含之蛋白 質種類較為繁雜，但仍可得到分子量為 54 kDa 之 主要蛋白質；chitosanase III 約含四種蛋白質，其主 要蛋白質之分子量約為 46 kDa。另外，研究發現 CBC I 為外切型酵素，產物為幾丁二醣，而 CBC II 和 CBC III 可能混有內切及外切型酵素。 （四）純化酵素於逆微胞中與幾丁二醣及三醣之反 應 從圖二可以得知，CBC I 於逆微胞中對於三醣 之反應趨勢與粗酵素液相似。而對於其水解產物二 醣而言，從開始反應至 3 h 可發現二醣的量有下降 並維持一段時間為低濃度的情形，推測在 0 到 1 h 之間，因所供給之二醣濃度極高，造成水解之逆反 應速率增加，CBC I 將二醣聚合成為四醣，也可能 將二醣與三醣合成為五醣。 圖二 逆微胞中 CBC I 與幾丁二醣及三醣於 40℃ 時之反應結果 CBC II 作用於幾丁二醣、三醣之變化量是呈現先減 少後增加的趨勢（圖三），反應開始便造成二醣及 三醣濃度大幅降低，同樣可能有合成反應發生於 0 到 3 h 之間。但至 4 h 時濃度又有部分增加，或許 是合成出來的產物又被 CBC II 再度水解所致。 Reaction time ( h ) 0 1 2 3 4 Oligos ac c harid es c onc ent rat ion ( m g/ m L ) 0 1 2 3 4 chitobiose chitotriose chitotetraose chitopentaose chitohexaose Reaction time ( h ) 0 1 2 3 4 Ol ig osac c ha ri de s c on c e nt rat io n ( m g /m L ) 0 1 2 3 4 chitobiose chitotriose chitotetraose chitopentaose
Operation time ( h ) 0 1 2 3 4 O lig o sa cc h a rid e s co n ce n tr a tio n ( m g /m L ) 0 2 4 6 8 chitobiose chitotriose chitotetraose chitopentaose chitohexaose Pe a k a re a 0 1e+5 2e+5 3e+5 4e+5 5e+5 chitoheptaose chitooctaose chitononaose 圖三 逆微胞中 CBC II 與幾丁二醣及三醣於 40 ℃時之反應結果 CBC III 能於逆微胞中快速降低幾丁二醣及三醣的 濃度，三醣降低幅度更大於二醣（圖四）。於反應 2 h 時二醣及三醣的量皆為最低，約為原先反應之 濃度的 18 %及 11 %。依據質量平衡定律，降低之 二、三醣應該仍存在於此系統中，故推測應為合成 出高聚合度之寡醣，遺憾的是無法從使用之分析方 法看出其合成之直接證據，有待後續研究之探討。 圖四 逆微胞中 CBC III 與幾丁二醣及三醣於 40 ℃時之反應結果。 （五）、利用連續式膜反應器生產幾丁寡醣
本研究使用的中空纖維型分離膜（A/G
Technology Polysulfone Membrane；
UFP-3-c-4MA），分子篩為 3000 Daltons，纖維
管徑 0.5 mm，膜表面積為 0.065 m
2，於 25-50
℃下操作時進口壓力上限為 45 psi，pH 適用範
圍為 2-13。使用之受質為去乙醯度 95%之幾丁
寡醣溶於 0.2M,pH=5 醋酸緩衝液中。
七、八醣之產量於 3.5 h 後急劇減少。六醣的濃度 在 1.5 h 達到 5.6 mg/mL 最高，之後微幅降低。幾丁 三醣的量則隨反應時間延長而有增加的趨勢。 圖五 在 E/S ratio 為 0.05 的 條 件 下 幾 丁聚醣 於 膜反應器中生產幾丁寡醣之組成變化 （2）、酵素/受質比為 0.075 時之反應 圖六顯示在 E/S ratio 為 0.075 的條件下，反應並無 九醣生成，即使是八醣也只出現在反應 1 h 的時間 點。值得注意的是，當八醣的波峰於 1.5 h 時消失， 幾丁三醣及五醣的濃度反而急速增加，故推測幾丁 聚 醣 可 將 幾 丁 八 醣 再 水 解 成 幾丁 三 及 醣 五 醣。 圖六 在 E/S ratio 為 0.075 的條件下，幾丁聚醣 於 膜 反 應 器 中 生 產 幾 變 丁 化 成 寡 醣 之組 （3）、酵素/受質比為 0.1 時之反應 圖七顯示在 E/S ratio 為 0.1 膜反應器之結果，在 1 h Reaction time ( h ) 0 1 2 3 4 O lig o s a cc h a rid e s co n c e n tra tio n ( mg /mL ) 0 1 2 3 4 chitobiose chitotriose chitotetraose Reaction time ( h ) 0 1 2 3 4 Oligos ac c harid es c onc ent rat ion ( m g/ m L ) 0 1 2 3 4 chitobiose chitotriose Operation time ( h ) 0 1 2 3 4 O lig o s a c c h a ri d e s c o n c e n tra ti o n ( m g /m L ) 0 2 4 6 8 chitobiose chitotriose chitotetraose chitopentaose chitohexaose Peak a rea 0.0 2.0e+5 4.0e+5 6.0e+5 8.0e+5 1.0e+6 1.2e+6 chitoheptaose chitooctaose chitononaose現象之發生，初步推測可能是因為低聚合度之寡醣 間進行轉醣反應或是九醣被水解而造成七醣、八醣 的濃度增加。操作 2 h 之後，七醣、八醣之濃度下 降，表示又再度被水解，此時四、五、六醣之濃度 增加。操作 4 h 可以觀察到高於六醣之寡醣波峰已 消失不見，而四醣、五醣及六醣的濃度有顯著增 加。表示較高聚合度之寡醣在反應器中之濃度增加 後，即變成主要的受質而被再進行第二次水解。 圖七 在 E/S ratio 為 0. 1 的 條 件 下 ， 幾丁聚醣 於膜反應器中生產幾丁寡醣之組成變化 幾可 丁 聚 醣 在 膜 反 應 系 統， 中 聚將 醣 水 解 成 寡醣，並且使小分子醣類可隨時透出膜，能觀察到 中間產物的組成變化情形。本研究發現高酵素濃度 時（E/S ratio 為 0.1），有類似轉醣反應的現象。此 轉醣現象在 E/S ratio 為 0.075 及 0.05 時並沒有發生。 （六）、結論 根據逆微胞之實驗結果可知雖有轉醣反應之 發生，但由於影響酵素於逆微胞中反應之因素很 多，且實驗時酵素與受質之用量皆很低，導致實驗 結果之再現性不佳。且較高聚合度之寡醣在分析上 較為困難，無法以質量平衡計算寡醣間之轉化量， 不易討論其轉醣之可能機制。另外，由於逆微胞對 酵素分子之影響機制未明，在核心水相的反應更是 難以預期，僅能以控制反應之條件來進一步觀察酵 素反應之情形，例如：調整逆微胞中不同之水分含 量、改變反應之 pH 值、改變寡醣受質之聚合度及 組合等。後續研究應以改變上述條件來探討幾丁聚 醣 與 幾 丁 寡 醣 間 之 作 用 機 制 ，以 找 出 及 轉醣反應 發生之最佳條件。 利 用 幾 丁 聚 醣 於 膜 反 應器中水解幾丁聚 醣，不但具有反應條件易控制，反應體積大，產物 量多等優點之外，於實驗中已證實只需降低酵素用 量即可產生高聚合度寡醣（七、八、九醣）。然而， 今後仍需針對各操作條件作進一步之研究，以期能 以膜反應器生產更高量具生理活性的寡醣。 五、參考文獻
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