行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫名稱：腫瘤壞死因子變異型與感染症嚴重程度之相關性
計畫編號：NSC90-2314-B-002-159
執行期限：90 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
主持人：李秉穎
執行機構及單位名稱：台大醫學院小兒科
中文摘要 人類基因圖譜的呈現讓科學家有機會一窺基因與疾病感受性的關連 性，而腫瘤壞死因子是發炎反應中很重要的一種細胞激素，也跟敗血症的致 病機轉有關。所以近年來有許多研究就針對掌控 TNF 的基因，做疾病相關性 的研究。在 TNF-á 轉錄基因序列上游的第 308 對核酸，常常發生 guanine (野 生原型，稱為 TNF1 型)被 adenine 置換(稱為 TNF2 型)的基因變異型。發生這 種核酸轉變以後，TNF2 型的 TNF-á 製造量會增加，而且跟很多感染症的感 受性有關。 在一些敗血症病人的研究中，一個法國的研究發現 TNF2 型的個人比較 容易發生敗血症，而且這種病人發生敗血性休克的時候，死亡率比較高。來 自台灣的研究也發現，台灣地區一般人口中，TNF2 型佔了大約 12%，而這 種基因型也跟敗血性休克的死亡率有關。此外，TNF1 型在氣喘兒童比較常 見。兒童時期的氣喘發作之中，有 40-60% 可以找到特殊的病毒感染， 一般 最常被提到的是呼吸道細胞融合病毒，所以值得研究細支氣管炎是否也與這 種基因型有關，藉以釐清細支氣管炎的致病機轉。 本研究針對敗血症、嚴重肺炎、細支氣管炎、氣喘等疾病，收集個案，並 分析 TNF 變異型對於這些疾病的影響。根據 TNF 基因分析的結果，將之區分 為有無變異型，發現細菌性肺炎與敗血症患者有變異型的比率高於對照的健康 兒童，但用 chi-square test with Yates’ correction 的檢定結果並未達到有意義的 地步。英文摘要
Susceptibility of human to infections may be related to various genes. It is known that tumor necrosis factor (TNF) is an important cytokine in the inflammatory process, and it is also related to the pathogenesis of sepsis syndrome. There have been several studies indicating the correlation between TNF gene and various diseases. A polymorphism located 308 base pairs upstream from the transcriptional start of the TNF-á gene has been identified that is the result of a guanine (wild-type, TNF1) to adenine (TNF2) substitution. Although the mechanism is unclear, the TNF2 allele appears to increase constitutive and inducible levels of TNF-á, and has been associated with both increased susceptibility to, and severity of, a number of infectious diseases, including sepsis and asthma. The present study is aimed to delineate the association of TNF-á gene polymorphism and sepsis, asthma, bronchiolitis, severe pneumonia.
計畫緣由與目的
每一個人對於各種感染症的免疫力可能都有不同，眾所熟知會影響到發病 率與發病嚴重度的因素包括免疫缺損疾病與其他慢性疾病、性別、侵入人體的病 原量、病原本身的變異等。但是還有很多我們不清楚的宿主因素，我們不了解為 什麼大多數小孩得到呼吸道細胞融合病毒(respiratory syncytial virus)感染時，只 有類似感冒的症狀，但有些則會變成細支氣管炎；我們不了解為什麼腸病毒七十 一型感染，只有千分之一到萬分之一的死亡率，死亡的個案到底有哪些特質讓他 們發病如此嚴重？ 以前的研究就顯示，某些感染症的發生與個人基因可能有關 [1]。這些證據 來自於對肺結核、痲瘋病、瘧疾、幽門曲狀桿菌的雙胞胎研究 [2-5]，而在領養 小孩的研究中也發現，如果親生父母早年死於感染症，那這些被領養小孩早年死 亡的機率就會增加 [6]。 人類基因圖譜的呈現讓科學家有機會一窺基因與疾病感受性的關連性，在 這複雜的核酸序列中，常常發生單核酸的變異型(single nucleotide polymorphism)，平均每 300 到 600 個核酸就會有一個變異 [7]。如果這些核酸變 異發生在掌控免疫功能的基因上，可能就會影響到個體對於感染症的感受性。了 解這些核酸變異，不只在將來可能可以預測某特定個體對於疾病的感受性，更重 要的是這些資訊可能幫助我們了解疾病發生的致病機轉，並且進一步發展出更有 效的疫苗或治療方法。例如當我們知道某種疾病病人的血中 X 因子上升的時候， 這種現象可能只是疾病所導致的結果，也可能是導致疾病嚴重度的重要原因。如 果能夠證實掌控 X 因子的基因變異型與疾病嚴重度有關，那麼 X 因子直接導致 嚴重疾病的可能性就大為增加，我們也就可以針對 X 因子想辦法做治療或預防 上的突破 [1]。
腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是發炎反應中很重要的一種細胞 激素，也跟敗血症的致病機轉有關。所以近年來有許多研究就針對掌控 TNF 的 基因(位於人類第六對染色體上面)，做疾病相關性的研究 [8,9]。在 TNF-á 轉錄 基因序列上游的第 308 對核酸，常常發生 guanine (野生原型，稱為 TNF1 型)被 adenine 置換(稱為 TNF2 型)的基因變異型。發生這種核酸轉變以後，TNF2 型的 TNF-á 製造量會增加，而且跟很多感染症的感受性有關 [10]。 一開始的研究是英國學者在甘比亞針對腦部瘧疾所作的研究 [11]，該研究 在腦部瘧疾患者比較容易出現高量 TNF 的前提下，進行一項個案對照研究，結 果發現具有 TNF2 型的甘比亞小孩，他們因為瘧疾死亡或併發腦部瘧疾的相對危 險性是其它小孩的七倍。雖然 TNF 基因在基因圖譜上的位置與一些 HLA 位址有 關連性，但是他們證實 TNF 基因變異型對於疾病的影響是獨立的，而與第一型 MHC、第二型 MHC 都無關。至於為什麼 TNF 製造量比較高的時候，會比較容 易發生腦部瘧疾，其原因並不清楚。有人猜測可能是 TNF-á 增加了血管內皮細
加製造一氧化氮(nitric oxide)，所以容易阻礙神經傳導進而導致昏迷 [11]。 在一些敗血症病人的研究中，一個法國的研究發現 TNF2 型的個人比較容 易發生敗血症 (敗血症病人 39%，正常對照 18%)，而且這種病人發生敗血性休 克的時候，死亡率比較高 [9]。來自台灣的研究也發現，台灣地區一般人口中， TNF2 型佔了大約 12%，而這種基因型也跟敗血性休克的死亡率有關 [12]。除了 TNF-á 轉錄基因序列上游的第 308 對核酸以外，此基因上游的地 238 對核酸與第 376 對核酸，如果發生 G->A 轉換的話，也可能對感染症的感受性有影響 [9,13,14]。其中，第 238 對核酸的置換，反而可能會降低感染症的感受性。 其他有關 TNF2 型的研究還有很多，這種變異型對於各種感染症的影響好 像並不一致，包括在得到麻瘋病感染後比較容易發生 lepromatous leprosy [15]、 死於腦膜炎雙球菌(meningococcus)感染的機會較大 [16]、比較容易得到嚴重的 漢他病毒感染 [17]、容易得到 brucellosis [18]。 此外，TNF1 型在氣喘兒童比較常見 [19]。兒童時期的氣喘發作之中，有 40-60% 可以找到特殊的病毒感染 [20,21]， 一般最常被提到的是呼吸道細胞融 合病毒。在一個研究之中，發現得到呼吸道細胞融合病毒感染的兒童，如果在臨 床上出現哮鳴聲 (wheezing)，其中有 65.7% 的兒童可以測到對此病毒具有特異 性的 IgE 抗體；如果沒有出現哮鳴聲，則特異性 IgE 抗體的出現機率只有 9.1% [22]。 其他針對副流行性感冒病毒的研究，也有類似的發現。這些發現顯示某些 病毒感染可能可以在呼吸道引發第一型的過敏反應，再經由 IgE、組織胺 (histamine) 的釋放與作用，而導致氣喘或哮鳴的發作。因為 TNF1 型與氣喘有相 關性，所以值得研究細支氣管炎是否也與這種基因型有關，藉以釐清細支氣管炎 的致病機轉。 本研究預定針對敗血症、嚴重肺炎、細支氣管炎、氣喘等疾病，收集個案， 並分析 TNF 變異型對於這些疾病的影響。 材料與方法 〔研究對象〕 1. 收集 30 名社區感染肺炎兒童，其中 11 名為細菌性肺炎，包括肺炎雙球菌 肺炎 6 例與未知病原者 5 例。未知病原者是根據其膿胸或血壓不穩等變化 判定為較嚴重的細菌性肺炎。另外 19 名兒童罹患的是非細菌性肺炎，其 中 8 例經過抗體檢查證實為黴漿菌感染，其餘 11 例之病原未知。 2. 收集 46 名氣喘兒童。 3. 收集 37 名細支氣管炎兒童。 4. 收集 9 名敗血症病人。 5. 收集 48 名健康兒童作為對照，他們以前都沒有氣喘、慢性疾病與其他重 大疾病。
〔檢體〕
血液檢體：每人抽取一次血液，每次 5-10 毫升，分離出血清與單核球以 後保存於攝氏零下二十度。
〔聚合酵素連鎖反應〕
1. 以 phenol/chloroform 純化單核球的 DNA
2. 將 DNA 做 PCR 增幅反應，先質 (primer) 為 5' CAA ACA CAG GCC TCA GGA CTC 、5'AGG GAG CGT CTG CTG GCT G [3]。
3. PCR: 取 DNA 抽取液 10 ìl 做為模板 (template) 進行反應。反應終體積為 100 ìl，成分包括 10 mM Tris.HCl (pH 8.3)、1.5 mM MgCl2、50mM KCl、 0.01% gelatin (wt/vol)、200 ìM dNTP、1 ìM 先質 (primer)、2U Taq 聚合 酵素。反應設定為先在攝氏 94 度 3 分鐘，然後跑 32 循環的 94 度 40 秒、55 度 1 分鐘、72 度 1 分鐘，最後在攝氏 72 度 10 分鐘。此反應 的敏感度約為 10 個病毒 DNA。
4. 1.5% gel electrophoresis。
5. 以 DNA sequencing kit 直接做核酸序列的定序。
〔統計分析〕
以 Chi-square test with Yates’ correction 分別比較各組之間數據的差異。
結果與討論
根據 TNF 基因分析的結果，將之區分為有無變異型，發現細菌性肺炎與敗 血症患者有變異型的比率高於對照的健康兒童 (表)，但用 chi-square test with Yates’ correction 的檢定結果並未達到有意義的地步。這可能是個案數太少的關 係，所以必須進一步收集更多個案才能獲致確切的結論。本研究計畫原訂以兩年 時間收到足夠的個案數，但審查後被刪減成一年，而且研究助理名額也被取消。 身為一位臨床醫師，國科會應該考量醫師個人無法獨力完成這種需要花費很多人 力與時間的研究。 參考文獻
1. Kwiatkowski D. Susceptibility to infection. Br Med J 2000; 321:1061-5. 2. Comstock GW. Tuberculosis in twins: a re-analysis of prophit survey. Am Rev
leishmaniasis. An epidemiological perspective. Int J Lepr Other Mycobact Dis 1981; 49:437-54.
4. Jepson AP, Banya Wa, Sisay-Joof F, et al. Genetic regulation of fever in Plasmodium falciparum malaria in Gambian twin children. J Infect Dis 1995; 172:316-9.
5. Malaty HM, Engstrand L, Pederson NL, et al. Helicobacter pylori infection: genetic and environmental influences. A study of twins. Ann Intern Med 1994; 120:982-6.
6. Sorensen TI, Nielsen GG, Andersen PK, et al. Genetic and environmental influences on premature death in adult adoptees. N Engl J Med 1988; 318:727-32.
7. Cargill M, Altshuler D, Ireland J, et al. Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes. Nat Genet 1999; 22:231-8. 8. Stuber F, Peterson M, Bokelmann F, et al. A genomic polymorphism with in the
tumor necrosis factor locus influences plasma tumor necrosis factor
concentrations and outcome of patients with severe sepsis. Crit Care Med 1996; 24:381-4.
9. Mira JP, Cariou A, Grall F, et al. Association of TNF2, a TNF promotor polymorphism, with septic shock susceptibility and mortality. JAMA 1999; 282:561-8.
10. Pociot F, Briant L, Jongeneel CV. Association of tumor necrosis factor (TNF) and class II major histocompatibility complex alleles with the secretion of TNF-alpha and TNF-beta by human mononuclear cells: a possible link to insulin-dependent diabetes mellitus. Eur J Immunol 1993; 23:224-31.
11. McGuire W, Hill AVS, Allsopp CEM, et al. Variation in the TNF-á promotor region associated with susceptibility to cerebral malaria. Nature 1994;
371:508-11.
12. Tang GJ, Huang SL, Yien HW, et al. Tumor necrosis factor gene polymorphism and septic shock in surgical infection. Crit Care Med 2000; 28:2733-6.
13. McGuire W, Knight JC, Hill AVS, et al. Severe malarial anemia and cerebral malaria are associated with different tumor necrosis factor promoter alleles. J Infect Dis 1999; 179: 287–290.
14. Knight JC, Udalova I, Hill AVS, et al. A polymorphism that affects OCT-1 binding to the TNF promoter region is associated with sever malaria. Nat Genet 1999; 22: 154–150.
15. Roy S, McGuire W, Mascie-Taylor CGN, et al. Tumor necrosis factor promoter polymorphism and susceptibility to lepromatous leprosy. J Infect Dis 1997; 176:530-2.
16. Nadel S, Newport MJ, Booy R, Levin M. Variation in the tumor necrosis factor-á gene promoter region may be associated with death from
meningococcal disease. J Infect Dis 1996; 174:878-80.
17. Kanerva M, Vaheri A, Mustonen J, Partanen J. High-producer allele of tumour necrosis factor-alpha is part of the susceptibility MHC haplotype in severe puumala virus-induced nephropathia epidemica. Scand J Infect Dis 1998; 30:532-4.
18. Caballero A, Bravo MJ, Nieto A, Colmenero JD, Alonso A, Martin J. TNFá promoter polymorphism and susceptibility to brucellosis. Clin Exp Immunol 2000; 121:480-3.
19. Albuquerque RV, Hayden CM, Palmer LJ, et al. Association of polymorphism within the tumour necrosis factor (TNF) genes and childhood asthma. Clin Exp Allergy 1998; 578-84.
20. McIntosh K, Ellis EF, Hoffman LS, Lybass TG, Eller JJ, Fulginiti VA. The association of viral and bacterial respiratory infections with exacerbations of wheezing in young asthmatic children. J Pediatr 1973; 82:578-90.
21. Minor ET, Dick EC, DeMeo AN, Ouellette JJ, Cohen M, Reed CE. Viruses as precipitants of asthmatic attacks in children. J Am Med Assoc 1974; 227:292-8. 22. Welliver RC, Wong DT, Sun M, et al. The development of respiratory syncytial
virus-specific IgE and the release of histamine in nasopharyngeal secretions after infection. N Engl J Med 1981; 305:841-6.
表、TNF 基因變異型發生頻率 TNF 基因變異型(+) 個案數 個案數 比率 (%) P value* 細菌性肺炎 11 3 27.2 NS 非細菌性肺炎 19 3 15.8 NS 氣喘 46 6 13.0 NS 細支氣管炎 37 10.8 NS 敗血症 9 2 22.2 NS 健康兒童 48 5 10.4 NS
*與對照組比較，Chi-square test with Yates’ correction。 簡寫: NS = not significant。
