行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
建構新穎的附基因體圖譜的整合平台
研究成果報告(精簡版)
計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 98-2221-E-151-040- 執 行 期 間 ： 98 年 08 月 01 日至 99 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立高雄應用科技大學電子工程系 計 畫 主 持 人 ： 楊正宏 共 同 主 持 人 ： 莊麗月、張學偉 報 告 附 件 ： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處 理 方 式 ： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢中 華 民 國 99 年 10 月 31 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
■ 成 果 報 告
□期中進度報告
建構新穎的附基因體圖譜的整合平台
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC 98-2221-E-151-040
執行期間： 2009 年 8 月 1 日至 2010 年 7 月 31 日
計畫主持人：
楊正宏 國立高雄應用科技大學電子工程系
共同主持人：
莊麗月 義守大學化學工程系
張學偉 高雄醫學大學生物醫學暨環境生物學系
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
■出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：國立高雄應用科技大學
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
建構新穎的附基因體圖譜的整合平台
Development of a novel integrated platform for epigenomic profiles
計畫編號：NSC
98-2221-E-151-040
執行期限：2009 年 8 月 1 日至 2010 年 7 月 31 日
主持人：楊正宏 國立高雄應用科技大學電子工程系
共同主持人：莊麗月 義守大學化學工程系
張學偉 高雄醫學大學生物醫學暨環境生物學系
一、中文摘要 DNA 甲 基 化 與 基 因 表 現 量 密 切 相 關，藉由檢驗 DNA 甲基化的程度與分佈， 可以解析各種疾病跟癌症的分子病理機 制，進而找出病情相關的甲基化標誌。然 而目前分析甲基化的工具，缺乏便利性及 整合性的分析系統，使得生物學者及研究 人員在分析甲基化圖譜時受到限制，無法 有效率的進行研究。本研究計畫有效的將 甲基化相關資訊與分析功能加以整合，主 要工作為在啟動子(promoter)區域序列中 尋找 CpG 雙核苷酸 (dinucleotides)可能發 生甲基化的位置，設計一個 CpG RFLP (限 制片段長度多型性，restriction fragment length polymorphism)分析演算法，同時開 發視覺化的甲基化分析系統並利用分子生 物之實驗給予驗證。 關鍵詞：甲基化、啟動子、CpG 雙核苷酸、 限制片段長度多型性 AbstractThe degree of DNA methylation is directly related to gene expression. Measuring the level and distribution of DNA methylation can shed light on the molecular pathological mechanisms and facilitate identification of methylated markers related to diseases and cancers. However, currently available analytic tools for methylation lack in convenience and integration, which makes is difficult for researchers to interpret the methylation profile effectively. Hence, a
powerful and integrated platform for methylation analysis is essential to improve the understanding of the relationship between methylation and diseases/cancers. Accordingly, we propose a the plan to archive this goal of providing possible CpG dinucleotides of methylation sites in promoter region. CpG RFLP (restriction fragment length polymorphism) algorithm is implemented, and the results of the methylation analysis are depicted graphically. Molecular biology experiments can be used to validate the results.
Keywords: methylation, promoter, CpG dinucleotides, restriction fragment length polymorphism 二、緣由與目的 DNA 甲基化過程中，使得甲基添加到 DNA 分子上，可見於所有脊椎動物。在人 類細胞內，大約有 1%的 DNA 鹼基受到了 甲基化。在成熟體細胞組織中，DNA 甲基 化 一 般 發 生 於 CpG 雙 核 苷 酸 (CpG dinucleotide)部位；而非 CpG 甲基化則於 胚胎幹細胞中較為常見[1, 2]。植物體內胞 嘧啶的甲基化則可分為對稱的 CpG(或 CpNpG)，或是不對稱的 CpNpNp 形式(C 與 G 是鹼基；p 是磷酸根；N 指的是任意 的核苷酸)，此外，也有一些生物體內不存 在 DNA 甲基化作用。在原核生物中，DNA 甲基化能對 DNA 進行修補及自我 DNA 保 護，對於 DNA 而言具有重要的修飾作用； 在植物中，則可對基因組進行管理及調節
基因表現，進而調節植物的生長發育[3]。 甲基化的模式是現今研究的重要議 題。基因組的低甲基化會導致染色體的不 穩定及增加突變機會，並且在細胞中的整 體 甲 基 化 狀 態 可 能 是 引 發 癌 症 的 因 素 [4]。CpG 位點的甲基化可以對基因表現有 重要的影響，甲基化的組織蛋白可以在表 觀遺傳上壓抑或活躍化基因表現，並且甲 基化可能使基因沉默化，進而使其失去功 能。在正常組織內，基因的甲基化主要是 分佈在缺少 CpG 位點的編碼區。相反的， 雖然基因啟動子區塊內有高密度的 CpG 島，但都是沒有被甲基化的。在腫瘤中， 腫瘤的特徵是不平衡的甲基化，伴隨基因 組的低甲基化是區域性的高甲基化，及 DNA 甲基化轉移酶的基因表現上升[5]， 因此某些基因的甲基化狀態會是腫瘤生成 的生物標誌，如谷胱甘肽 S 轉移酶 Pi 基因 的甲基化是前列腺癌的可靠診斷指標[6]。 DNA 甲基化程度與基因表現密切相 關，藉由檢驗出的 DNA 甲基化程度可用 來研究與基因有關的疾病跟癌症。目前有 許多的分析及視覺化工具和資源可供生物 學者及研究人員利用，然而，這些工具或 資源大都僅針對單一生物功能面做搜尋及 分析，因此，要能夠完整的分析甲基化的 程度甚為困難。為了幫助生物學者及研究 人員在甲基化的分析及研究上有所突破， 本研究計畫整合了 CpG islands 搜尋及 promoter 資料庫，在 promoter 區域序列中 尋找 CpG 雙核苷酸可能甲基化的位置，設 計 CpG RFLP 分析演算法及 PCR 引子，並 開發視覺化甲基化分析系統並加以驗證。 三、研究方法及結果 由於甲基化位於 promoter 區域且有高 密度的 CpG islands 將會造成病變。為了針 對甲基化進行研究分析，本年度計畫結合 了 CpG islands 搜尋及 promoter 資料庫以 研發找出在 promoter 區域的 CpG island 可 能發生甲基化的位置並以視覺化呈現，以 開發甲基化視覺化分析系統，最後藉由實 驗結果以驗證本系統。底下分為 1) CpG islands 搜尋；2) promoter 資料庫建置；3) CpG RFLP 分析演算法的設計；4) 視覺化 方式呈現及 5) 甲基化實驗來說明本研究 計畫之研究方法與結果。 1) CpG islands 搜尋 在 CpG islands 搜尋方面，本計畫使用 了 TJ’s CpG islands 搜尋演算法[7]，TJ’s 演算法是由 Takai 和 Jones 所提出，演算過 程是透過一個 200 bps 的移位窗格去做移 位並搜尋 CpG island 的動作，詳細步驟說 明如下： Step 1. 設定一個 200 bps 的移位窗格，並 從序列的起始位置開始做移動，每 次只移動一個鹼基 (base)，然後計 算目前窗格序列的 GC content 及 ObsCpG/ExpCpG，如圖 1-A。 Step 2. 若找到符合 CpG island 標準的序 列，則繼續移動窗格至找到之 CpG island 序列的最後，並繼續計算以 尋找 CpG island，如圖 1-B、1-C。 Step 3. 重複 Step 2，繼續計算目前窗格序 列以尋找符合 CpG island 標準的 序列，如圖 1-D、1-E。 Step 4. 如 果 目 前 窗 格 的 序 列 沒 有 符 合 CpG island 標準，則將最後的窗格 往序列 5’ 端移動一個鹼基，直到 找 到 符 合 CpG island 標 準 的 序 列，如圖 1-F、1-G。 Step 5. 評 估 目 前 為 止 所 有 的 窗 格 的 區 塊，如果符合 CpG island 標準， 則所有的窗格合併的序列則判定為 CpG island，如圖 1-H，否則，從兩 邊縮減一個鹼基，直到全部窗格的 區塊符合 CpG island 標準。 Step 6. 當兩個 CpG island 間的距離少於 100 bps 時 ， 則 評 估 兩 個 CpG islands 合 併 後 的 序 列 是 否 符 合 CpG island 標準，如果是的話，則 合 併 兩 個 CpG islands 為 一 個 CpG island，否則不做合併的動作。
2 圖 1. TJ’s 演算法的搜尋過程， 代表 DNA 序列， 代表 GpG 位點， 代表 200 bps 的移位窗格，透過 200 bps 移位窗格，TJ’s 演算法將搜尋全部 DNA 序列中的 CpG islands， 並且把距離少於 100 bps 的 CpG islands 合併起來成為一個 CpG island。 2) promoter 資料庫建置 Promoter 資料庫模組使用轉錄起始位 點資料庫 (database of transcriptional start sites, DBTSS) [8]，主要包含 Human 及 mouse 兩個物種的序列資料，此資料庫經 由完善的維護及更新，可提高之後要預測 及分類 promoter 的正確率。 3) CpG RFLP 分析演算法的設計 在 RFLP 分析方面，本計畫將建置 REBASE database [9]，並採用平均效率較 快的 Boyer-Moore algorithm [10]以提高搜 尋比對的效率。由於甲基化有可能發生在 CpG 位點，因此，必須要針對 CpG 位點 作 RFLP 分析，預期採用的分析的過程如 下： 首先將發生 CpG 位點的地方視為甲基 化的部份，即具有 C 跟 T 的多型性，因此 將序列分成兩組序列，其中這兩組序列差 異 只 在 該 甲 基 化 位 置 上 。 然 後 採 用 Boyer-Moore 字串比對方法，在兩個序列 中個別尋找 REBASE 資料中存有的限制 內切酶辨識序列，如圖 2 所示。由於兩序 列除甲基化位點外，左右兩旁的 flanking sequence 都是相同的，因此尋找到限制內 切酶也一定是相同的，因此，不同的限制 內切酶只有在甲基化位置才有可能被找到 (含甲基化的限制酶辨識序列)，如圖 2 方 塊圈起的部分，因此利用此特性，判斷甲 基化序列能不能被限制內切酶所區別，找 出可用的限制酶資訊。此部份將利用我們 先前研發的成果 SNP-RFLPing [11](發表 於 BMC Genomics, 2009 SCI=3.759)為程 式核心來做 RFLP 分析工作。 圖 2. 尋找限制內切酶，兩序列的限制內切 酶發生在 allele 上會有所不同 4) 視覺化方式呈現 視覺化可以清楚的呈現資料的內容、性 質及其特性，為了能夠方便生物學者或研
究人員能方便觀察序列資訊，本計畫將 CpG island、甲基化 RFLP 分析做視覺化的 輸出呈現。輸入序列將以藍色表示核苷 酸，綠色表示 CpG island 的部份，以及紅 色表示 CpG 的位點，如圖 3 所示。 圖 3. 輸入序列的視覺化呈現，將 CpG island 及 CpG 位點做視覺化呈現，序列中 藍色表示核苷酸，綠色表示 CpG island 的 部份，以及紅色表示 CpG 的位點。 此外，在甲基化 RFLP 分析方面的視覺 化，將呈現如下圖 4 所示，圖 4-A 顯示所 有可以辨認在 CpG island 序列中甲基化的 限制酶圖形，圖 4-B 顯示生物學者或研究 人員有興趣的限制酶圖形，其對應的限制 酶序列如圖 4-E 淡黃色背景標示。圖 4-C 顯示序列中可以辨認 CpG island 序列中甲 基化的限制酶序列位置，其對應的限制酶 序列如圖 4-E 淡黃色背景標示。圖 4-D 顯 示 CpG island 的相關資訊，包括 start position、end position、%GC、ObsCpG / ExpCpG 及 length。 同樣的，Bisulfite T Stretch 的位置也將 被顯示，如圖 5 所示，本計畫將搜尋序列 中連續的 T 鹼基，並以紅色字體將其標示 出來，生物學者或研究人員可以調整欲觀 察連續 T 鹼基的個數。 圖 5. Bisulfite T Stretch 位置標以紅色字體 5) 甲基化實驗 對於甲基化實驗分析，本研究計畫已與 高雄醫學院張學偉 教授合作，針對口腔 癌，利用本計畫所設計之甲基化分析系統 提供之資訊進行 PCR-RFLP 甲基化實驗， 實驗成果部份如圖 6 所示： 圖 4. 甲基化 RFLP 分析的視覺化， A 為視覺化所有可以辨認在 CpG island 序列中甲基 化的限制酶圖形；B 為所選取 CpG 位點的限制酶圖形，其對應的限制酶序列為 E 中淡 黃色背景的部份。C 為序列中可以辨認 CpG island 序列中甲基化的限制酶序列位置，其 對應的限制酶序列也為 E 中淡黃色背景的部份。而 D 顯示 CpG island 的相關資訊，包 括 start position、end position、%GC、ObsCpG / ExpCpG 及 length。
4 圖 6. 本計畫設計之甲基化分析系統針對口腔癌提供之資訊進行 PCR-RFLP 甲基化實驗 四、結論與計畫成果自評 目前的研究對於甲基化分析方面大部 分是屬於實驗性質，許多研究論文探討分 析甲基化檢測的技術及在各種病變上的甲 基化分析，雖然有些與甲基化病變的資料 庫已經建置出來，但卻缺乏一個系統化的 整合分析工具被提出，這使得甲基化方面 的研究進展受到限制。 本年度計畫的貢獻為針對甲基化的位 置開發一個 RFLP 分析演算法，並整合 CpG islands 搜尋及 promoter 資料庫，建構 一套方便生物學者及研究人員使用的甲基 化視覺化分析系統，以輔助生物學者及研 究人員分析甲基化的情況及並進行實驗驗 證。簡要列出本年度研究計畫之預期成果 貢獻如下： (1) 建立甲基化視覺化分析的平台，便利 研究人員使用。 (2) 開發一個 CpG RFLP 分析演算法，提 供可用的限制酶資訊。 (3) 整合 CpG islands 搜尋及 promoter 資 料庫。 (4) 提供口腔癌 PCR-RFLP 甲基化實驗 驗證。 (5) 研究成果已發表於期刊論文[12]。 本研究計畫相關之方法仍持續改良 中，以確保此研發成果能進一步輔助相關 研究人員，以符合生物資訊領域的要求。 六、參考文獻
[1] Dodge JE, Ramsahoye BH, Wo ZG, Okano M, Li E: De novo methylation of MMLV provirus in embryonic stem cells: CpG versus non-CpG methylation. Gene 2002, 289(1-2):41-48.
[2] Haines TR, Rodenhiser DI, Ainsworth PJ: Allele-specific non-CpG methylation of the Nf1 gene during early mouse development. Developmental biology 2001, 240(2):585-598.
[3] Finnegan EJ, Kovac KA: Plant DNA methyltransferases. Plant molecular biology 2000, 43(2-3):189-201.
[4] Nakayama M, Gonzalgo ML, Yegnasubramanian S, Lin X, De Marzo AM, Nelson WG: GSTP1 CpG island hypermethylation as a molecular biomarker for prostate cancer. Journal of cellular biochemistry 2004,
91(3):540-552.
[5] Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP: Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Advances in cancer research 1998, 72:141-196.
[6] Chen RZ, Pettersson U, Beard C, Jackson-Grusby L, Jaenisch R: DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates. Nature 1998, 395(6697):89-93.
[7] Takai D, Jones PA: Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002, 99(6):3740-3745.
[8] Wakaguri H, Yamashita R, Suzuki Y, Sugano S, Nakai K: DBTSS: database of transcription start sites, progress report 2008. Nucleic acids research 2008, 36(Database issue):D97-101. [9] Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis
D: REBASE--restriction enzymes and DNA methyltransferases. Nucleic acids research 2005, 33(Database issue):D230-232.
[10] Charras C, Lecroq T: Handbook of Exact String Matching Algorithms: King's College London Publications; 2004.
[11] Chang HW, Yang CH, Chang PL, Cheng YH, Chuang LY: SNP-RFLPing: restriction enzyme mining for SNPs in genomes. BMC genomics 2006, 7:30. [12] Cheng-Hong Yang, Li-Yeh Chuang,
Yu-Huei Cheng, De-Leung Gu, Chung-Ho Chen, and Hsueh-Wei Chang (2009). Methyl-Typing: An improved and visualized COBRA software for epigenomic studies. FEBS Letters 584:739-744. Feb.
1
國科會補助專題研究計畫項下出席國際學術會議心得報告
日期：99 年 5 月 20 日
一、參加會議經過
本次參與之研討會乃針對尖端電腦科技及理論為主題的國際年會，會議名稱為 International MultiConference of Engineers and Computer Scientists 2010 (IMECS 2010)，由 International Association of Engineers(IAENG)主辦之國際研討會。會議中包含了 13 個研討主題，分別為 Artificial Intelligence and Applications, Bioinformatics, Control and Automation, ComputerScience, Communication Systems and Applications, Data Mining and Applications, ElectricalEngineering, Imaging Engineering, Industrial Engineering, Internet Computing and Web Services, Operations Research, Scientific Computing and Software Engineering 等的應用。本次會議投稿的論文有 1047 篇，接受的論文有 589 篇，接受率 為 56.26%。作者分別來至各個國家，約有二百多位來自世界各地的專家學者參與該盛會。會議的 Keynote Speakers 分別是英國 University of Oxford 的 Prof. Alexander M. Korsunsky、University of Macau 的 Professor Wei Zhao 及 美國 Microsoft Corp.的 General Manager Dr. Bill Hilf。本次的會議 共分為三日進行，我們的論文報告排在次日的 Artificial Intelligence and Applications Session。筆者 在會議中發表一篇利用 SNP 基因組作 PCR-RFLP 引子設計基於遺傳演算法之論文，文中強調 PCR-CTPP (PCR with restriction fragment length polymorphism)是一種新穎的技術，具有不昂貴且快
計畫編號
NSC 98－2221－E－151－040
計畫名稱
建構新穎的附基因體圖譜的整合平台
出國人員
姓名
楊正宏
服務機構
及職稱
國立高雄應用科技大學 教授
會議時間
99 年 3 月 17 日至
99 年 3 月 19 日
會議地點
香港
會議名稱
(中文)2010 國際工程與電腦科學聯合會議
(英文) International MultiConference of Engineers and Computer
Scientists 2010 (IMECS 2010)
發表論文
題目
(中文)利用 SNP 基因組作 PCR-RFLP 引子設計基於遺傳演算法
(英文)A natural PCR-RFLP primer design for SNP genotyping using
a genetic algorithm
速的特性，適合應用於突變點偵測及單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism; SNP)之定型 上。而本論文則利用遺傳演算法所設計出來的引子對，最後進行相關的 PCR 實驗以測試 PCR 實驗 的正確性。此次發表的研究成果對於不管在生物資訊相關領域或是人工智慧、演算法領域的研究 均有具體的意義。筆者另有四篇論文發表於其他 section，分別為：Accelerated Linearly Decreasing Weight Particle Swarm Optimization for Data Clustering、Complementary Binary Particle Swarm Optimization for Operon Prediction、Primer Design for the PCR in Methylation Studis using PSO 及 A Method of Predicting tRNA Secondary Structure from Nucleotide Sequences。其中有兩篇榮獲 Best Paper Award。
二、與會心得
為期三天的研討會，每天分時段在不同研討室有主題式的分組會議，與會當中有多位學者提 出許多實際問題的討論，氣氛熱烈，使筆者從中獲得許多經驗。筆者並抽空到其他的場次聆聽與 會專家學者發表精闢的報告，並與他們交換研究心得，從中瞭解不同國家地區學術環境及社會現 況。經過此次國際性研討會之後真的是受益良多，吸收了一些新知與新的想法，對於日後研究提 供許多新的方向。此外，隨行參與研討會的學生也留下深刻的印象，並增進學生參加國際研討會 的經驗與見聞。會後，我們也至香港中文大學與澳門大學參觀及拜訪舊識，對於兩所大學的規模 及設備留下深刻的印象。本次研討會的整體規劃，從報到開始領的辨識名牌和相關資料的領取都 很便利及明確，讓參加會議的人可以很快速的了解會議的流程和簡介來選擇想聽的分組會議，在 會場的佈置及動線上都做了很好的規劃，餐點也符合當地的特色和各國的飲食需求。整體而言， 讓參加此研討會的人都留下了很好印象，可以作為日後學校或是系上舉辦研討會時的一個優良典 範。最後，感謝高雄應用科技大學與國科會經費的補助，使我得以順利出席本次會議發表論文， 於此深感謝意。三、考察參觀活動(無是項活動者略)
參觀香港中文大學及澳門大學四、建議
無。五、攜回資料名稱及內容
Proceeding of the International MultiConference of Engineers and Computer Scientists 2010 (IMECS 2010).
98 年度專題研究計畫研究成果彙整表
計畫主持人：楊正宏 計畫編號： 98-2221-E-151-040-計畫名稱：建構新穎的附基因體圖譜的整合平台 量化 成果項目 實際已達成 數（被接受 或已發表） 預期總達成 數(含實際已 達成數) 本計畫實 際貢獻百 分比 單位 備 註 （ 質 化 說 明：如 數 個 計 畫 共 同 成 果、成 果 列 為 該 期 刊 之 封 面 故 事 ... 等） 期刊論文 0 0 100% 研究報告/技術報告 0 0 100% 研討會論文 0 0 100% 篇 論文著作 專書 0 0 100% 申請中件數 0 0 100% 專利 已獲得件數 0 0 100% 件 件數 0 0 100% 件 技術移轉 權利金 0 0 100% 千元 碩士生 0 0 100% 博士生 0 0 100% 博士後研究員 0 0 100% 國內 參與計畫人力 （本國籍） 專任助理 0 0 100% 人次 期刊論文 1 1 100% 發 表 於 FEBS Letters，其 2009 IF 為 3.541 研究報告/技術報告 0 0 100% 研討會論文 0 0 100% 篇 論文著作 專書 0 0 100% 章/本 申請中件數 0 0 100% 專利 已獲得件數 0 0 100% 件 件數 0 0 100% 件 技術移轉 權利金 0 0 100% 千元 碩士生 0 0 100% 博士生 0 0 100% 博士後研究員 0 0 100% 國外 參與計畫人力 （外國籍） 專任助理 0 0 100% 人次其他成果
