台灣HIV-1分子流行病學–HIV-1亞型與危險因子監測

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(1)中國醫藥大學學位論文計畫書編號：IEH-1918. 台灣 HIV-1 分子流行病學 – HIV-1 亞型與危險因子監測 HIV-1 molecular epidemiology in Taiwan – HIV-1 subtype and risk factor surveillance. 所. 別：環境醫學研究所. 指導教授：藍郁青. 助理教授. 吳芳鴦. 中. 教授 Yi-Chen Yang. 學. 生：楊依蓁. 學. 號：9665018. 華. 民. 國. 98. 年. 6. 月.

(2) 致謝能順利的完成這篇論文最主要要感謝我的指導老師 – 藍郁青老師與吳芳鴦老師，給予我在學業、論文及實驗的細心指導，並且在我遇到瓶頸時總是不斷的鼓勵我、關心我，讓我在這兩年研究所生涯中學到比別人更多的知識。此外，也感謝論文的口試委員 – 陳宜民老師、呂淑妤老師及劉信孚老師，在百忙之中抽空參與論文口試，而且提出許多寶貴的建議，使得本論文更加完整和豐富。本研究中的問卷及血液樣本由行政院衛生署 (DOH95-DC-1016) 與行政院國家科學委員會 (NSC96-2314-B039013-MY3、NSC96-2314-B039-003-MY2) 計畫提供經費補助。在這兩年漫長的求學過程中，要感謝的人非常多。首先感謝王瑞筠老師對於論文相關內容的指導以及對我的關心；感謝林應如老師、陳世殷老師、黃毓銓老師及劉詩平老師在口試之前對於論文的內容提供了許多精闢的意見；感謝辦公室裡美麗的加麗學姐和冠樺學姐，除了教我做實驗之外，也常常幫我解決很多有的沒的問題，不時給我許多信心和鼓勵；還有我的朋友與同學們 – 可名、不點、婉靜、富美、依璇、惠慈以及實驗室可愛的學弟妹們–妤瑄、亞淇、瑋琦、郁菁、維劭、冠維、思安、如佩、季容，謝謝你們陪伴我度過許多難熬與快樂的時光。最後感謝我的家人們 –爸爸、媽媽、哥哥和小夫，謝謝你們不論在我忙碌、難過或開心的時候陪伴在我身邊，給我最大的支持，我愛你們!!. i.

(3) 摘要目的：本研究主要想監控 HIV-1 在台灣地區的傳播並找出防治的方法。因此研究分為兩個部份，(1)進行 HIV-1 亞型(subtype)監測，以了解目前 HIV-1 亞型分佈狀況，並進一步推估病毒株演化情形與其起始年代，並且探討 HIV-1 亞型與危險族群的關係；(2)透過問卷調查調查影響注射藥癮者感染 HIV-1 的危險因子，以建立注射藥癮者感染 HIV-1 的風險預測模式，用來預測高危險族群感染 HIV-1 的風險，並提高其自覺感染 HIV-1 的危險性，以逹到防治的效果。方法：研究對象收集來自 2004 年起已建立的 HIV-1 監測網，此監測網包括每 1~2 年收集台灣各地監所高危險群 – 注射藥癮者及中國醫藥大學附設醫院愛滋病特別門診內病患所做的 HIV/AIDS 知識、態度和行為之危險因子調查問卷和 HIV-1 陽性個案血液樣本。研究(1)，在 HIV-1 亞型監測方面，以 2007~2009 年間監測網內所收集來自監所和愛滋特別門診內 HIV-1 陽性病患之血液樣本，抽取 DNA 並針對 HIV-1 env 基因定序(Sequencing)做系統發生學分析(Phylogenetic analysis)以及多重巢式聚合酶連鎖反應(Nested multiplex PCR)來偵測 HIV-1 病毒株之 env 基因亞型，並應用溯祖理論 (coalescent theory)、分子鐘 (Molecular Clock)原理推估其演化情形及起源年代。最後，利用統計分析了解不同亞型感染者之感染 HIV-1 危險因子特性。研究(2)，注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式是使用監測網內 2004~2005 年間危險因子資料庫內注射藥癮者問卷資料，以病例對照研究法 (case-control study)探討其感染 HIV-1 的危險因子，並使用邏輯斯迴歸 (logistic regression)建立風險預測模式，再利用 ROC curve (Receiver operating characteristic curve) 分析進而得知注射藥癮者其感染 HIV-1 風險閾值 ii.

(4) (Threshold)。驗證此預測模式是以 2007~2008 年間危險因子資料庫內注射藥癮者問卷資料作為驗證。結果：(1)HIV-1 亞型監測：經過系統發生學分析及多重巢式聚合酶連鎖反應區別 HIV-1 亞型後，包括三種 HIV-1 亞型，分別為 CRF07_BC、subtype B 及 CRF01_AE，以 CRF07_BC 占大多數(68.8%)。HIV-1 基因序列演化分析方面主要是以 CRF07_BC env 序列做分析。根據在不同的 substitution model 與 coalescent model 下推估後得知，中國 CRF07_BC 出現的年代約在 1995.5~1996.1 年間，台灣南部的 CRF07_BC 約為 2001.1~2001.9 年，台灣中部的 CRF07_BC 約為 2003.4~2003.7 年，台灣北部的 CRF07_BC 約為 2003.5~2003.7 年。而 HIV-1 亞型與其相關危險因子的分析中，subtype B 感染者多為同性戀者，CRF01_AE 感染者大多為異性戀者，CRF07_BC 感染者大多為異性戀且有注射毒品相關的危險行為。(2)HIV-1 危險因子監測：男性注射藥癮者感染 HIV-1 的風險預測模式中的顯著危險因子共有 4 個(「教育程度」、「常得到性病的人比較容易得到愛滋病 (知識題)」、「共用針頭」、「共用毒品稀釋之溶液」)。進一步使用 ROC curve 挑選總危險對比值(Odds ratio，OR)為 7.435 做為最適當的風險閾值(敏感度為 95.6%，特異度為 52.2%)。驗證此預測模式結果發現，其敏感度為 72.2%，特異度為 60.5%。關鍵字：HIV-1、分子流行病學、注射藥癮者、風險預測模式. iii.

(5) Abstract Objectived：The main purposes of this study were to surveillance the HIV transmission and try to prevent it in Taiwan. (1) For the subtype surveillance purpose, this study was try to investigate the distribution of HIV-1 subtypes among different high-risk groups、spread pathways and evolution time period in Taiwan. (2)For the prevention purpose, this study wish to develop the HIV-1 infection risk prediction model for IDUs by using the questionnaire of risk factor investigation. This risk prediction model would aim to be a tool for predict their probable risk of HIV infection and increase their self-awareness HIV-1 infection. Methods：The study population came from a Taiwan HIV-1 surveillance network which builded from 2004. This network established a database which included HIV-1 infection risk factor questionnaire collection and HIV-1 seropositive blood samples from IDUs of jails and HIV/AIDS Outpatient department of China medical university hospital in Taiwan annually. (1) About HIV-1subtype surveillance, we collected 2007-2009 HIV-1 seropositive blood samples from HIV-1 surveillance network. Their subtypes were examined by using DNA sequencing and phylogenetic analysis, and applyed coalescent theory, molecular clock analysis to estimated evolution rate and time of the most recent common ancestors (TMRCA). And, the risk factor characteristics of different subtypes were calculated by the biostatistic method. (2) Using 2004 to 2005 risk factor questionnaire database in HIV-1 surveillance network for building up HIV-1 infection risk prediction model for IDUs, we investigated risk factors of HIV-1 infection by case-control study. The risk prediction model was established by logistic regression, and odds ratios (ORs) for each risk factor were summed. Then, we used ROC curve (Receiver operating characteristic curve) to know HIV-1 risk threshold of IDUs. Next, we collected 2007 -2008 data of risk factor iv.

(6) questionnaire database to validate the accuracy of this risk prediction model. Result：(1) HIV-1 subtype surveillance : HIV-1 subtype determined by phylogenetic analysis and nested multiplex PCR. After subtyping, we found three HIV-1 subtypes in our cases, including CRF07_BC, subtype B and CRF01_AE, most of these is CRF07_BC. CRF07_BC originated in 1993.6-1997.3 in China. TMRCA of CRF07_BC from southern, middle and northern were dated to 1998.3-2003.3, 2003.4-2004.4 and 2002.7-2004.3. In HIV-1 subtype and related HIV-1risk factor analysis showed, demographic and risk behavior factos among HIV-1subtype were differenct. (2) For risk factor prevention purpose: In the risk prediction model of IDUs, the significant variables among men were education, syringe sharing, heroin diluention sharing, and knowledge of AIDS- persons often had the venereal diseases, they easier had AIDS, and among women was syringe sharing. The risk threshold value of ORs in men is 7.435 (sensitivity: 0.96; specificity: 0.52). Because only one significant variable among women, the risk threshold value of ORs was not calculated. Finally, we compared with the sum of total ORs for each risk factor and the risk threshold of ORs, then, we could identify the risk of HIV infection. Furthermore, we collected questionnaire in 2007 ~ 2008, and tested this prediction model. The test result is : sensitivity – 72.2% ; specificity – 60.5%. Keywords：HIV-1、Molecular epidemiology、Injecting drug users (IDUs)、Risk prediction model. v.

(7) 目錄致謝....................................................................................................................... i 摘要...................................................................................................................... ii Abstract ............................................................................................................... iv 目錄..................................................................................................................... vi 表目錄................................................................................................................. ix 圖目錄.................................................................................................................. x 第一章、緒論...................................................................................................... 1 第一節研究背景及動機 ............................................................................. 1 第二節研究的重要性 ................................................................................. 4 第三節研究目的 ......................................................................................... 5 第四節名詞界定 ......................................................................................... 6 第二章、文獻探討.............................................................................................. 7 第一節 HIV/AIDS 全球流行情形.............................................................. 7 第二節 HIV/AIDS 台灣流行情形.............................................................. 9 第三節 HIV-1 分子流行病學 .................................................................... 13 第四節注射藥癮者感染 HIV-1 的情形 .................................................... 17 第五節疾病風險預測模式 ....................................................................... 19 第六節研究架構與研究流程 ................................................................... 21 第一項研究架構 ................................................................................ 21 第二項研究流程 ................................................................................ 23 第三章、HIV-1 亞型監測 ................................................................................. 25 第一節材料與方法 ................................................................................... 25 vi.

(8) 第一項研究流程 ................................................................................ 25 第二項研究對象與資料來源 ............................................................ 28 第三項血液及問卷資料收集 ............................................................ 30 第四項血液及問卷資料分析 ............................................................ 33 第二節研究結果 ....................................................................................... 52 第一項研究對象資料描述 ................................................................ 52 第二項 HIV-1 亞型分析 ..................................................................... 53 第三項 HIV-1 亞型演化分析 ............................................................. 55 第四項 HIV-1 亞型與其相關危險因子.............................................. 57 第五項 HIV-1 亞型監測研究小結 ..................................................... 61 第三節討論 ............................................................................................... 62 第四章、HIV-1 危險因子監測 ........................................................................ 66 第一節材料與方法 ................................................................................... 66 第一項研究流程 ................................................................................ 66 第二項研究對象與資料來源 ............................................................ 69 第三項問卷資料收集 ........................................................................ 71 第四項問卷資料分析 ........................................................................ 73 第二節研究結果 ....................................................................................... 76 第一項建立注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式......................... 76 第二項驗證注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式......................... 78 第三項注射藥癮者自覺危險性......................................................... 80 第四項注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式小結......................... 81 第三節討論 ............................................................................................... 82 第五章、結論與建議........................................................................................ 84 vii.

(9) 第一節結論 ............................................................................................... 84 第二節研究限制 ....................................................................................... 86 第三節應用與建議 ................................................................................... 87 參考文獻............................................................................................................ 89 附錄：問卷...................................................................................................... 126. viii.

(10) 表目錄表 1. HIV-1 亞型監測研究中研究對象基本資料. ......................................... 100 表 2. 使用不同的聚合酶連鎖反應方法分析研究對象血液樣本................. 101 表 3. HIV-1 亞型於不同資料來源之分布情形. ............................................. 102 表 4. 演化分析所使用的 CRF07_BC 基因序列資料 (env gene). ................ 103 表 5. CRF07_BC 演化分析結果(HKY model – strict clock).......................... 104 表 6. 比較感染不同 HIV-1 亞型之人口學資料. ........................................... 105 表 7. 比較感染不同 HIV-1 亞型之相關危險行為. ....................................... 106 表 8. 使用 2004~2005 年問卷資料建立的男性注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式(邏輯斯回歸模式). .................................................................... 108 表 9. 男性注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式計分方法........................ 109 表 10. 使用 2007~2008 年男性注射藥癮者問卷資料驗證男性注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式. ..................................................................... 110 表 11. 2004~2005 年與 2007~2008 年男性注射藥癮者其自覺感染 HIV-1 的警覺性比例.................................................................................................111. ix.

(11) 圖目錄圖 1. HIV-1 env gene 系統演化樹 (Neighbor-joining tree). ........................... 112 圖 2. HIV-1 env gene 系統演化樹(Parsimony tree). ....................................... 113 圖 3. 不同 HIV-1 亞型其陽性年代分布. ....................................................... 114 圖 4. CRF07_BC 亞型 Maximum-likelihood 系統演化樹 (HKY model – constant size)........................................................................................ 115 圖 5. CRF07_BC 亞型 Maximum-likelihood 系統演化樹 (HKY model – exponential growth). ............................................................................ 116 圖 6. CRF07_BC 亞型 Maximum-likelihood 系統演化樹 (HKY model – Bayesian skyline). ................................................................................ 117 圖 7. 估計不同地區 CRF07_BC TMRCA 時間 (HKY model – constant size). ............................................................................................................... 118 圖 8. 估計不同地區 CRF07_BC TMRCA 時間 (HKY model – exponential growth)................................................................................................. 119 圖 9. 估計不同地區 CRF07_BC TMRCA 時間 (HKY model – Bayesian skyine).................................................................................................. 120 圖 10. CRF07_BC 於不同地區的 Posterior probability density (HKY model – constant size)........................................................................................ 121 圖 11. CRF07_BC 於不同地區的 Posterior probability density (HKY model – exponential growth). ............................................................................ 122 圖 12. CRF07_BC 於不同地區的 Posterior probability density (HKY model – Bayesian skyine). ................................................................................. 123 圖 13. CRF07_BC 亞型之 Bayesian skyline plot (HKY model). ................... 124. x.

(12) 圖 14. 利用 ROC curve 分析男性注射藥癮者感染 HIV-1 風險預測模式之風險閾值(AUC=81%). ................................................................................ 125. xi.

(13) 第一章、緒論第一節研究背景及動機 1981 年 UCLA 的 Gottlieb 醫師在美國聯邦政府美國疾病控制及預防中心 (The Centers for Disease Control and Prevention，CDC)的疾病與死亡週報 (Morbidity and Mortality Weekly Report，MMWR)中發表了一份報告，報告內容指出有 5 位男同性戀者罹患罕見的肺囊蟲肺炎，並且也出現其他免疫失調的症狀(1, 2)，此報告被視為第一個有關 AIDS 的醫學文獻(3)；很快地，美國各州及歐洲國家也紛紛出現類似症狀的病患(4, 5)。1982 年，美國疾病控制及預防中心將因免疫系統遭受破壞而引起各種症狀的疾病稱為後天免疫缺乏症候群 (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)，俗稱為愛滋病 (6) 。1983 年 Barre-Sinoussi 等人在法國巴黎從罹患 AIDS 的男同性戀病患的血液及淋巴結檢體中分離出一種攻擊 T4 細胞的新反轉錄病毒(Retrovirus)，此為首次論證這種新病毒與 AIDS 的病源關係(7)。而此病毒在 1986 年的國際病毒命名會議上將他命名為人類免疫不全病毒(Human Immunodeficiency Viruses，HIV)(6)。HIV 在短短幾年內便經由各種途徑(性行為傳染、血液傳染、母子垂直傳染)迅速的蔓延至全世界各地。 HIV 主要可分為 HIV-1 及 HIV-2 兩型，兩種病毒的致病力並不相同。其中 HIV-1 依其蛋白質外套膜(env)與核心蛋白(gag)的基因序列經系統發生學分析(Phylogenetic analysis)後區分為三大群(Major group、Outlier group、New group)，Major group 又可再分類為 9 種亞型(subtype)，而造成全球流行的主要以 HIV-1 中的 Major group 為主，其在感染後超過 90%的病患會在 10~12 年內發病成為 AIDS；而 HIV-2 主要分布於非洲西部，感染後往往沒有相關病症(8, 9). 。二十多年以來，HIV-1 經由各種不同途徑在全球散播，到目前為止還未有 1.

(14) 完全治癒的方法(10)。截至 2007 年底為止，HIV-1 已經在全世界造成約有二千五百萬人死亡(11)。根據台灣行政院衛生署疾病管制局 HIV/AIDS 統計資料顯示，自 1984 年出現第一位 HIV-1 感染病例後，每年 HIV-1 感染及死亡人數皆不斷上升。累計至 2009 年 5 月底為止，HIV-1 感染人數為 17421 人(本國籍)，AIDS 死亡人數為 2320 人(本國籍)(12)。在 2003 年以前，感染 HIV-1 的危險族群(risk group) 以同性戀者(Homosexual)和異性戀者(Heterosexual)為主要族群，且 HIV-1 亞型大多數為 subtype B 和 CRF01_AE(13-15)，但在 2003 至 2004 年間，注射藥癮者 (Injecting Drug Users，IDUs)間爆發 HIV-1 流行，導致本國籍 HIV-1 感染人數由 862 人增加至 1520 人，在 2004 至 2005 年間本國籍 HIV-1 感染人數更上升至 3399 人(12)，由此可見危險族群已明顯轉變為以注射藥癮者為主要的危險族群；此外，HIV-1 流行的亞型也轉以 CRF07_BC 為主(16-20)。一般而言，在感染 HIV-1 後，平均約 10-12 年會發展為 AIDS(21, 22)，但現在在 HAART (Highly Active Anti-retroviral Therapy)，即俗稱的雞尾酒療法的治療下，不但能有效降低病人體內 HIV-1 病毒的數量，也可提高免疫淋巴球 CD4 的數目，讓病人延長生命，並有效的降低 HIV-1 感染個案的死亡率(23-25)。但相對來說，隨著我國每年 HIV-1 感染個案的增加，相關醫療費用也呈現逐年增加的趨勢。自 2005 年 2 月「後天免疫缺乏症候群防治條例」修正通過後，感染 HIV-1 的病患其治療與檢驗費用不再算是全民健康保險重大傷病範圍，而改由疾病管制局編列公務預算支付，換言之，HIV-1 感染者其治療與檢驗費用全部是由政府所支付。依據中央健保局統計顯示，2000 年感染 HIV-1 的病患其花費的醫療費用約為四億五千多萬元，平均每位感染者一年需花費三十五萬元醫療費(一般人每年為三千五百元醫療費)，為一般民眾醫療花費的 100 倍(26, 27)；而 2006 年增加為十一億八千萬，2007 年上半年即耗用了六億五千六 2.

(15) 百萬元(28)(參考資料圖 1)。由此可知，面對每年感染 HIV-1 的人數不斷增加，這些感染者的篩檢及治療的費用對於政府來說，將會造成難以負荷的經濟壓力。因此，如何有效減緩及預防 HIV-1 在高危險族群間傳播開來，以及長期監控 HIV-1 以充分了解的 HIV-1 的傳染情形，對我國在防治 HIV/AIDS 的疫情是很重要的。. 參考資料圖 1. 比較台灣 HIV/AIDS 相關醫療費用與每年 HIV-1 累計感染人數, 2004 ~ 2007/6 (12, 26-28).. 3.

(16) 第二節研究的重要性本研究分別會監測 HIV-1 亞型以及高危險族群 – 注射藥癮者感染 HIV-1 的危險因子。在監控 HIV-1 亞型的流行情形方面不僅可瞭解目前 HIV-1 亞型分布狀況，也可利用 HIV-1 亞型的基因序列以得知病毒株在台灣演化情形，並進一步推估 HIV-1 於台灣開始出現的年代。此外，藉由 HIV-1 感染者所填寫的問卷來得知不同的 HIV-1 亞型在相關危險因子(人口學變項和危險行為)方面是否有不同的特性。另外在監測高危險族群 – 注射藥癮者感染 HIV-1 的危險因子部分，本研究藉由調查注射藥癮者其感染 HIV-1 之危險因子來建立感染 HIV-1 風險預測模式，其可有效降低 HIV-1 篩檢成本及時間，並同時可提升高危險族群的危機意識，進而改變其自身的行為；再者，此風險預測模式的建立方法可應用於其他國家或疾病中，以利判斷民眾在疾病的罹病風險，並可提供給政府相關機關發展 HIV/AIDS 的防治策略，並針對高危險族群進行衛教宣導。. 4.

(17) 第三節研究目的到目前為止，每年感染 HIV-1 的人數不斷攀升，其中又以注射藥癮者為主要的危險族群。為了長期監控 HIV-1 傳播情形，並希望有效的減緩 HIV-1 感染人數，以及降低政府在 HIV/AIDS 的相關醫療經費，本研究利用分子流行病學的方法分別針對 HIV-1 亞型與危險因子兩個部分進行研究。故本研究的研究目的有二：目的一，長期監控 HIV-1 等同於監控 HIV-1 亞型的流行情形以及傳播路徑，所以研究中將收取台灣各地監所內 HIV-1 陽性受刑人和中國醫藥大學附設醫院中 HIV-1 陽性病患的血液樣本和問卷資料進行調查，以得知： (1) HIV-1 亞型分布情形； (2) HIV-1 亞型起始年代和傳播路徑； (3) HIV-1 亞型與相關危險因子探討。目的二，研究中藉由收集台灣各地區監所內注射藥癮者的問卷資料，來進行病例對照研究(case-control study)，以探討此高危險族群的危險因子，並進一步建立感染 HIV-1 的風險預測模式，以判斷此人有無感染 HIV-1 的風險。此風險預測模式可做為自我風險評估量表以增加高危險族群的自我警覺性 (self-awareness) ，期望可以減緩 HIV-1 感染人數並降低 HIV-1 篩檢成本以及時間。. 5.

(18) 第四節名詞界定一、AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome；後天免疫缺乏症候群；愛滋病)：這個名稱來自 1981 年在美國發現一群原先身體健壯的年輕、男同性戀者感染了肺囊蟲肺炎、口腔念珠菌和患有卡波西氏肉瘤等。這些疾病在過去多見於免疫缺乏的患者，例如：腫瘤病患接受化學治療或接受免疫抑制劑治療的病患。而為了和先天免疫缺乏區分，故稱為後天免疫缺乏症候群。AIDS 是由於感染人類免疫缺乏病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV，俗稱愛滋病毒) 的末期病程表現，其診斷標準為 HIV 的檢驗（抗體、抗原或病毒培養等）呈陽性反應加上(1) CD4 淋巴球數少於 200 個/mm3；(2)出現某些特定的伺機性感染、神經系統病症或腫瘤(21, 29, 30)。二、HIV(Human Immunodeficiency Viruses；人類免疫不全病毒；愛滋病毒)：是一種攻擊 T4 細胞的新反轉錄病毒 (Retrovirus) ，於 1983 年由 Barre-Sinoussi 等人在法國巴黎從罹患 AIDS 的男同性戀病患的血液及淋巴結檢體中分離出來(7)。HIV 主要可分為 HIV-1 及 HIV-2 兩型，兩種病毒的致病力並不相同，根據文獻指出，HIV-1 的起源可能是來自非洲的猿猴。HIV-1 的起源可能是來自非洲猩猩(African ape，chimpanzee)；而 HIV-2 和非洲猿猴免疫缺乏病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)相似，因此它的起源可能也是來自非洲的猴子(African monkey，mangabey)(9, 31-33)。三、注射藥癮者(Injecting drug users，IDUs)：將毒品稀釋於溶液中，並裝入針筒內，將毒品稀釋溶液直接注射至靜脈當中。. 6.

(19) 第二章、文獻探討第一節 HIV/AIDS 全球流行情形全世界每天有超過六千八百人感染 HIV-1，並且超過五千七百人死於 AIDS，最主要的原因是無法有效預防及治療 HIV-1。由於不當的性行為、毒癮者共用針頭等，再加上 HIV-1 病毒突變率極高，導致在預防及研究上出現很大的難題，因此無法完全控制住感染 HIV-1 的人數，所以 HIV-1 的流行在公共衛生來說仍然是非常嚴重的議題。根據聯合國 HIV/AIDS 聯合規劃署(The Joint United Nations Programme on HIV/AIDS，UNAIDS) 2008 年統計顯示，全球截至 2007 年 12 月底止，在成人感染 HIV-1 的盛行率約為 0.8%，估計感染 HIV-1 存活人數約有三千三百萬人，相較於 2006 年的三千九百五十萬人減少了約 16%。累計至 2007 年感染 HIV-1 的存活人數中，成人約有三千零八萬人，女性感染者約為一千五百五十萬人，小於 15 歲之孩童約有二百萬人。而在 2007 年當年感染 HIV-1 的人數約有二百七十萬人，其中，成人約有二百三十萬人，小於 15 歲之孩童約有三十七萬人。此外，於 2007 年當年死於 AIDS 的人數約有二百萬人，其中成人約為一百八十萬人，小於 15 歲之孩童約有二十七萬人(11)。若將全世界分為十個地理區域(Geographic Affinity Areas，GAAs)來觀察感染趨勢(11)(參考資料圖 2)，Sub-Saharan Africa 地區為全球 HIV-1 感染最嚴重的地區，並且 AIDS 為當地主要死亡原因。至 2007 年 12 月止，此地區 HIV-1 感染人數約有二千二百萬人，約佔全世界總感染人數的 67%。2007 年死於 AIDS 的人數中，約 75% 位於此地區中，約有一百五十萬人。此外，成人感染 HIV-1 的盛行率高達 6%，其主要傳染途徑為異性間性行為(11)。亞洲地區包括 South and South-East Asia 及 East Asia，截至 2007 年 12 月底 7.

(20) 為止，HIV-1 感染人數約五百萬人，其中三十八萬人為 2007 年新感染者，有近三十八萬人死於 AIDS，HIV-1 盛行率約為 0.1%~0.3%，由 2006 年的資料顯示出，Combodia、Myannmar 和 Thailand HIV-1 的盛行率有逐漸下降的趨勢，但在 Indonesia、Pakistan 及 Viet Nam 卻急速上升當中。在亞洲地區 HIV-1 主要傳染途徑以性行為(性工作者較多)、注射藥品或兩者混合為主。感染人數最多的國家為 India，約有二百四十萬人感染 HIV-1，整體來說，其主要的傳播途徑為性行為(性工作者較多)為主。在中國地區，HIV-1 感染人數集中於海南、廣東、新疆及雲南省較多，傳染途徑主要為注射藥品以及性行為為主。依據中國衛生部統計顯示，2006 年在中國地區新感染 HIV-1 的人中，有一半皆為注射藥癮者，但近年來在男同性戀間也出現 HIV-1 的流行。此外，在某些地區的女性注射藥癮者也同時是性工作者，而且大多都沒有使用保險套的習慣，故可能將會產生另一波的流行。因此世界衛生組織(World Health Organization，WHO)預估亞洲將是下一個 HIV-1 感染最嚴重的地區(11)。. 參考資料圖 2. 估計 2007 年底為止，全球成人及孩童累計感染 HIV 的人數, 2007(11).. 8.

(21) 第二節 HIV/AIDS 台灣流行情形根據台灣行政院衛生署疾病管制局 HIV/AIDS 統計資料顯示，自 1984 年出現第一例 HIV-1 感染個案後，每年新感染 HIV-1 的人數由 1984 年的 9 人(本國籍)逐漸增加至 2007 年的 1938 人(本國籍)。尤其在 2003 至 2004 年間，本國籍感染 HIV-1 的人數由 862 人暴增至 1520 人，而 2004 至 2005 年間本國籍感染人數更增加到 3399 人，可想見近幾年台灣 HIV-1 爆發的嚴重程度。截至 2009 年 5 月底為止，感染 HIV-1 的累計人數為 18118 人，其中本國籍有 17421 人 (96.15%) ，而死於 AIDS 的累計人數有 2320 人(本國籍) (12)。自 1984 年至 2009 年 5 月底為止本國籍感染 HIV-1 的累計人數中，年齡分佈方面以 20~29 歲為主要感染族群(36.97%)，其次為 30~39 歲年齡層 (35.89%)，再者是 40~49 歲年齡層(16.28%)。由此可見，HIV-1 感染的年齡分部主要以青壯年為主(12)。若依職業別區分，累計至 2009 年 5 月底為止本國籍感染 HIV-1 的人，以無業族群佔最多數(33.79%)，其次是以服務業為次要族群(18.92%)，再者為工業(13.72%)(12)。再來，若以居住地區別區分，累計至 2009 年 5 月底為止本國籍感染 HIV-1 人以台北縣為最多(21.29%)，其次為台北市(16.12%)，再者為桃園縣(9.05%)(12)。在危險因子方面，累計至 2009 年 5 月底為止本國籍感染 HIV-1 人中，以注射藥癮者的感染人數佔的比例最多(35.29%)，其次是同性戀者(32.08%)，再來就是異性戀者(23.49%) ，而其他危險因子包括雙性戀者 (7.43%) 、不詳 (1.14%)、血友病患(0.3%)、母子垂直感染(0.16%)及接受輸血者(0.11%)。而若以每年新感染 HIV-1 者來看，近幾年來在危險因子方面有很大的轉變。在 2003 年之前，主要的危險因子是以性接觸為主( 同性戀者(43.8%) 、異性戀者. 9.

(22) (31.2%))，而注射藥癮者只佔了 8.6%，但在 2004 年卻轉變為以注射藥癮者為主(35.8%)，而同性戀者及異性戀者分別為 26.4%、19.4%，2005 年注射藥癮者佔 71.0%，同性戀者為 17.1%，異性戀者為 11.6%，直到 2007 年，還是以注射藥癮者佔大多數(36.8%)，由此可見，台灣地區的危險因子已經由早期的性接觸轉變為以注射藥癮者為主(12)(參考資料圖 3 ~參考資料圖 4) ，故若加強高危險族群在 HIV/AIDS 的防治，將可大幅減低 HIV-1 的傳播。. 10.

(23) 參考資料圖 3. 台灣不同危險族群於 1984~2008 年每年新感染 HIV-1 的人數曲線圖(12).. 11.

(24) 參考資料圖 4. 台灣不同危險族群自 1984~2008 年累計感染 HIV-1 的人數曲線圖(12).. 12.

(25) 第三節 HIV-1 分子流行病學 HIV為反轉錄病毒(Retrovirus)的其中一種，其病毒顆粒為球狀，直徑約為 100nm，病毒顆粒外被雙層脂質構成的外套膜(envelope)所包附。具感染力的 HIV-1 病毒顆粒包含兩條約 9.7 Kb 的單股 RNA genome ， HIV-1 病毒藉由 envelope的醣蛋白gp120與人體內表面含有CD4受體的細胞結合(34)，之後在病毒envelope上的醣蛋白gp41協助之下，病毒與細胞開始進行融合，使病毒核心蛋白及兩條RNA genome進入細胞內 (35) ，再反轉錄為原病毒DNA(proviral DNA)(36)。由於HIV為Retrovirus，所以在病毒複製時，反轉錄酵素錯誤率較高，加上病毒須躲過宿主體內之免疫系統才可感染細胞，故HIV病毒基因的點突變 (point mutation)率很高，尤其是在envelope基因序列變異最大(37, 38)，其變異造就了HIV有許多不同的亞型出現(32, 33, 39)，每種亞型間約有15~30%的變異(40)。 HIV主要可分為HIV-1及HIV-2 兩型，HIV-1源自非洲東部地區與非洲西部地區(41)，造成全球大流行的主要以HIV-1為主。HIV-1依其蛋白質外套膜(env) 與核心蛋白(gag)的基因序列經系統發生學分析後可區分為三大群，分別為主要群(Major group，M群)、局外群(Outlier group，O群)及新群(New group，N 群)，而在全球有超過95%的人是感染主要群中的病毒(36, 42)。根據Los Alomos HIV Database顯示，主要群中包括A(A1、A2)、B、C、D、F(F1、F2)、G、H、 J 、K等11種subtype、34種以上的circulating recombinant forms(CRFs)和超過30 種的Unique recombinant forms(URFs)(9, 43)。CRFs是指HIV-1病毒中有兩段基因片段分別為不同亞型而造成基因重組(recombination)，並且此重組病毒有造成流行；URFs為HIV-1病毒中有兩段基因片段分別為不同亞型造成基因重組，但此重組病毒並未造成流行稱之，參考資料圖 5 為HIV genotypes分類表(9)。. 13.

(26) 參考資料圖 5. HIV genotype 分類表. (9). .. 全世界HIV-1主要流行的亞型為subtype C(56%)、subtype A(23%)、subtype B(5%)和CRF01_AE(5%)。以地區別來看，美洲地區的北美洲及中美洲以 subtype B為多，南美洲以subtype B與CRF12_BF為主。非洲地區流行的subtype 種類最多且最為複雜，其主要的subtype為subtype A、subtype C、subtype D、 CRF02AG、subtype G、局外群等。歐洲和大洋洲皆以subtype B為主。亞洲方面，主要以CRF01_AE、subtype B、subtype C為多，其中subtype C流行於印度地區，CRF01_AE、subtype B流行於東南亞國家(如泰國)，而中國主要以subtype B、CRF07_BC、CRF08_BC為主(9) (參考資料圖 6)。. 14.

(27) 參考資料圖 6. 全球 HIV genotype 分布情形(9).. 而台灣出現過的 HIV-1 亞型包括 A、B、C、D、E、G、CRF01_AE、 CRF07_BC、CRF08_BC 等。在 2003 年之前，主要以 subtype B 及 CRF01_AE 為主，若以危險族群來看，異性戀者感染 subtype B 及 CRF01_AE 為多，同性戀者、雙性戀者和注射藥癮者以感染 subtype B 為主(13-15)。在 2003 年之後，主要以 CRF07_BC 為多，這是因為注射藥癮者間爆發 HIV-1 感染的亞型是以 CRF07_BC 為主。而異性戀者、同性戀者和雙性戀者大多感染 subtype B(16-19)。由此可見，不同的 HIV-1 亞型會經由不同傳染途徑感染，尤其是在高危險族群中傳播速度會更快(13,. 14, 44). ，這可能會加速 HIV-1 病毒發生重組或者產. 生抗藥性病毒株，也影響疫苗的研發及公共衛生在防治政策上的實行(23, 45, 46)。因此，藉由長期監測 HIV-1 亞型可幫助我們了解台灣目前的亞型分布以 15.

(28) 及知道不同危險族群內所流行的亞型為何，進而也得知亞型的傳播路徑以及亞型和危險因子之間的關係，這皆能充份了解 HIV-1 在台灣的流行情形，進而去研擬公共衛生政策來預防 HIV-1 的傳播。. 16.

(29) 第四節注射藥癮者感染 HIV-1 的情形在全球約有一千三百萬的注射藥癮者，其主要是因為使用受 HIV-1 汙染的注射器具(contaminated drug injecting equipment)，其中包括不潔的針具、稀釋液或稀釋器具，於注射藥品後而導致 HIV-1 的感染。在 1981 年首次在注射藥癮者的族群中發現 AIDS 的病患後(47)，在許多國家中，注射藥癮者族群成為感染 HIV-1 的主要高危險族群之一，其儼然已經成為公共衛生在防治 HIV/AIDS 時的一大挑戰(48)。每年在 HIV-1 新感染者中，約有 10 %為注射藥癮者(49,. 50). ，所以有許多國家為了減低注射藥癮者感染 HIV-1 而實行多項預防. 政策，例如減害計畫 (harm reduction program) 、針具交換計畫 (needle exchange)、美沙酮替代療法(Methadone treatment)等(49, 51-56)。根據 UNAIDS 2008 年所發表的統計結果顯示，東歐地區 (Eastern Europe)、中亞地區(Central Asia)、中東地區(Middle East)、北非地區(North Africa) 及亞洲地區(Asia)感染 HIV-1 的主要傳播途徑為注射藥品(11)。東歐地區及中亞地區於 2007 年為止，約有一百五十萬人為 HIV-1 感染者，其中大多集中於 Russian Federation(69%)和 Ukraine(29%)(11)。在 2006 年新感染 HIV-1 的人中，約有 62%為注射藥癮者。其中，在 Russian Federation 內的注射藥癮者感染 HIV-1 的盛行率約為 3%(Volgograd)~70% (Biysk)(57) ； Ukraine 中的注射藥癮者感染 HIV-1 的盛行率約為 17%(11)。中東地區和北非地區於 2007 年為止約有三十八萬人感染 HIV-1(11) 。 Zamani 等人(58, 59)於 Iran 的首都 Tehran 研究發現在接受藥物治療的注射藥癮者中，其感染 HIV-1 的盛行率為 15%~23%。在 Libyan 和 Tunisia 的注射藥癮者，其感染 HIV-1 的主要原因是使用受汙染的注射器具，這也是造成 Algera、 Morocco 和 Syrian 地區爆發 HIV-1 流行的原因(11, 60)。. 17.

(30) 亞洲地區截至 2007 年底為止共有五百萬人感染 HIV-1，其中東南亞地區是 HIV-1 盛行率最高的地區(11)。在亞洲地區中，HIV-1 的傳染途徑非常多樣化，主要以注射藥癮者為主，其中男性的注射藥癮者通常會由於買春(buy sex) 時未戴保險套或是性工作者(sex worker)同時也是注射藥癮者，而使得 HIV-1 感染情形更加複雜且會加速傳播速度(11)。在中國，有一半以上的 HIV-1 感染者是由於使用受汙染的注射器具，而在 Viet Nam、India 也由於使用受汙染的注射器具而導致 HIV-1 的流行。此外，Malaysia 內 HIV-1 感染者中，有三分之二以上皆為注射藥癮者(61)；Thailand 與 Myanmar 中的注射藥癮者其感染 HIV-1 的盛行率約為 37% 和 43%(11)。根據 2009 年 4 月台灣法務部統計月報顯示，近年來因違反毒品危害防治條例中第一級毒品人數，由 2006 年至 2008 年人數依序為 8953 至 10267 人；因違反毒品危害防治條例中第二級毒品人數，由 2006 年至 2008 年人數依序為 3265 至 3841 人；由此數據可得知國內施打毒品人數有急遽增加的趨勢(62)。此外，由台灣疾病管制局中 HIV/AIDS 統計月報得知，注射藥癮者占 HIV-1 總感染人數百分比從 2004 年至 2009 年 5 月底止，由 8.92%攀升至 35.29%，並且自 2005 年後一直為感染 HIV-1 首要的危險族群(12)。另外，影響注射藥癮者感染 HIV-1 的危險因子研究中(16, 63)，發現注射藥癮者其為國小以下的學歷者相較於高中以上學歷者有 2.3 倍的危險會感染 HIV-1，有共用毒品稀釋溶液者有 17.2 倍的危險會感染 HIV-1，有共用針頭者有 34 倍的危險會感染 HIV-1，有共用針頭和稀釋溶液者有 46.7 倍的危險會感染 HIV-1。由上述文獻可得知，危險因子是可以影響注射藥癮者是否會感染 HIV-1。故需深入探討與注射藥癮者相關的重要危險因子，並對於這些危險因子提出有效的因應對策及防治策略以減緩 HIV/AIDS 的疫情。. 18.

(31) 第五節疾病風險預測模式疾病的風險預測模式(risk prediction model)主要目的是用來教育或改變大眾對此疾病的自我認知或者增加民眾對於此疾病的知識，進而改變其危險行為，並且藉由過去的研究可得知，危險因子是可以影響高危險族群是否會感染 HIV-1(57-60, 63-71)。故我們可著重於注射藥癮者族群其感染 HIV-1 的危險因子做相關性的探討，找出主要影響注射藥癮者感染 HIV-1 的危險因子為何，並進一步建立風險預測模式，來判斷此人是否有感染 HIV-1 的風險，以提早讓高危險族群警覺自我是有感染 HIV-1 的風險，進而改變自身的知識、態度和行為，以達到減緩 HIV-1 感染的情形。在國外的研究中，已有許多研究者以一些慢性疾病或癌症建立一個疾病的風險預測模式，以得知其研究對象是否有罹病的風險。其中有些是經由統計機率的概念去建立疾病的風險預測模式，例如：1989 年，Gail 等人在乳癌相關危險因子建構一套機率統計的方法，進而計算出 5 年內得乳癌的機率(72, 73). ；而 Framingham 心臟研究是利用世代研究(cohort study)來建立一個預防中. 風和冠狀動脈心臟病的健康預測模式(74,. 75). ；另外，在哈佛的癌症研究中，也. 是以世代研究的方法於各種癌症建構預測模式，像是大腸直腸癌、肺癌等等，並將此疾病預測模式應用於網路問卷上，提供大眾多達 12 種癌症的自我檢測，此外還介紹各個癌症的相關知識和危險因子(76,. 77). 。在國內的研究中對於. 此類的風險預測模式的建立研究則是較少的，目前只有葉志清等人針對大腸直腸癌建立風險預測模式及風險指標(78)。以上的這些疾病的風險預測模式大都是為了慢性疾病所建構的，但是像 HIV/AIDS 這類的傳染性疾病就缺乏類似的風險預測模式研究，大多的研究都只著重危險因子(risk factor)、知識(knowledge)、態度(attitude)、行為(practice)、. 19.

(32) 及使用邏輯斯回歸(logistic regression)分析影響感染 HIV-1 的危險因子(64, 67, 70, 71, 79-86). ，並沒有進一步的將其相關危險因子建構出一個疾病的風險預測模式。. 故在本研究中，希望藉由收取注射藥癮者的問卷資料，以病例對照研究的方法找出此高危險族群感染 HIV-1 的危險因子後，以邏輯斯回歸統計方法建立預測注射藥癮者感染 HIV-1 的模式，此模式即為感染 HIV-1 的風險預測模式，之後再將模式中的危險因子之危險對比值相加後，以 ROC curve 的方法挑選出適當的值(風險閾值)以幫助我們區分此研究對象有無感染 HIV-1 的風險，換言之，超過此風險閾值者可能有感染 HIV-1 的風險，而低於此風險閾值者則可能是沒有感染 HIV-1 的風險。. 20.

(33) 第六節研究架構與研究流程第一項研究架構經上述的文獻探討後，為有效減緩 HIV-1 感染人數、減少政府花費在 HIV/AIDS 龐大醫療經費，並掌握 HIV-1 亞型分布情形，本研究應用分子流行病學的方法，偵測 HIV-1 亞型的流行情形以及其傳播路徑，並且藉由探討高危險族群 –注射藥癮者的危險因子，建立一個風險預測模式。在 HIV-1 亞型監測方面，是利用 HIV-1 感染者其病毒株的基因序列亞型來得知其分布情形，以及 HIV-1 亞型在台灣起始年代和傳播路徑，並且瞭解 HIV-1 亞型演化情形。此外，利用 HIV-1 感染者所做的問卷，探討 HIV-1 感染者其病毒株的基因序列亞型與相關危險因子的相關性。而在危險因子調查方面，主要以感染 HIV-1 的高危險族群 –注射藥癮者其所做的問卷，調查影響注射藥癮者感染 HIV-1 的危險因子，包括人口學變項及相關危險行為因子，並進一步建立感染 HIV-1 的風險預測模式，用以判斷此群注射藥癮者其是否有感染 HIV-1 的風險，以提高其自我警覺性。. 21.

(34) 以下為本研究之研究架構圖：. 人口學變項及相關危險因子. HIV-1亞型分布情況. 人口學變項. 感染 HIV-1. HIV-1亞型起始年代及傳播路徑. 相關危險因子. HIV-1亞型演化分析. HIV-1 危險因子監測. HIV-1 亞型監測. 22.

(35) 第二項研究流程基於本研究的研究目的，自 2004 年起建立 HIV-1 監測網(surveillance)，這個監測網包括收集自台灣各地監所內注射藥癮者以及中國醫藥大學附設醫院高危險族群病患的危險因子調查問卷資料(包括感染 HIV-1 知識、態度和行為)，來建立一個危險因子資料庫，並抽取 HIV-1 陽性個案的血液樣本。研究中使用監測網內 2007~2009 年間對於感染 HIV-1 的研究對象病毒株之基因亞型和危險因子資料庫的問卷資料，以了解 HIV-1 流行情形及危險因子與 HIV-1 亞型的關係；另外使用 2004~2005 年間的危險因子資料庫建立注射藥癮者感染 HIV-1 的風險預測模式，並用 2007~2008 年間的危險因子資料庫作為驗證此風險預測模式之用。. 23.

(36) 以下為本研究之研究流程圖：. 24.

(37) 第三章、HIV-1 亞型監測第一節材料與方法第一項研究流程在 HIV-1 亞型監測方面，我們利用 HIV-1 感染者其病毒株的基因序列亞型來得知亞型分布情形、HIV-1 亞型在台灣起始年代和傳播路徑，並且瞭解 HIV-1 亞型演化情形。此外，利用危險因子資料庫中 HIV-1 感染者所做的問卷資料，探討 HIV-1 感染者其病毒株的基因序列亞型與危險因子的相關性。一、研究對象與資料來源此研究中的樣本來源為藍郁青助理教授執行行政院國家科學委員會 (NSC96-2314-B039-013-MY3 及 NSC96-2314-B039-003-MY2)計畫中所使用之問卷與血液樣本。研究對象是收取自 2007~2009 年台灣地區的監獄、看守所及戒治所中 HIV-1 陽性注射藥癮者受刑人、中國醫藥大學附設醫院檢驗科與感染科門診 HIV-1 陽性病患之血液樣本；此外，也收集研究對象的問卷資料，其中有收取問卷的研究對象包括監獄、看守所及戒治所受刑人和中國醫藥大學附設醫院感染科門診病患。二、血液樣本及問卷資料收集本研究經中國醫藥大學附設醫院人體試驗委員會審查後同意自檢驗科中收取 HIV-1 陽性病患之血液樣本；而監獄、看守所、戒治所及感染科方面，在抽取 HIV-1 陽性受刑人/病患血液樣本及做問卷調查前，需經研究對象簽署研究同意書後才進行問卷調查及採血工作。另外，此研究中需調查收案之研究對象的人口學基本變項(性別、年齡)及感染 HIV-1 的陽性時間，但由於檢驗科中的研究對象全部皆沒有做問卷調查，所以其相關資料會從醫院中的病歷 25.

(38) 資料查詢得知。三、血液樣本分析將收取到的血液進行 DNA 及 RNA 萃取後，再進行巢式聚合酶連鎖反應 (Nested polymerase chain reaction，Nested PCR)或巢式反轉錄聚合酶連鎖反應 (Nested reverse transcriptase polymerase chain reaction，Nested RT-PCR)及多重巢式聚合酶連鎖反應 (Nested multiplex polymerase chain reaction ， Nested multiplex PCR)，以複製特定的 HIV-1 基因片段。四、基因序列定序將 PCR 產物(product)送至陽明基因體中心進行基因定序(sequencing)。五、基因序列分析將定序好的基因序列進行系統發生學分析及演化分析 (Evolution analysis)。六、問卷資料分析問卷資料庫中的資料以 SPSS 13.0 或 SAS 9.1 套裝軟體做統計分析處理。統計分析方法包含描述性統計和分析性統計。研究中將 HIV-1 亞型和問卷資料中的各個變項做統計分析，以得知 HIV-1 亞型與危險因子間的相關性。. 26.

(39) 以下為 HIV-1 亞型監測的研究流程：. 27.

(40) 第二項研究對象與資料來源在 HIV-1 亞型監測研究中，研究對象來源共有三種，分別為台灣各地監所 HIV-1 陽性注射藥癮者受刑人(包括台中監獄、台中看守所、台中戒治所、花蓮監獄及桃園女子監獄)、中國醫藥大學附設醫院檢驗科及感染科門診 HIV-1 陽性病患，我們針對這些研究對象收取其血液樣本及問卷資料。此部分的樣本來源為藍郁青助理教授執行行政院國家科學委員會 (NSC96-2314-B039-013-MY3 及 NSC96-2314-B039-003-MY2)計畫中所使用之問卷與血液樣本。血液樣本方面，總計收取 464 位個案之血液樣本，其中包括中國醫藥大學附設醫院檢驗科 349 位、感染科門診 61 位、台中監獄 42 位、台中看守所 1 位、台中戒治所 4 位、花蓮監獄 3 位和桃園女子監獄 4 位。而在問卷資料方面，只有中國醫藥大學附設醫院感染科門診的病患及監獄、看守所及戒治所中的 HIV-1 陽性注射藥癮者受刑人有收取到問卷資料，其中包括感染科門診 61 份、台中監獄 41 份、台中看守所 1 份、台中戒治所 4 份、花蓮監獄 3 份和桃園女子監獄 4 份，總計共收取 114 份問卷。. 28.

(41) HIV-1 亞型監測研究中研究對象來源、血液樣本和問卷資料研究對象來源. 血液樣本(管). 問卷(份). 中國醫藥大學附設醫院檢驗科. 349. 0. 中國醫藥大學附設醫院感染科門診. 61. 61. 台中監獄. 42. 41. 台中看守所. 1. 1. 台中戒治所. 4. 4. 花蓮監獄. 3. 3. 桃園女子監獄. 4. 4. 464. 114. 總計. 29.

(42) 第三項血液及問卷資料收集一、中國醫藥大學附設醫院檢驗科本研究經中國醫藥大學附設醫院人體試驗委員會審查後同意，由檢驗科中 HIV-1 陽性病患血液樣本。另外，此研究中需調查收案之研究對象的人口學基本變項(性別、年齡)及感染 HIV-1 的陽性時間，但由於檢驗科中的研究對象全部皆沒有做問卷調查，所以其相關資料會從醫院中的病歷資料查詢得知。二、中國醫藥大學附設醫院感染科門診中國醫藥大學附設醫院感染科門診看病的 HIV-1 陽性病患，經由門診護士講解研究目的及研究對象的權利與義務後，給予病患簽署抽血及問卷同意書，經由病患同意後，予以抽血共 30 ml (生化管與 EDTA 管各一)並做問卷調查。若病患並無做問卷調查，進一步去查閱病歷資料以得其人口學基本變項(性別、年另)及感染 HIV-1 陽性時間以供研究分析。問卷內容在進行前已經過專家效度的審查，問卷內容包括： (一)基本人口學資料 – 收案日期、身分證字號、性別、籍貫、居住地、教育程度、婚姻狀態、職業等。 (二)HIV/AIDS 相關知識 – 包括傳染途徑(捐血、共用針頭、共用毒品稀釋液或容器、母子垂直感染、性行為、共用餐具等)、減害計畫內容 (針具交換及替代療法)、預防方法(使用保險套、避免性病感染)等。 (三)HIV/AIDS 相關態度 – 包括自覺罹病危險性、接受罹病的程度、預防愛滋病傳染行為的態度等。 (四)HIV/AIDS 相關危險行為 – 包括性取向、性行為對象、使用保險套情形、吸食及注射毒品情形與使用毒品種類、注射毒品時相關行為、輸血情形、罹患性病的病史、加入幫派情形等。. 30.

(43) (五)服用治療服用愛滋病藥物情形。三、台灣各地監所資料收集監所資料收集包括台中監獄、台中看守所、台中戒治所、花蓮監獄及桃園女子監獄內 HIV-1 陽性注射藥癮者受刑人收取問卷並抽血。經由研究人員講解研究目的及研究對象的權利與義務後，給予受刑人簽署抽血及問卷同意書，經由受刑人同意後，予以抽血 30 ml (生化管與 EDTA 管各一)及做問卷調查。問卷內容在進行前已經過專家效度的審查，問卷內容包括： (一)基本人口學資料 – 收案日期、身分證字號、性別、籍貫、居住地、教育程度、婚姻狀態、職業、入監次數、入監前花費的毒品錢、相關前科等。 (二)HIV/AIDS 相關危險行為 – 包括捐血情形、性取向、性行為對象、使用保險套情形、罹患性病的病史、安全性行為、性伴侶使用毒品情形、吸食及注射藥品情形、注射藥品時相關行為、戒毒經驗、加入幫派情形等。 (三)在監獄中及離開監獄後想得知的資訊(needle assessment) – 包括愛滋病(基本知識及感染方法)、安全性行為、藥物濫用資訊及治療、心理諮商方面、工作資訊等。 (四)吸食及注射毒品種類 – 包括海洛因、嗎啡、鴉片、古柯鹼、速賜康、安非他命等。 (五)HIV/AIDS 相關知識 – 包括傳染途徑、觸法行為、預防方法、藥物治療方面知識等。 (六)HIV/AIDS 相關態度 – 包括自覺罹病危險性、接受罹病的程度、預防愛滋病傳染行為的態度等。 (七)減害計畫相關問題 – 包括有沒有聽過美沙冬替代療法、參加替代療 31.

(44) 法的意願、取得新的針具管道、多久會去拿(或買)針具(筆)、共用針具的風險等。 (八)服用治療服用愛滋病藥物情形。. 32.

(45) 第四項血液及問卷資料分析一、血液樣本前處理研究對象簽屬同意書後，每位採全血 30 ml 之後分別裝至生化管與 EDTA 管中，並使用 QIAamp DNA Mini Kit 萃取 Lymphocyte DNA 以及使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 萃取 RNA。 (一)Lymphocyte DNA 萃取首先先將紅頭管以 3000 rpm 離心 5 分鐘。離心好後，將紅頭管上半部的上清液(為 serum)取出並加至 1.5 ml eppendorf 中，然後將裝有 serum 的 1.5ml eppendorf 放至-80℃冰箱保存。再來，將含有 EDTA 的紫頭管用 dropper 混合均勻。準備 1.5 ml eppendorf，依序加入 30 μl QIAGEN Protease、300 μl 紫頭管內的血液和 300 μl Buffer AL。加好後，拍打此 1.5 ml eppendorf 15 下並 vortex 15 秒後，放至 56℃的 heater 中 10 分鐘。加熱完後，將此 1.5ml eppendorf 快速離心，再加入 300 μl 100% Ethanol，加好後，拍打此 1.5 ml eppendorf 15 下、vortex 15 秒並快速離心。之後，將 1.5 ml eppendorf 內的混合液全部取至 QIAamp Spin Column(含 2ml collection tube)中，以 8000rpm 離心 1 分鐘。離心完後，將 QIAamp Spin Column 換至新的 2 ml collection tube 上，再加入 500 μl Buffer AW1 至 QIAamp Spin Column 中，以 8000 rpm 離心 1 分鐘。離心完後，將 QIAamp Spin Column 換至新的 2 ml collection tube 上，再加入 500 μl Buffer AW2 至 QIAamp Spin Column 中，以 14000 rpm 離心 3 分鐘。離心完後，將 QIAamp Spin Column 換至 1.5 ml eppendorf 上，再加入 50 μl ddH2O 至 QIAamp Spin Column 中，並在室溫下靜置 1 分鐘。之後以 8000 rpm 離心 1 分鐘。離心完後，將 QIAamp Spin Column 丟棄，. 33.

(46) 1.5 ml eppendorf 內的溶液即為 DNA。萃取好 DNA 後，以 Thermo Nano Drop Spectorphotometer ND-1000 測其濃度和 OD 值，測好後將含有 DNA 的 1.5 ml eppendorf 放至-80℃冰箱保存。最後，將紫頭管以 1500 rpm 離心 5 分鐘。離心完後，將紫頭管上半部的上清液(為 plasma)取出並加至 1.5 ml eppendorf 中，然後將裝有 plasma 的 1.5 ml eppendorf 放至-80℃冰箱保存。 (二)RNA 萃取取 560 μl Buffer AVL/Carrier RNA 加至 1.5 ml eppendorf 中，再加入 40 μl 血漿檢體後 vortex 15 秒。之後靜置於室溫下 10 分鐘。接著將此 1.5 ml eppendorf 稍微離心一下後加入 560 μl ETOH，並 vortex 15 秒以及稍微離心一下。再來，自此 1.5 ml eppendorf 中取 630 μl 到含有 QIAamp spin column 的 2 ml 收集管的中，並蓋上蓋子放入離心機中以 8000 rpm 離心 1 分鐘。之後將 QIAamp spin column 換至於乾淨的 2 ml 收集管，並丟棄原本含有濾液的收集管。接著再加入 500 μl 的 Buffer AW1 至 QIAamp spin column 後蓋上蓋子放入離心機中以 8000 rpm 離心 1 分鐘後將 QIAamp spin column 換至於乾淨的 2 ml 收集管，並丟棄原本含有濾液的收集管。之後再加入 500 μl 的 Buffer AW2 至 QIAamp spin column 後蓋上蓋子放入離心機中以 14000 rpm 離心 3 分鐘後將 QIAamp spin column 換至於乾淨的 2 ml 收集管並丟棄原本含有濾液的收集管，再以離心 14000 rpm 離心 2 分鐘。將 QIAamp spin column 換至乾淨的 1.5 ml eppendorf 中，丟棄原本含有濾液的收集管。接著加入 60 μl 的 Buffer AVE，蓋上蓋子，放在室溫下 5~30 分鐘後，放入離心機中以 8000 rpm 離心 2 分鐘，離心完成後將之保存於-20℃~-70℃冰箱中。. 34.

(47) 二、血液樣本分析 (一)巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR) 1.第一次聚合酶連鎖反應(First PCR) 利用萃取好的 DNA 作為模板(template)，並用 env gene 的引子 (primer)大量複製 env gene 的 DNA 片段。反應溶液 DNA 模板. 單管體積(μl). 最終反應濃度. 1. 0.2 μg/ul. 12.1. 滅菌過的二次水 Takara 10X EX TaqTM Buffer. 2. 1X. Takara dNTP Mixture. 1.6. 0.2 mM. ED5(F). 1.6. 0.4μM. ED12(R). 1.6. 0.4μM. Takara EX TaqTM. 0.1. 0.025 units/μl. 總體積 (μl). 20. z First PCR 所需引子 HXB2 position. 引子名稱 ED5. Forward. 6556-6581. 5’-ATGGGATCAAAGCCTAAAGCC ATGTG-3’. ED12. Reverse. 7822-7792. 5’-AGTGCTTCCTGCTGCTCCCAA CCCAAG-3’. z 反應溫度先 95℃ 5 分鐘；接著 94℃ 1 分鐘、58℃ 1 分鐘、72℃ 1 分鐘，各 1 個 cycle；再來 94℃ 15 秒、56℃ 45 秒、72℃ 1 分鐘，共 32 個 cycle；最後 72℃ 10 分鐘。當整個反應完成後將 PCR 產物維持. 35.

(48) 在 4℃。. 2.第二次聚合酶連鎖反應(Second PCR) 將 First PCR 的 PCR 產物作為模板，並用 env gene 的引子大量複製 env gene 的 DNA 片段。反應溶液. 單管體積(μl). First PCR products. 最終反應濃度. 1 12.1. 滅菌過的二次水 TM. 2. 1X. Takara dNTP Mixture. 1.6. 0.2 mM. ES7(F). 1.6. 0.4μM. ES8(R). 1.6. 0.4μM. Takara EX TaqTM. 0.1. 0.025 units/μl. 總體積 (μl). 20. Takara 10X EX Taq. Buffer. z Second PCR 所需引子 HXB2 position. 引子名稱 ES7. Forward. 7001-7020. 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCTG TTAAATGGCAGTCTA GC-3’. ES8. Reverse. 7667-7647. 5’-CAGGAAACAGCTATGACCCAC TTCTCCAATTGTCCCTCA-3’. z 反應溫度先 95℃ 5 分鐘；接著 94℃ 1 分鐘、55℃ 1 分鐘、72℃ 1 分鐘，各 1 個 cycle；再來 94℃ 15 秒、55℃ 45 秒、72℃ 1 分鐘，共 32 個 cycle；最後 72℃ 10 分鐘。當整個反應完成後將 PCR 產物維持在 4℃。 36.

(49) 3.洋菜膠電泳分析(Agarose gel electrophoresis) 最後取 5 μl second PCR 產物用 1%洋菜膠進行膠體電泳分析 (100V~150V，30~40 分鐘)。再將跑完的膠放入 EtBr (0.5 μg/ml)染色 15 分鐘後，再將之褪染 5~10 分鐘。之後放置於 UV 燈下並照相，以確認複製後的 PCR 產物大小是否符合所要的片段(env：646 bp)。. 37.

(50) (二)巢式反轉錄聚合酶連鎖反應(Nested RT-PCR) 1.第一次聚合酶連鎖反應(First PCR) 利用萃取好的 RNA 經由反轉錄酶反應(reverse transcriptase reaction)將 RNA 轉為 cDNA，並將此 cDNA 作為模板，使用引子大量複製 env gene 片段。反應溶液. 單管體積(μl). 最終反應濃度. RNA. 1. Promega AccessQuickTM Master Mix. 10. Promega Nuclease-Free H2O. 5.4. ED5(F). 1.6. 0.4μM. ED12(R). 1.6. 0.4μM. Promega AMV Reverse transcriptase. 0.4. 0.1 units/μl. 總體積 (μl). 20. 2X. z First PCR 所需引子 HXB2 position. 引子名稱 ED5. Forward. 6556-6581. 5’-ATGGGATCAAAGCCTAAAGCC ATGTG-3’. ED12. Reverse. 7822-7792. 5’-AGTGCTTCCTGCTGCTCCCAA CCCAAG-3’. z 反應溫度先 45℃ 45 分鐘各 1 個 cycle，95℃ 5 分鐘各 1 個 cycle；接著 94℃ 1 分鐘、58℃ 1 分鐘、72℃ 1 分鐘，各 1 個 cycle；再來 94℃ 15 秒、56℃ 45 秒、72℃ 1 分鐘，共 32 個 cycle；最後 72℃. 38.

(51) 10 分鐘。當整個反應完成後將 PCR 產物維持在 4℃。. 2.第二次聚合酶連鎖反應(Second PCR) 將 First PCR 的 PCR 產物作為模板，並用引子大量複製 env gene 的 DNA 片段。反應溶液. 單管體積(μl). First PCR products. 最終反應濃度. 1 12.1. 滅菌過二次水 Takara 10X EX TaqTM Buffer. 2. 1X. Takara dNTP Mixture. 1.6. 0.2 mM. ES7(F). 1.6. 0.4μM. ES8(R). 1.6. 0.4μM. Takara EX TaqTM. 0.1. 0.025 units/μl. 總體積 (μl). 20. z Second PCR 所需引子 HXB2 position. 引子名稱 ES7. Forward. 7001-7020. 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCTG TTAAATGGCAGTCTA GC-3’. ES8. Reverse. 7667-7647. 5’-CAGGAAACAGCTATGACCCAC TTCTCCAATTGTCCCTCA-3’. z 反應溫度 95℃ 2 分鐘；接著 94℃ 15 秒、63℃ 20 秒、72℃ 2 分鐘，各 30 個 cycle；最後 72℃ 10 分鐘，當整個反應完成後將 PCR 產物維持在 4℃。. 39.

(52) 3.洋菜膠電泳分析(Agarose gel electrophoresis) 最後取 5 μl second PCR 產物用 1%洋菜膠進行膠體電泳分析 (100V~150V，30~40 分鐘)。再將跑完的膠放入 EtBr (0.5 μg/ml)染色 15 分鐘後，再將之褪染 5~10 分鐘。之後放置於 UV 燈下並照相，以確認複製後的 PCR 產物大小是否符合所要的片段(env：646 bp)。. 40.

(53) 1236 bp ED5. ED12. (HXB2：6556 → 6581). (HXB2：7822 → 7792). 646 bp ES7 (HXB2：7001 → 7020). 巢式聚合酶連鎖反應/巢式反轉錄聚合酶連鎖反應 (env gene).. 41. ES8 (HXB2：7667 → 7647).

(54) (三)基因序列定序將 second PCR 產物送至陽明大學基因體中心進行基因序列分析，定序所需之引子如下： HXB2 position. 引子名稱 ES7. Forward. 7001-7020. 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCT GTTAAATGGCAGTCTA GC-3’. ES8. Reverse. 7667-7647. 5’-CAGGAAACAGCTATGACCCA CTTCTCCAATTGTCCCTCA-3’. 42.

(55) (四)基因序列分析 1.系統發生學分析及亞型分析 (1)基因序列排序(alignment) PCR 產物經定序後，將所得到的基因序列以多重排序 (multiple alignment)套裝軟體 BioEdit 7.0.8. (87, 88). 排序，並以人工. 手動調整。 (2)基因序列系統發生學分析利用 MEGA 4.0. (89, 90). 或 Phylip 3.68. (91, 92). 套裝軟體進行系統. 發生學分析，使用 Neighbor-joining (NJ) method 及 Fitch and Wagner parsimony (pars) method 並經過 1000 bootstrapping 的重覆取樣後建立 consensus 基因序列系統發生樹 (Phylogenetic tree)，以瞭解各 taxa 間的拓樸學(topology)，並區分出 HIV-1 亞型。Bootstrap 數值大於 75%代表演化支的存在是有統計顯著的。其中 Neighbor-joining (NJ) method 是以 Kimura two parameter model 計算距離(distance)建立系統演化樹。用來作為參考病毒株的亞型來互相比較之序列是取自於 Los Alamos HIV database(93)。 2. 貝氏馬可夫鏈蒙地卡羅演化分析 (Bayesian Markov Chains Monte Carlo evolutionary analyses) 在演化分析的部份，主要是以HIV-1亞型中CRF07_BC env gene 的部分進行基因序列的演化分析。為了得知CRF07_BC在台灣傳播的情形，所以自Los Alamos HIV database(93)中隨機選取中國和台灣(包括台灣北部、中部和南部) 有年代資料的CRF07_BC env gene 基因序列，再加上本研究中基因序列亞型分析後結果為CRF07_BC之序列，使用BEAST 1.4.8套裝 43.

(56) 軟體分析。此軟體是應用溯祖理論(coalescent theory)、貝氏機率分析(Bayesian analysis)及馬可夫鏈蒙地卡羅(Markov Chains Monte Carlo ， MCMC) 的原理推估 CRF07_BC 基因序列的演化速率 (Evolution rate)和病毒株最近的共同祖先時間(Time of the most recent common ancestors，TMRCA)。在此演化分析中，演化速率的估計是使用 Hasegawa-Kishstrict-Yano(HKY). substitution. model 搭配 strick. clock，並假設分布呈gamma 分布(Γ４)。另外，在每個substitution model下分別假設三種coalescent model：constant size、exponential growth及baysian skyline，並經過MCMC chain重覆30000000次後建構此病毒株族群數歷史(demographic history)中的病毒株最近的共同祖先時間點。. 44.

(57) (五)多重巢式聚合酶連鎖反應(Nested multuplex PCR)(94) 若於巢式聚合酶連鎖反應或巢式反轉錄聚合酶連鎖反應做不出來的DNA樣本，則使用多重巢式聚合酶連鎖反應(Nested multuplex PCR) 來確認HIV-1亞型。多重巢式聚合酶連鎖反應是利用由不同HIV-1亞型所設計的特異性引子於gag-pol region夾出不同大小的片段，用以判斷HIV-1 亞型，此種方法不需經由基因定序便可快速鑑定此檢體為subtype B、subtype C、 CRF01_AE、CRF07_BC或CRF08_BC。 1.第一次聚合酶連鎖反應(First PCR) 利用萃取好的 DNA 作為模板，並用引子大量複製 DNA 片段。反應溶液 DNA. 單管體積(μl). 最終反應濃度. 1. 0.2 μg/ul. 12.1. 滅菌過的二次水 Takara 10X EX TaqTM Buffer. 2. 1X. Takara dNTP Mixture. 1.6. 0.2 mM. Gag F2 (F). 1.6. 0.4μM. Gag E2 (R). 1.6. 0.4μM. Takara EX TaqTM. 0.1. 0.025 units/μl. 總體積 (μl). 20. z First PCR 所需引子 HXB2 position. 引子名稱 Gag F2. Forward. 791-814. 5’-ATGGGTGCGAGAGCGTCARTA TTAA-3’. Gag E2. Reverse. 2032-2011. 5’-TCCAACAGCCCTTTTTCCTAG G-3’. 45.

(58) z 反應溫度先 94℃ 5 分鐘、52℃ 1 分鐘、72℃ 2 分鐘，各 1 個 cycle；再來 94℃ 30 秒、52℃ 30 秒、72℃ 30 秒，共 35 個 cycle；最後 72℃ 10 分鐘。當整個反應完成後將 PCR 產物維持在 4℃。. 2.第二次聚合酶連鎖反應 – 1(Second PCR – 1) 將 First PCR 的 PCR 產物作為模板，並使用以 subtype B(cn-gag-B1/cn-gag-b2) 、 subtype. C(cn-gag-C1/. cn-gag-c3) 及. CRF01_AE(cn-gag-E2/cn-gag-e3)所設計出的引子大量複製所需之 DNA 片段。反應溶液. 單管體積(μl). First PCR products. 2 14.75. 滅菌過的二次水 Takara 10X EX Taq. 最終反應濃度. TM. Buffer. 5. 1X. Takara dNTP Mixture. 4. 0.2 mM. cn-gag-B1(F). 4. 0.4μM. cn-gag-b2(R). 4. 0.4μM. cn-gag-C1(F). 4. 0.4μM. cn-gag-c3(R). 4. 0.4μM. cn-gag-E2(F). 4. 0.4μM. cn-gag-e3(R). 4. 0.4μM. 0.25. 0.025 units/μl. Takara EX TaqTM 總體積 (μl). 50. 46.

(59) z Second PCR 所需引子 HXB2 position. 引子名稱. 5’-GGAGCTAGAACGATT CGCAG-3’. cn-gag-B1. Forward. 906-925. cn-gag-b2. Reverse. 1831-1806. 5’-TCATCATTTCTTCTAGTGT AGCTGCT-3’. cn-gag-C1. Forward. 861-889. 5’-GGGAAAGAAACACTATAT GCTAAAACACC-3’. cn-gag-c3. Reverse. 1092-1071. 5’-TAAGGCTTCTTTGGTGTCT CGT-3’. cn-gag-E2. Forward. 1029-1051. 5’-TACAATAGCAACCCTCTGG TGCG-3’. cn-gag-e3. Reverse. 1774-1752. 5’-CTGGATTCGCATTTTGGAC TAGC-3’. z 反應溫度 94℃ 2 分鐘、58℃ 1 分鐘、72℃ 2 分鐘，各 1 個 cycle；再來 94℃ 30 秒、58℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；94℃ 30 秒、57℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；94℃ 30 秒、56℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；94℃ 72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；接著 94℃. 30 秒、55℃ 30 秒、. 30 秒、54℃ 30 秒、72℃. 1 分鐘，共 25 個 cycle；最後 72℃ 10 分鐘，當整個反應完成後將 PCR 產物維持在 4℃。. z 洋菜膠電泳分析(Agarose gel electrophoresis) 最後取 5 μl second PCR 產物用 1%洋菜膠進行膠體電泳分析 (100V~150V，30~40 分鐘)。再將跑完的膠放入 EtBr (0.5 μg/ml) 染色 15 分鐘後，再將之褪染 5~10 分鐘。之後放置於 UV 燈下並 47.

(60) 照相，以確認複製後的 PCR 產物大小是否符合所要的片段 (subtype B：900 bp；subtype C：230 bp；CRF01_AE：740 bp)。. 3.第二次聚合酶連鎖反應 – 2(Second PCR – 2) 由於 CRF07_BC 和 CRF08_BC 都是以 subtype C 為骨架，在某些片段插入 subtype B 序列，而 cn-gag-C1/cn-gag-c3 這對引子是以 subtype C、CRF07_BC 和 CRF08_BC 三者序列相同的地方所設計的，故在 Second PCR 時皆會產生 230 bp 大小的片段。所以需進一步確認其為 subtype C 還是 CRF07_BC、CRF08_BC。將 First PCR 的 PCR 產物作為模板，並使用 cn-gag-C1/ cn-gag-BC 引子大量複製所需之 DNA 片段。反應溶液. 單管體積(μl). First PCR products. 最終反應濃度. 1 12.1. 滅菌過的二次水 Takara 10X EX TaqTM Buffer. 2. 1X. Takara dNTP Mixture. 1.6. 0.2 mM. cn-gag-C1(F). 1.6. 0.4μM. cn-gag-BC(R). 1.6. 0.4μM. Takara EX TaqTM. 0.1. 0.025 units/μl. 總體積 (μl). 20. 48.

(61) z Second PCR 所需引子 HXB2 position. 引子名稱 cn-gag-C1. Forward. 861-889. 5’-GGGAAAGAAACACTATAT GCTAAAACACC-3’. cn-gag-BC. Reverse. 1651-1628. 5’-CTTGTCTTATGTCCAGAAT GCTGG-3’. z 反應溫度 94℃ 2 分鐘、58℃ 1 分鐘、72℃ 2 分鐘，各 1 個 cycle；再來 94℃ 30 秒、58℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；94℃ 30 秒、57℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；94℃ 30 秒、56℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；94℃ 72℃ 1 分鐘，共 3 個 cycle；接著 94℃. 30 秒、55℃ 30 秒、. 30 秒、54℃ 30 秒、72℃. 1 分鐘，共 25 個 cycle；最後 72℃ 10 分鐘，當整個反應完成後將 PCR 產物維持在 4℃。. z 洋菜膠電泳分析(Agarose gel electrophoresis) 最後取 5 μl second PCR 產物用 1%洋菜膠進行膠體電泳分析 (100V~150V，30~40 分鐘)。再將跑完的膠放入 EtBr (0.5 μg/ml) 染色 15 分鐘後，再將之褪染 5~10 分鐘。之後放置於 UV 燈下並照相，以確認複製後的 PCR 產物大小是否符合所要的片段 (subtype C：無產物；CRF07_BC 或 CRF08_BC：790 bp)。. 49.

(62) 2292. 790. B C CRF01_AE CRF07_BC CRF08_BC. 1242 bp. Gag F2 (HXB2：790 → 814) cn-gag-B1 (HXB2：906 → 925). 925 bp 745 bp. cn-gag-E2 (HXB2：1029 → 1051) cn-gag-C1 (HXB2：861 → 889). 231 bp. Gag E2 (HXB2：2032 → 2011) cn-gag-b2 (HXB2：1831 → 1806) cn-gag-e3 (HXB2：1774 → 1752). First PCR Second PCR-1 判斷 subtype 為 subtype B、 subtype C 或 CRF01_AE. cn-gag-c3 (HXB2：1092 → 1071). Second PCR-2 cn-gag-C1 (HXB2：861 → 889). 790 bp. cn-gag-BC (HXB2：1651 → 1628). 多重巢式聚合酶連鎖反應 (gag-pol gene).. 50. 判斷 subtype 為 subtype C 或 CRF07_BC、CRF08_BC.

(63) 三、問卷資料分析問卷資料是以SPSS 13.0或SAS 9.1套裝軟體做統計分析處理，並利用雙尾檢定且p<0.05為達統計上顯著差異。本研究所使用的統計方法如下： (一)描述性統計 1. 類別變項：在問卷資料內，人口學變項(性別、教育程度、職業等)及相關危險行為(性取向、使用毒品情形、捐血、注射行為等) 中的類別變項是使用百分比或次數分配來進行描述性統計分析。 2. 連續變項：在問卷資料內，人口學變項(年齡、入監次數、收入等)及相關危險行為(共用針頭次數、與幾個人共用針頭等)中的類別變項是利用平均值、標準差或者是中位數、最大值及最小值來進行進行描述性統計分析。 (二)分析性統計分析性統計中將 HIV-1 亞型(subtype B、CRF01_AE、CRF07_BC) 作為依變項(類別變項)，分別對於問卷中各個變項進行統計檢定，以判斷兩者是否有統計上的差異。 1. ANOVA：HIV-1 亞型與基本人口學變項(年齡、入監次數、收入等)或相關危險行為(共用針頭次數、與幾個人共用針頭等)中的連續變項間的差異是使用 ANOVA 來進行統計檢定。 2. 卡方檢定或費歇爾精確檢定：HIV-1 亞型與基本人口學變項(性別、教育程度、職業等)或相關危險行為(性取向、使用毒品情形、捐血、注射行為等)中類別變項間的差異是使用卡方檢定來進行統計檢定。若在統計檢定中，細格(cell)的期望次數低於 5 或樣本總數低於 20 時，就已違反卡方檢定的假設前提，所以則須使用費歇爾精確檢定來進行統計檢定分析。 51.

(64) 第二節研究結果第一項研究對象資料描述在 HIV-1 亞型監測的研究中，以中國醫藥大學附設醫院檢驗科、感染科門診及監所(包括台中監獄、台中看守所、台中戒治所、花蓮監獄及桃園女子監獄)收取 HIV-1 陽性的病患/注射藥癮者受刑人的血液樣本及問卷做分析。血液樣本會進行 HIV-1 的亞型分析及演化分析；而問卷的部分，則分析相關危險因子與 HIV-1 亞型間的差異。在研究對象的血液樣本的部分，中國醫藥大學附設醫院檢驗科共收取 349 位，感染科門診則有 61 位，監所部分共收取 54 位，總共收取了 464 位研究對象的血液樣本 (表 1)。在全部所收取的血液樣本中，只有 24.6%有問卷資料(114/464)，其中在檢驗科部分全部都沒有問卷資料(0/349)，感染科門診全部都有問卷資料 (61/61)，而在監獄方面則有 98.1% (53/54)有問卷資料。病歷資料部分，檢驗科中約有 91.4%有病歷資料 (318/349)，而感染科部分則有 49.2%有病歷資料(30/61) (表 1)。此研究的研究對象分布方面以男性居多(86.0%)；若以不同樣本來源區分的話，三個樣本來源中的研究對象也以男性為多(檢驗科：86.8%；感染科： 79.1%；監所：88.4%) (p=0.364) (表 1)。年齡分布方面，所有研究對象的平均年齡為 37.1 ± 9.3 歲；若以不同樣本來源區分的話，檢驗科中的病患平均年齡較其他兩組而言是較年長的，其平均年齡為 37.8 ± 8.9 歲，其次為監所受刑人，平均年齡為 35.4 ± 9.6 歲，而感染科病患平均年齡是最年輕的，平均年齡為 33.7 ± 10.9 歲。三個樣本來源中的研究對象的平均年齡在統計上有顯著的差異(p=0.011) (表 1)。 52.