行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
肝臟卵圓細胞分離培養以及活體小鼠肝臟卵圓細胞移植
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2314-B-002-250- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院外科 計畫主持人： 袁瑞晃 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 10 月 29 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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肝臟卵圓細胞分離培養以及活體小鼠肝臟卵圓細胞移植
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I
solation and culture of hepatic oval cells and in vivo transplantation in mice※
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計畫類別：■個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號： NSC 91- 2314- B- 002- 250
執行期間： 91 年 8 月 1 日 至 92 年 7 月 31 日
計畫主持人：袁瑞晃 國立台灣大學醫學院外科部
共同主持人：陳惠玲 國立台灣大學醫學院附設醫院肝炎中心
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立台灣大學醫學院外科部
中 華 民 國 92 年 10 月 28 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
肝臟卵圓細胞分離培養以及活體小鼠肝臟卵圓細胞移植
Isolation and culture of hepatic oval cells and in vivo transplantation in mice
計畫編號：NSC 91- 2314- B- 002- 250
執行期限：91 年 8 月 1 日 至 92 年 7 月 31 日
主持人： 袁瑞晃 國立台灣大學醫學院外科部
共同主持人：陳惠玲 國立台灣大學醫學院附設醫院肝炎中心
一、中文摘要 在許多組織中均存在有幹細胞負責組 織的更新及修復功能，至於肝臟幹細胞的 存在問題則已經爭議多年，而目前較為人 所接受的觀念是肝臟確實存在具有幹細胞 特性的細胞，在特定的情況下此類細胞可 以被活化而分化成為成熟肝臟細胞，由於 此類細胞為不成熟的上皮細胞，具有卵圓 形的細胞核而細胞質極少因此被稱為卵圓 細胞。肝臟細胞移植研究使用的成熟肝細 胞分離後雖然可以加以培養，但數代之後 肝細胞便呈現老化現象，是目前無法克服 的障礙。由許多的研究顯示，人類病態肝 臟中也存在此類卵圓細胞，因此若能成功 的由病態肝臟中分離並培養肝臟卵圓細 胞，並實際將之移植於病態肝臟中就顯得 非常重要。本實驗的目的在於藉由化學藥 物以及大量肝臟切除的方法製造病態肝臟 以活化肝臟卵圓細胞，並將卵圓細胞由肝 臟中分離出來加以培養，再將卵圓細胞移 植到活體小鼠的病態肝臟中，以研究卵圓 細胞移植是否可以提供病態肝臟的再生。 本實驗將使用 C57BL/6 以及 DPPIV(Dipeptidyl Peptidase IV) knock-out 兩種不
同的小鼠，首先將C57BL/6 小鼠連續餵食
Acetylaminofluorene (AAF, 7.5mg/kg/day) 十四天，其中於第七天時進行百分之七十
其albumin（當膽管所產生的幹細胞進入肝
臟基質中便會產生 albumin）、cytokeratin 7、Thy-1（為 cell surface glycoprotein 可見 於hematopoietic stem cell 及 oval cell）的表
現。此外利用DPPIV 突變的小鼠，同樣利 用AAF 抑制其肝臟細胞再生能力，在進行 大量肝臟切除的同時移植由C57BL/6 分離 培養之卵圓細胞，最後在術後兩週、四週、 兩個月、四個月及六個月時犧牲取其肝臟 利用組織化學染色以區別呈現DPPIV 的外 來移植細胞，並利用 albumin、cytokeratin 7、Thy-1 的表現來測定移植卵圓細胞的分 化情形。 關鍵詞：卵圓細胞分離、卵圓細胞移植、 肝臟部分切除術、cytokeratin、Thy-1 Abstract
Stem cells with multiple differentiation potential have been verified in several different tissues. The existence of a liver stem cell was controversial for many years, but it is now generally accepted that liver contains kinds of cells with stem-like properties and these cells can be activated under certain conditions and differentiated into hepatocytes. By reason of their oval shaped nucleus and scanty cytoplasm, these
impacts on proliferative ability and viability after several generations made their usage limited. Under a variety of pathological conditions, similar small cells can be found in human liver too. Therefore, searching for the hepatic stem cells that can be cultured for a long period and application of these cells in hepatic cell transplantation become more and more imminent. In this study, we use
chemical agent combined with partial hepatectomy as a model of diseased liver to activate hepatic oval cells for isolation and cell culture. Then these cells will be
transplanted into the diseased mice in order to verify the ability of differentiation and repopulation of oval cells in vivo.
Both C57BL/6 and DPPIV (Dipeptidyl Peptidase IV) knock-outmice will be used in this study. C57BL/6 mice will receive oral gavage of Acetylaminofluorene(AAF, 7.5mg/kg/day, dissolved in polyethylene glycol) for 14 days totally. Two-third partial hepatectomy will be performed at the 24 hours after the first six daily gavages (day 7th). Hepatic oval cells will be isolated using two-step collagenase perfusion method and seeded in collagen-coated tissue culture dishes. Immunohistochemical studies about the γ-glutamyl transpeptidase、
α-fetoprotein、albumin、cytokeratin 7、 cytokeratin 18、cytokeratin 19、Thy-1 will be used to evaluated the characters of these cell.. Then the oval cells will be transplanted into AAF pretreated PPIV knockout mice immediately after two-third partial hepatectomy. The recipients will be sacrificed two weeks, four weeks, two months, four months and six months after the cell transplantation. Histochemical staining will be used to distinguish the donor
cells and albumin、cytokeratin 7、Thy-1 will be used to identify the character of oval cell proliferation and differentiation
Keywords: oval cell isolation, oval cell transplantation, partial hepatectomy, cytokeratin, Thy-1 二、緣由與目的 器官移植一直是器官功能末期病人疾 病存活所仰賴，但是由於捐贈器官的來源 非常有限，許多病人無法度過等待器官期 而失去生命。對於腎臟衰竭病人而言可以 利用洗腎機度過冗長的等待期，心臟衰竭 病人則可暫時利用人工心臟輔助失去的功 能，只有肝臟則因其功能複雜，困難度更 高而無法完全克服，雖然有報告利用活體 近親捐贈部分肝臟以克服肝臟器官來源不 易的現象，但畢竟來源也有限，而且捐贈 者仍須冒手術的危險，並非長久之計。近 年來醫學界雖然致力於人工肝臟的製造， 但是成果到目前還是不顯著，因此近年來 學者便導入細胞移植(Cell transplantation) 以及肝臟細胞再殖民(Hepatocyte repopulation)1的觀念，希望以此概念可以 克服肝臟器官移植捐贈者不足的缺點。 目前的報告有學者利用培養後的肝細 胞進行細胞移植研究，因此要進行肝臟細 胞移植首先要做的是就是肝臟細胞的培 養，但是目前對於肝臟細胞培養最大的問 題就在於培養的代數有限，且肝細胞經過 數代分裂後便呈現老化現象，也就是說正 常肝細胞無法如同肝癌細胞可以形成細胞 株(Cell line)而長期培養，隨時可以得到需 要的細胞，而利用改造肝細胞進行移植的 實用性及安全性則未知2,3，利用胚胎肝臟 肝原細胞移植也可以造成肝臟再生4，但是 分離肝原細胞必須由懷孕母體取出胚胎， 在道德倫理方面較容易存在有爭議。許多 學者因而致力於肝臟幹細胞的研究。對於
此幹細胞的研究爭論頗多，而目前較為人 所接受的觀念是肝臟確實存在具有幹細胞 特性的細胞，在特定的情況下尤其是肝臟 成熟細胞再生能力受到抑制或者其再生能 力不足以應付肝細胞損失時，此類細胞可 以被活化而分化成為成熟肝臟細胞5，由於 此類細胞為不成熟的上皮細胞，具有卵圓 形的細胞核而細胞質極少因此被稱為卵圓 細胞6,7,8。卵圓細胞直徑約3-5μm，比小 膽管細胞更小(6μm)9。早在1958 年就有 報告卵圓細胞或稱小膽管細胞 (cholangioles)可以分化成成熟肝細胞10，目 前也有許多報告證實此觀點11, 12, 13。此外 更有報告認為卵圓細胞可以分化成腸胃道 幹細胞14、杯狀細胞(goblet cells)15、內分 泌細胞及Paneth 氏細胞16, 17。許多報告並 指出，卵圓細胞是由肝臟膽管細胞分化而 產生18,19,，且由卵圓細胞所構成的結構往 往和原有膽管結構相連20，此外卵圓細胞 也同時具有肝臟細胞及膽管細上皮細胞的 特徵21,22由許多的研究顯示，人類病態肝 臟中也存在此類卵圓細胞23,24,25，因此能由 病態肝臟成功的分離並培養肝臟卵圓細 胞，並實際將之運用於肝臟細胞移植就顯 得非常重要。本實驗的目的在於藉由化學 藥物以及肝大量肝臟切除的方法製造病態 肝臟而活化肝臟卵圓細胞，並將卵圓細胞 由肝臟中分離出來加以培養(In vitro)，再將 卵圓細胞移植到活體小鼠的病態肝臟中(In vivo)，以研究卵圓細胞移植是否可以提供 病態肝臟的再生。 Acetylaminofluorene (AAF)為芳香族 胺類化學劑，由於肝臟細胞中所富含的 phase I metabolic enzyme 為代謝 AAF 的重 要酵素，可以將它代謝成具有細胞毒性的 分裂抑制劑N-hydroxy acetylaminofluorene，使得肝臟成熟細胞無 會造成肝臟細胞在肝臟受到其它損傷時喪 失再生能力11，而相對的卵圓細胞因沒被 抑制而可以持續增殖，因此理論上肝臟組 織中的幹細胞就會被大量的活化，在所有 肝臟內細胞所佔的百分比就會明顯增加， 適合分離培養。Dipeptidyl peptidase IV(DPPIV)是一種 serine 蛋白酵素，也是 一種和T 淋巴球訊息傳導有關的細胞表面 分化標記26,27。正常小鼠肝臟切片利用組 織化學法可以將肝臟細胞表面染成紅色， 而DPPIV 突變的小鼠肝臟細胞雖然無法染 出此蛋白，但仍然具有功能正常的肝臟可 以正常生長，因此將正常小鼠細胞移植到 DPPIV 突變的小鼠時，不需使用免疫染色 法也不需事先在移植細胞中引入辨識標 記，DPPIV 就變成是一種追蹤移植細胞很 好的標記(如附圖，箭頭所指的是移植的正 常小鼠肝臟細胞，背景其他是DPPIV 突變 小鼠肝臟細胞)。 國內有技術且能夠進行肝臟細胞培養 的實驗室有限，台大醫院肝炎研究中心實 驗室對於肝臟細胞的長時間培養相當成 功。由以往的研究知道AAF 以及大部分肝 臟門脈血流阻斷(國科會 89 年度計畫編 號：NSC 89-2314-B-002-436)可以有效的活
臟注射等其間接進入肝臟進展到可以直接 經由肝臟門靜脈移植細胞。因此希望能更 進一步完成肝臟卵圓細胞的培養，並將之 實際運用到已經建立的活體動物實驗模式 上，建立往後肝臟細胞移植新的方向。 設計此研究計畫的目的是： 1. 建立小鼠病態肝臟的實驗模式 2. 建立活化小鼠肝臟幹細胞（卵圓細胞） 的研究模式 3. 建立小鼠肝臟卵圓細胞的分離技術 4. 建立小鼠肝臟卵圓細胞的培養技術 5. 建立小鼠肝臟細胞移植的實驗動物模 式 6. 探討小鼠移植肝臟卵圓細胞於肝臟再 生組織中所在的位置 7. 觀察小鼠卵圓細胞於肝臟再生時所扮 演的角色 8. 評估各種因子表現與肝臟卵圓細胞以 及肝臟再生間的相互關係 本實驗最終目的就是利用小鼠病態肝臟模 仿人類病態肝臟尋找卵圓細胞，建立分離 培養肝臟幹細胞的基礎，並將卵圓細胞移 植入其他小鼠病態肝臟中，找尋肝臟卵圓 細胞在肝臟再生以及肝臟細胞移植中所佔 的角色，並為肝臟細胞移植的研究建立基 礎。 三、結果與討論
C57BL/6
mice 由管餵管餵食 AAF (acetylaminofluorene；7.5 mg/Kg of body weight) 7 天，在第 8 天時由 IP 注射 CCl4 25 μl，之後再繼續餵食 AAF (7.5 mg/Kg of body weight) 7 天，經過三天後即可以在 mouse liver intraportal area 可以觀察到許 多oval cell 被活化，利用 CK-7 以及 Thy-1 免疫組織染色法可以見到這些細胞 (Fig. 1)，且這些活化的細胞除了沿著 portal area擴展到相鄰的portal area，且有少數細胞更
進一步進到liver parenchyma 中。
(Fig. 1A.: CK-7 immunohistochemical staining. Ten days after the CCl4 injection,
CK-7 positive oval cell proliferation at portal area with extension to adjacent portal area (Open arrow) and liver
parenchyma(black arrow) was found. 1B: Thy-1 immunohistochemical staining. Ten days after the CCl4 injection, Thy-1
positive oval cell proliferation at portal area with extension to adjacent portal area (arrow head) was found.)
將餵食AAF (7.5 mg/Kg ) 7 天，第 8 天注射 CCl4 25μl，之後再繼續餵食 AAF (7.5
mg/Kg) 7 天，再經過 3 天 in vitro culture 之 後，在光學顯微鏡底下可以觀察到具有卵 圓形細胞核、細胞質較少的oval cells (Fig. 2)，且此 oval cells 可以繼續增生，具有明 顯形成群聚的能力(colonization ability)，因 此可以進行較短時間的培養以便進行其他 的實驗。
(Fig. 2 Three days after in vitro culture, the oval cells proliferate and established into a colony)
若繼續培養，七天後則可以見到許多群聚 已經匯合起來(Fig. 3)且仍然具有原先分離 下來卵圓形細胞核、細胞質較少的特性，
(Fig. 3 After culture for seven days, the colonies of oval cells became confluence) 此外我們更利用西方墨點法(western blot) 來分析所培養的細胞的分泌物質，並且與 我們由ED15.5(由懷孕 15.5 天的母鼠體內 分離出來的胚胎)小鼠胚胎肝臟中得到的 肝臟肝原母細胞(hepatobalst)加以比較(Fig. 4)，也發現經過 AAF 及 CCl4 處理過的 C57BL/6 小鼠肝臟中所分離出來的細胞和 胚胎肝臟肝原母細胞類似，不但有白蛋白 的分泌且同時有胎兒蛋白的產生。此代表 所得到的細胞已具肝細胞特性，但仍在細 胞分化的早期階段。
(Fig. 4 Liver-specific protein detection. 經 過3 天 in vitro culture 之後， 比較 mouse oval cells 和 15.5 天胚胎肝細胞
（hepatoblast）細胞培養基中 albumin 和 α-fetoprotein 含量的差異。（a）Lane 1, 2 為oval cells, total protein 200µg；lane 3, 4 為 ED15.5 的 hepatoblasts，total protein 10µg； 圖（b）Lane 1, 2 為 oval cells, total protein 20µg；lane 3, 4 為 ED15.5 的 hepatoblasts，total protein 200µg。) 在經過三天後的C57BL/6 小鼠肝臟細胞分 離下來後進行細胞培養，在培養三天後也 可以利用CK-7 以及 albumin 免疫組織染色 法可以見到這些細胞不但具有膽管組織的 特性，同時可以開始製造肝臟細胞特性的 白蛋白(Fig. 5)。
(Fig. 5 Three days after cell culture, the oval cells contains both characteristics of bile duct cells and hepatocytes)
此種現象代表經過AAF 及 CCl4 處理過的
C57BL/6 小鼠肝臟中所分離出來的細胞同
時有CK-7 和 albumin 的表現，可能為
bipotential cells，將來有可能進一步分化成 為bile duct cells 或是 hepatocytes。 接著將分離下來的 Oval cells (1 x 106/mice) 經由脾臟注射移植到接受 2/3 partial hepatectomized 的 CD26 knock-out mice(DPPIV 的基因剔除小鼠)，在三天時 即可以見到在受贈者肝臟中的肝門周圍區 (periportal region)可以見到具有 DPPIV 酵 素活性的移植細胞，也就是代表移植細胞
(Fig. 6 Three days after cell transplantation into partial hepatectomized mice, CK-7 positive cellscan be found in periportal region.)
將分離出來的oval cells（1 x 106/mice）
經由脾臟注射移植到接受2/3 partial
hepatectomized 的 CD26 knock-out mice （DPPIV-deficiency）經過 28 天之後，我
們利用DPPIV 酵素活性染色以及 DPPIV
免疫組織化學染色法已經可以在受贈者 (CD26 knock-out mice)的肝臟中觀察到 DPPIV-positive cells，且這些細胞也開始進 駐到肝臟的間質(Fig. 7)。表示 donor cells
能夠進駐recipient mice 肝臟，而且已經開
始表現正常肝細胞功能。
(Fig. 7 One month after the cell
transplantation, the donor cells can be found in the periportal and parenchymal region (arrow) in the recipient liver.)
四、計畫成果自評 由此研究我們建立了小鼠肝臟卵圓細 胞的實驗動物模式，其中包括肝臟卵圓細 胞的刺激增生技術、小鼠肝臟卵圓細胞分 離技術以及小鼠卵圓細胞的活體動物移植 實驗模式。此提供以往移植肝臟成熟細胞 在缺乏進一步刺激下停止分裂生長問題另 一解決的途徑。此研究較不足的是，雖然 可以成功的移植肝臟卵圓細胞，但成功率 仍有待加強。不過值得鼓勵的是我們進行 移植的小鼠基本上是健康的小鼠，只接受 肝臟約百分之七十的切除術，也就是說只 有一次的肝臟生長刺激，這和目前世界上 進行類似研究而利用許多藥物抑制肝臟細 胞再生以取得移植優勢的實驗並不相同， 也就是說在許多藥物作用的動物模式實際 上並不存在於人類疾病當中，我們也不可 能為了移植將此類藥物使用在病人身上， 這是此研究較佔上風的原因。 雖然在此研究中我們雖然成功的進行 了小鼠卵圓細胞的活體動物實驗模式，但 將來必須對於此細胞的特性加以研究，對 此細胞的培養也需繼續進行，並必須找出 卵圓細胞不易為肝臟所接受的主要原因， 期望不久的將來可以進行較為成功的肝臟 卵圓細胞移植。 五、參考文獻
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