中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/50191

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(1)中國醫藥大學中醫學系博士班博士論文. 指導教授：林昭庚. 教. 授. 共同指導教授：鍾景光. 教. 授. 論文題目. 大黃粗萃物與其主成分大黃素對於人類大腸直腸癌細胞株細胞凋亡之研究 The Study of Apoptosis Induction by Rheum Palmatum L and Emodin on Human Colorectal Cancer Cell Line. 研究生：馬易世. 中華民國一 ○ 二年四月八日.

(2) 目錄第一章前言 .................................................................................................................. 1 1.1 研究背景及動機 .............................................................................................. 1 1.2 研究目的及設計 .............................................................................................. 2 第二章文獻探討........................................................................................................... 3 2.1 大腸癌 ............................................................................................................. 3 2.2 大腸癌的治療 .................................................................................................. 4 2.3 細胞凋亡在癌症治療的角色 ........................................................................... 4 2.4 細胞凋亡的外在路徑與內在路徑 ................................................................... 5 2.5 Caspase 蛋白質家族 ........................................................................................ 7 2.6 粒線體與細胞凋亡 .......................................................................................... 7 2.7 內質網與細胞凋亡 .......................................................................................... 9 2.8 其他細胞凋亡的相關機制 ............................................................................. 10 2.9 腫瘤轉移........................................................................................................ 11 2.10 腫瘤轉移與相關機轉 ................................................................................... 11 2.11 大腸癌的中醫觀點 ...................................................................................... 13 2.12 大黃與大腸癌的中醫論治 ........................................................................... 14 2.13 大黃的毒性與安全性 .................................................................................. 16 2.14 大黃的重要成分 .......................................................................................... 16 2.15 大黃素的現代研究 ...................................................................................... 17 第三章材料與方法 ..................................................................................................... 19 3.1 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉 ..................... 19 3.1.1 大黃粗萃物之抽提製備 ...................................................................... 19 3.1.2 大黃粗萃物之 Emodin 定量................................................................ 19 3.1.3 試劑 ..................................................................................................... 21 3.1.4 細胞培養 ............................................................................................. 21 3.1.5 流式細胞儀測定細胞存活率 .............................................................. 22 3.1.6 流式細胞儀測定細胞週期分布 .......................................................... 22 3.1.7 彗星試驗與 DAPI 染色 ....................................................................... 22 3.1.8 測定流式細胞儀細胞內鈣離子濃度 ................................................... 23 3.1.9 流式細胞儀測定 Caspase-3、caspase-8 與 caspase-9 之活性 ............. 23 3.1.10 雷射共軛焦顯微鏡測定 LS1034 細胞株之蛋白質轉運 ................... 23 3.1.11 西方墨點法測定 LS1034 細胞株之細胞週期與凋亡相關蛋白質的表現 ...................................................................................................................... 24 3.1.12 統計方法 ........................................................................................... 24 iv.

(3) 3.2 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉 ............................. 25 3.2.1 試劑 ..................................................................................................... 25 3.2.2 細胞培養 ............................................................................................. 26 3.2.3 型態改變 ............................................................................................. 26 3.2.4 流式細胞儀測定細胞存活率 .............................................................. 26 3.2.5 DNA content 測定與 sub-G1(Apoptosis)測定 ...................................... 27 3.2.6 DAPI 染色 ............................................................................................ 27 3.2.7 活性氧物質、粒線體膜電位與鈣離子濃度測定................................ 27 3.2.8 流式細胞儀與特異性抑制劑測定 Caspase-3 和 Caspase-9 之活性 .... 28 3.2.9 西方墨點法測定 LS1034 細胞株凋亡相關蛋白質之表現 ................. 28 3.2.10 RNA 製備與 real-time PCR ................................................................ 29 3.2.11 統計分析 ............................................................................................ 30 3.3 體內抗癌試驗 ................................................................................................ 30 3.3.1 實驗動物 ............................................................................................. 30 3.3.2 動物造模與試驗.................................................................................. 30 3.4 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 轉移與侵犯之作用與機轉 ................ 31 3.4.1 試劑 ..................................................................................................... 31 3.4.2 傷口癒合試驗 ...................................................................................... 31 3.4.3 基底膜基質侵犯能力試驗 ................................................................... 32 3.4.4 明膠酶譜分析試驗 ............................................................................... 32 3.4.5 西方墨點法測定 LS1034 細胞株轉移與侵犯相關蛋白質之表現 ....... 33 3.4.6 統計分析 .............................................................................................. 33 第四章結果 ................................................................................................................ 34 4.1 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉 .................... 34 4.1.1 大黃粗萃物含大黃素之測定 ............................................................... 34 4.1.2 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株存活率之影響..................................... 34 4.1.3 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株細胞週期之影響 ................................. 36 4.1.4 彗星試驗評估大黃粗萃物對 LS1034 細胞株 DNA 損傷之影響 ....... 37 4.1.5 DAPI 染色評估大黃粗萃物對 LS1034 細胞株 DNA 損傷之影響 ..... 40 4.1.6 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株鈣離子濃度之影響 ............................. 42 4.1.7 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株凋亡相關蛋白質轉運之影響.............. 43 4.1.8 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株 caspase-3、caspase-8 與 caspase-9 活性之影響........................................................................................................... 45 4.1.9 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株細胞週期與凋亡相關蛋白質表現之影響 ...................................................................................................................... 47 4.2 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉 ............................ 50 4.2.1 大黃素對 LS1034 細胞株型態學與存活率之影響 .............................. 50 4.2.2 大黃素對 LS1034 細胞株細胞週期與凋亡之影響 ............................. 51 v.

(4) 4.2.3 DAPI 染色評估大黃素對 LS1034 細胞株 DNA 損傷之影響.............. 53 4.2.4 大黃素對 LS1034 細胞株活性氧物質之影響..................................... 55 4.2.5 大黃素對 LS1034 細胞株鈣離子濃度之影響..................................... 55 4.2.6 大黃素對 LS1034 細胞株粒線體膜電位之影響 ................................. 55 4.2.7 大黃素對 LS1034 細胞株 caspase-9 與 caspase-3 活性之影響........... 57 4.2.8 大黃素對 LS1034 細胞株凋亡相關蛋白質表現之影響 ..................... 57 4.2.9 大黃素對 LS1034 細胞株 caspase-3 與-9 mRNA 表現之影響 ........... 59 4.3 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 異體轉殖之作用........................................ 61 4.4 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 轉移與侵犯之作用與機轉 ................. 63 4.4.1 傷痕癒合試驗 ...................................................................................... 63 4.4.2 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 轉移與侵犯之作用 ................. 64 4.4.3 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株腫瘤侵犯相關蛋白質轉運之影響 ....... 64 4.4.4 西方墨點法測定 LS1034 細胞株轉移與侵犯相關蛋白質之表現 ....... 69 第五章討論 ................................................................................................................ 71 第六章結論 ................................................................................................................ 78 跋.................................................................................................................................. 80 參考文獻 ...................................................................................................................... 81 ABSTRACT ................................................................................................................. 88 謝辭 .............................................................................................................................. 90. vi.

(5) 圖目錄圖 1.1. 實驗研究設計流程圖 ........................................................................................ 2. 圖 2.1 細胞凋亡的外在路徑與內在路徑 ..................................................................... 6 圖 2.2 大黃素的結構式 ...............................................................................................16 圖 3.1 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 異體轉殖腫瘤作用之流程圖 ......................31 圖 4.1 大黃素標準品的 HPLC 測定 ............................................................................35 圖 4.2 大黃檢品的 HPLC 測定 ....................................................................................35 圖 4.3 圖 4.4 圖 4.5 圖 4.6 圖 4.7 圖 4.8 圖 4.9 圖 4.10 圖 4.11 圖 4.12 圖 4.13 圖 4.14 圖 4.15. 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株存活率之影響 ..................................................36 不同濃度大黃粗萃物對 LS1034 細胞株細胞週期之影響 ..............................38 量化不同濃度大黃粗萃物對 LS1034 細胞株細胞週期之影響 ......................38 不同培養時間大黃粗萃物對 LS1034 細胞株細胞週期之影響 ......................39 量化不同培養時間大黃粗萃物對 LS1034 細胞株細胞週期之影響 ..............39 彗星試驗觀察大黃粗萃物誘導 LS1034 細胞株之 DNA 損傷 .........................40 量化彗星試驗量化大黃粗萃物誘導 LS1034 細胞株之 DNA 損傷 .................40 DAPI 染色觀察大黃粗萃物誘導 LS1034 細胞株之 DNA 損傷 .....................41 量化 DAPI 染色量化大黃粗萃物誘導 LS1034 細胞株之 DNA 損傷 ............42 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株鈣離子濃度之影響 ........................................43 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株凋亡相關蛋白質轉運之影響 ........................44 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株 caspase-3、-8 與-9 活性之影響 .......................46 Caspase-3、-8 與-9 抑制劑對大黃粗萃物抑制 LS1034 細胞株存活率之影響. ..........................................................................................................................................47 圖 4.16 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株細胞週期與凋亡相關蛋白質表現之影響......48 圖 4.17 大黃素對 LS1034 細胞株型態學之影響 ........................................................50 圖 4.18 大黃素對 LS1034 細胞株存活率之影響 ........................................................51 圖 4.19 不同濃度大黃素對 LS1034 細胞株細胞週期之影響 ....................................52 圖 4.20 不同濃度大黃素對 LS1034 細胞株細胞凋亡之影響 ....................................52 圖 4.21 不同濃度大黃素對 LS1034 細胞株細胞 DNA 含量變化之影響 ...................53 圖 4.22 DAPI 染色觀察大黃素誘導 LS1034 細胞株之 DNA 損傷 .............................54 圖 4.23 量化 D API 染色大黃素誘導 LS1034 細胞株之 DNA 損傷 ...........................54 圖 4.24 大黃素對 LS1034 細胞株活性氧物質之影響 ................................................56 圖 4.25 大黃素對 LS1034 細胞株鈣離子濃度之影響 ................................................56 圖 4.26 大黃素對 LS1034 細胞株粒線體膜電位之影響 ............................................57 圖 4.27 大黃素對 LS1034 細胞株 caspase-3 與-9 活性之影響 ....................................58 圖 4.28 Caspase-3 與-9 抑制劑對大黃素抑制 LS1034 細胞株存活率之影響 ............58 圖 4.29 大黃素對 LS1034 細胞株凋亡相關蛋白質表現之影響 ................................59 圖 4.30 大黃素對 LS1034 細胞株 caspase-3 與-9 mRNA 表現之影響 .......................60 vii.

(6) 圖 4.31 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 異體轉殖之影響 ........................................61 圖 4.32 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 異體轉殖腫瘤重量之影響 ........................62 圖 4.33 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 異體轉殖腫瘤體積之影響 ........................62 圖 4.34 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 之傷痕癒合試驗 ................................63 圖 4.35 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 轉移之作用 ........................................65 圖 4.36 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 轉移作用之量化 ................................65 圖 4.37 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 侵犯之作用 ........................................66 圖 4.38 量化大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 侵犯作用 ....................................66 圖 4.39 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株腫瘤侵犯相關蛋白質轉運之影響 ................67 圖 4.40 西方墨點法測定 LS1034 細胞株轉移與侵犯相關蛋白質之表現 ................70 圖 5.1 大黃粗萃物誘導 LS1034 人類大腸直腸癌細胞細胞週期休止與凋亡可能之相關機轉 ............................................................................................................................76 圖 5.2 大黃素誘導 LS1034 人類大腸直腸癌細胞細胞週期休止與凋亡可能之相關機轉 ....................................................................................................................................76 圖 5.3 大黃粗萃物抑制 LS1034 人類大腸直腸癌侵犯與轉移可能之相關機轉 ......77. viii.

(7) 大黃粗萃物與其主成分大黃素對於人類大腸直腸癌細胞株細胞凋亡之研究研究生：馬易世指. 導. 教. 授：林昭庚. 教授. 共同指導教授：鍾景光. 教授. 中國醫藥大學中醫學系博士班根據統計，大腸直腸癌是臺灣的主要死亡癌症之一，而數千年來大黃一直是中醫用於治療消化系統疾病的常用藥物。本研究藉由流式細胞儀與 DAPI 染色法證實大黃粗萃物可誘導 LS1034 人類大腸直腸癌細胞株產生細胞凋亡與 G0/G1 期休止。大黃粗萃物可增加 LS1034 癌細胞株之細胞內鈣離子濃度，並刺激 caspase-9 與-3 之活性。其可增加 Bcl-XS 促凋亡蛋白表現，增加 Bax/Bcl-2 比例，抑制 Bcl-2 與 Bcl-XL 抗凋亡蛋白表現。其亦可促進 caspase-9 與-3、cytochrome c、AIF、Endo G 等蛋白之表現，進而誘導 LS1034 癌細胞株產生粒線體路徑之細胞凋亡。大黃素為大黃主要之活性成分，具有抑制多種人類癌細胞株的作用。本研究證實大黃素可造成 LS1034 細胞株型態改變、存活率下降、DNA 損傷與產生 G0/G1 期休止等。其可誘導 LS1034 細胞產生活性氧物質、增加鈣離子濃度並降低粒線體膜電位。並可增加 caspase-3 和-9 之活性、促進 caspase-9、細胞質 cytochrome c 與 AIF 蛋白質表現、增加 Bax/Bcl-2 比例，促進 caspase-3 與-9 mRNA 表現。結果說明大黃素誘導 LS1034 癌細胞株之凋亡亦可能與粒線體路徑有關。此外，LS1034 癌細胞株異體轉殖體內試驗亦證實大黃素在腫瘤重量或體積上都具有顯著之抑制作用。最後，轉移侵犯是影響大腸直腸癌患者預後與存活的重要因素。本研究顯示大黃粗萃物可抑制 LS1034 細胞株之轉移與侵犯，可抑制核內與胞質中 MMP-2 與-9 蛋白轉位與表現，而大黃粗萃物抑制 LS1034 癌細胞株轉移侵犯的作用則可能經由抑制 ERK 與 PI3K/AKT 路徑。 1.

(8) 關鍵詞：大黃素. 大黃. 人類大腸直腸癌 LS1034 細胞株. 粒線體異體轉殖轉移. 2. 細胞凋亡.

(9) 第一章前言. 1.1 研究背景及動機癌症是全球的主要死因之一，其中大腸直腸癌 (colorectal carcinoma)更是主要的死亡癌症之一[1]。依臺灣衛生署之統計資料，西元 2010 年便有 41,046 人死於癌症，其中屬於結腸、直腸和肛門癌症更以死亡人數占率 11.4%而名列第三順位[2][3]。大腸癌的治療除了外科手術、化療、放射療法與標靶治療等治療方法外，中醫藥以獨特的醫學與哲學觀而運用天然藥物來治療疾病，因而不管是治療腫瘤或是維持患者生活品質等都有其不可忽視的地位。細胞凋亡(apoptosis)是許多不同發展階段與正常生理機能中的重要環節。凋亡機制的缺陷不僅可使癌細胞避免被排除，也可能賦予其對化療藥物的抵抗能力。因此是否能調節細胞凋亡已被視為促進腫瘤死亡與增加化學、放射、標靶治療療效的有利手段，而中藥誘發癌細胞凋亡的作用也逐漸受到科學界所重視，在傳統中醫之觀點，大黃無疑是治療消化道疾病的重要藥材之一。而綜觀相關研究亦發現，大黃素對於許多腫瘤細胞分別具有抑制增殖、促進凋亡、防止轉移或加強化療效果等作用[46~62]。然而目前的研究成果對於中草藥大黃及其主成分大黃素對於大腸癌細胞的作用與機轉尚不清楚，因此本研究欲藉由體外試驗方式評估生藥大黃粗萃物以及大黃主成分大黃素對於 LS1034 人類大腸癌細胞株之影響、誘導細胞凋亡與相關機轉，並藉由異體轉殖動物造模來評估大黃素對於 LS1034 細胞株體內試驗之結果。. 1.

(10) 1.2 研究目的及設計本研究欲藉由體外試驗方式評估生藥本研究欲藉由體外試驗方式評估生藥大黃粗萃物以及大黃主成以及大黃主成分大黃素對於 LS1034 人類大腸癌細胞株存活率之影響、型態改變型態改變、誘導細胞凋亡與相關誘導細胞凋亡與相關蛋白質或基因之表現，並藉由異體轉殖動物造並藉由異體轉殖動物造本實驗研究模來評估大黃素對於 LS1034 細胞株體內試驗之結果。本實驗研究設計流程圖呈現於圖 1.1。. LS1034人類大腸癌細胞株. 體內試驗. 體外試驗. 大黃萃取物. 細胞存活率. 細胞週期測定. 彗星試驗與 D A P I 染色. 圖 1.1. 鈣離子濃度. 相關 C a s p a s e 活性. 凋亡相關蛋白質轉運與表現. 大黃素. 傷痕試驗. 轉移相關蛋白質運轉與表現. 細型胞態存改活變率. 實驗研究設計流程圖. 2. 異體轉殖相動關物相相造 C 細 D 粒活鈣關關模胞 A 線 a 性離蛋 R s 週 P 體氧子 p 白 N 期 I 膜 a 質 A 物濃測染電 s 質度表表定色位 e 現現活性.

(11) 第二章文獻探討. 2.1 大腸癌癌症是全球的主要死因之一，僅西元 2008 年便奪走全球 760 萬人的性命，約佔所有死亡人數的 13%，其中大腸直腸癌(colorectal carcinoma)更以造成 60 萬 8000 人死亡而成為主要死亡癌症之一[1] 。依據臺灣國民健康局之資料，2009 年國人大腸癌的發生人數為十大常見癌症之第一位[2]。另依臺灣衛生署之統計資料，惡性腫瘤自 1982 年起即為國人死因之首，2010 年便有 41,046 人死於癌症，而其中屬於結腸、直腸和肛門癌症更以死亡人數占率 11.4%而名列第三順位[3]。此外，臺灣大腸癌之標準化發生率為美國的 1.4 倍，標準化死亡率則為美國的 1.7 倍[2]。在鄰近之中國大陸地區，大腸直腸癌的發病率業已高居惡性腫瘤之第三位[4]，而於 2004~2005 年間其死亡率則為惡性腫瘤死亡之第五順位[5]。另外根據流行病學的統計，全世界每隔 7 秒鐘就有一個人進入 50 歲；每隔 3.5 分鐘就有一個人被診斷出罹患大腸直腸癌；另每隔 9 分鐘便有一個人因大腸直腸癌而過世[6]。大腸直腸癌在出血或絞痛之症狀出現前大多有數年的潛伏期，伴隨的症狀可能有腹瀉、便秘、疲倦與不明原因貧血等臨床症狀。癌細胞可直接散佈或經血液、淋巴轉移，較常見的轉移部位有局部淋巴結、肝臟、肺臟與骨骼。而 CEA 升高則可作為大腸直腸癌之診斷與復發的指標[6]。根據美國的族群調查顯示，除了年齡、家族史、過去病史等不可抗拒的因素之外，高脂肪飲食、蔬果攝食量低、運動量不足、肥胖、抽菸與飲酒等亦是罹患大腸直腸癌的高危險因子[6]。. 3.

(12) 2.2 大腸癌的治療大腸癌的治療除了傳統之外科手術、全直腸繫膜切除術、微創手術等根治性手術治療外，術前化療、術中化療、術後化療、放射療法與標靶治療等也是臨床常用或合併使用之治療方法，另外尚屬試驗階段之基因治療與腫瘤疫苗等也逐漸被發展[7]。中醫藥藉由特有的醫學與哲學觀，並利用天然藥物來治療疾病。對於癌症的觀點雖然不同於現代西方醫療，然而不管是治療腫瘤或是維持患者生活品質都有其不可忽視的地位。癌症的機轉相當複雜，但細胞凋亡是近來科學界所重視的環節，許多的研究證明，獲得逃脫細胞凋亡的機制是腫瘤細胞重要的特徵，所以是否能調節細胞凋亡被視為促進腫瘤死亡與增加化學、放射、標靶治療療效的有利手段[8]。因此許多中藥也朝這個方向做研究。 2.3 細胞凋亡在癌症治療的角色與發炎性之細胞壞死(necrosis)不同，細胞凋亡(apoptosis)為細胞進行程序性死亡(programmed cell death, PCD)時廣泛且高度受調控的機制[8]，也是許多不同發展階段與正常生理機能中的重要環節。如胎兒發展過程的神經系統、指趾頭形成、胃腸道形成、骨骼重塑、自體免疫抑制以及防止病毒感染等都與細胞凋亡有關[8]。換句話說，細胞凋亡與細胞增殖是維持生物個體恆定時正常且必要的因素。細胞凋亡呈現的特徵包含細胞質濃縮(cytoplasmic shrinkage)、細胞膜突起(membrane blebbing)、細胞核碎裂(nuclear fragmentation)、核小體內 DNA 碎裂(intranucleosomal DNA fragmentation)、膜磷脂質外翻(phosphatidylserine exposure)，最後形成凋亡小體(apoptotic bodies)而被巨噬細胞(macrophages)或其他吞噬細胞(engulfing cells) 所吞噬[9]。目前認為細胞凋亡的誘發可歸為外在路徑(extrinsic pathway)與內在路徑(intrinsic pathway)兩大類。簡單的說，外在路徑經由配體 4.

(13) (ligand)媒介活化細胞表面之死亡受體(death receptor)進而誘導細胞死亡；內在路徑則因多種細胞內刺激，例如 DNA 損傷、缺氧、細胞毒性藥物(cytotoxic drug)等因素影響粒線體後誘導細胞死亡。外在路徑的傳遞與 caspase-8、caspase-3 等有關。內在路徑的傳遞則與 Bcl-2、Bax、粒線體膜電位、cytochrome c、caspase-9、caspase-3 等有關[8]。另外如活性氧物質(reactive oxygen species, ROS)、內質網壓力(ER stress)導致 Ca2+由內質網釋出等也可經由活化死亡受體或粒線體路徑而誘導細胞凋亡[10][11]。有關凋亡的詳細內容將在隨後各節中敘述。然而在人類的癌細胞中，抗凋亡的機制經常不正常的增加致使癌細胞得以逃脫凋亡性之細胞死亡[12]。研究亦指出，凋亡機制的缺陷不僅可使癌細胞避免被排除，也可能賦予其對化療藥物的抵抗能力，因而調控凋亡路徑可能可以誘導癌細胞死亡，進而在臨床上增加化療藥物的治療效果[8]。中草藥誘發癌細胞凋亡的作用已逐漸受到重視，包括大黃、青蒿、黃連、黃芩、雷公藤、吳茱萸與樹蘭(Aglaia)等多種傳統生藥材，而其誘發癌細胞凋亡的相關機制業已逐漸被闡明[13]。 2.4 細胞凋亡的外在路徑與內在路徑外在路徑(extrinsic pathway)是免疫細胞經由配體媒介活化細胞表面之 death-mediating 受體而誘發不健康(unhealthy)細胞產生細胞凋亡的機制[8]。細胞表面之 death-mediating 受體包括 CD95/Fas/Apo1、 TNF Receptor 1(TNFR1) 、 TNF Receptor 2(TNFR2) 以及 Death Receptors 3-6(DR3-6)等。配體受體的結合可誘導受體的群集作用 (multimerization)，繼而有 FADD 銜接蛋白(adapter protein)的結合，形成 death-induced signaling complex(DISC)並招募 initiator caspase-8 和-9，接著活化 effector caspase-3 和-7，最後在多種細胞質和細胞核基質(substrate)遭到不可逆的切割而達到細胞破壞過程的高潮 [8]. (圖 2.1)。 5.

(14) 另外包括 DNA 損傷、缺氧、細胞剝離(cell detachment)、cellular distress 與具細胞毒性之藥物都可能引起細胞凋亡的內在路徑 (intrinsic pathway). [8]. 。這些來自不同刺激的訊息會匯集到細胞之線. 粒體上，而凋亡訊息的傳遞在此處則是受到 Bcl-2 家族成員的嚴密調控。一部分的 Bcl-2 家族成員，如 Bcl-2 與 Bcl-XL 具有抗凋亡 (anti-apoptotic)的作用；而另一部分的 Bcl-2 家族成員，如 Bid、Bad 與 Bim 則具有促凋亡(pro-apoptotic)的作用。當促凋亡訊息勝過抗凋亡訊息時則將誘發粒腺體外膜滲透性(mitochondrial outermembrane permeabilization, MOMP)，導致粒線體雙層膜間隙的蛋白質，如 cytochrome c 和 Smac/Diablo 等釋出至胞液(cytosol)中[8]。釋出的 cytochrome c 會和 Apaf-1 相互作用導致凋亡小體 (apoptosome)的形成以及 caspase-9 的活化。而 Smac/Diablo 中和細胞凋亡抑制蛋白質(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族則可進一步促進 caspase 的活化。Caspase-9 切割和活化 effector caspases-3 與 -7 而導致細胞死亡[8]。然而外在路徑與內在路徑並非完全獨立的，例如外在路徑過程中之 caspase-8 便可活化粒線體上的 Bid 蛋白[8] (圖 2.1)。. 圖 2.1. 細胞凋亡的外在路徑與內在路徑。摘錄自 Ziegler DS, Kung AL.. Therapeutic targeting of apoptosis pathways in cancer. Curr Opin Oncol. 2008;20(1):97-103 6.

(15) 2.5 Caspase 蛋白質家族 Caspase (cysteine aspartate specific proteases 半胱胺酸天門冬胺酸特異性蛋白酶，又稱凋亡蛋白酶)是一群 cysteine protease 蛋白質家族，其為扮演調節細胞凋亡的重要角色。其中 caspase-8 為活化死亡受體媒介之凋亡路徑的關鍵，caspase-9 為壓力及基因毒性藥物造成的細胞凋亡之關鍵，而 caspase-3 則為凋亡過程中 DNA 及核碎裂過程之關鍵分子[9]。目前已有 11 個人類 caspase 被確認，雖然有許多方式被用來為 caspase 家族分類，但無論如何分類都指出 caspase 家族內其結構與其功能間具有緊密的關聯性。在凋亡的過程中，連貫的執行機制是由許多胞外與胞內的訊息所誘發。因此若從功能性的分類來說，一些 caspase 可連結不同的上游的信息路徑與下游的執行步驟[9]。這些在上游的家族成員被稱為啟動 (initiator) caspases ，啟動 caspases 具有長的前體結構域(prodomains，前域)，據此又可以兩種蛋白質-蛋白質交互作用(protein-protein interaction)結構單位(motifs) 之特徵區分為：具死亡效應區域(death effector domain, DED)，如 caspase-8 和-10；以及具 caspase 活化與募集區域(caspase activation and recruitment domain, CARD)，如 caspase-1、-2、-4、-5、-9、-11 和-12 等。而這結構單位可作為與上游轉接分子(adaptor molecules) 交互作用的基本單位。在啟動 caspases 中，caspase-1、-11 與-5 又可歸屬為可調控細胞凋亡與某些炎症反應的亞綱[9]。另一方面，藉由切斷多種細胞內基質以執行細胞凋亡下游步驟的 caspases 通常需要上游 caspases 的加工與活化。這些下游 caspases 被稱為執行(executioner) caspase，如 caspase-3、-6 與-7，這類 caspase 並以擁有短的 prodomain 為特色[9]。 2.6 粒線體與細胞凋亡粒線體不僅負擔著細胞能量轉化的重責大任，另如同前面所述， 7.

(16) 粒線體亦在細胞凋亡的過程中扮演相當重要的角色。細胞內的調控權藉由許多促凋亡與抗凋亡信息的存在而又彼此競爭。在細胞凋亡內在路徑的過程中，有"pro-life"與"pro-death"的訊息會整合並匯聚在粒線體的外膜上，而粒線體外膜的通透性(permeabilization)則成為不可逆地決定細胞經由內在路徑走向凋亡的關鍵步驟。粒線體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP)可導致 cytochrome c 與 SMAC/Diablo、AIF 等凋亡性蛋白 (apoptogenic proteins) 自粒線體雙層膜間隙釋出至胞液。雖然 cytochrome c 是電子傳遞鏈的關鍵因子，且其作用對於氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation, OXPHOS) 是不可或缺的，然而 cytochrome c 一旦釋出至胞液，其將藉由不可逆地活化一連串 caspase 媒介之細胞破壞進而導致細胞凋亡。Cytochrome c 的大量釋出也終將導致粒線體功能的喪失以及產生生物能量的危機 (bioenergetic crisis)。一旦當足量的粒線體外膜如此被破壞，則細胞的死亡終將不可避免，因此粒線體外膜通透性經常被稱之為“踏上了不歸路(the point of no return)”[14]。在粒線體的過程中，Bcl-2 蛋白質家族則是調節(regulation)和誘導 (induction)粒線體外膜通透性的關鍵角色。Bcl-2 蛋白質家族以具有 Bcl-2 homology (BH) domains 為特徵的蛋白，並可區分為促凋亡與抗凋亡兩大類。而促凋亡 Bcl-2 家族之蛋白質又可再分為兩類：一、 effector proteins，如 BAK 與 BAX 可直接地(actively)誘導粒線體外膜通透性。二、如 BAD、BID 與 BIM 等則經由抑制抗凋亡蛋白或活化 effector Bcl-2 proteins 而間接地促進粒線體外膜通透性。而抗凋亡(或稱 pro-life)Bcl-2 家族蛋白質，如 Bcl-2、Bcl-xL、MCL-1 等則可結合並抑制促凋亡蛋白家族之作用。所以藉由一系列 Bcl-2 家族間複雜的相互作用便可調節粒線體外膜通透性與進行細胞凋亡的誘導[14]。促凋亡分子 BAK 位於粒線體外膜，而另一種促凋亡分子 BAX 在未受刺激的細胞位於胞液中，一旦接受到凋亡信號時 BAX 則會轉移到粒線體之外膜。隨著被活化，BAK 與 BAX 則會插入粒線體外 8.

(17) 膜而促成孔洞的形成。經由此孔洞，cytochrome c 與其他粒線體蛋白將被釋出。被釋放至胞液中之 cytochrome c 會與 Apaf-1 的結合而形成凋亡小體(apoptosome)，而凋亡小體可活化 caspase-9 後繼而造成一連串 caspase 的活化，最終並將邁向細胞死亡。除此之外，因粒線體外膜通透性而釋出的其他蛋白質亦將有助於細胞的死亡[14] 。另外，線粒體功能障礙(dysfunction)參與細胞凋亡之誘導，並且被視為凋亡路徑中的重要角色。事實上，線粒體通透性轉變孔 (mitochondrial permeability transition pore)的打開被證明與粒線體膜電位(transmembrane potential (∆ψm)之去極化(depolarization)、凋亡因子之釋放和氧化磷酸化之損失有關。儘管對於粒線體膜電位下降 (loss)是否為細胞凋亡過程中的早期事件，進而促使凋亡因子釋出的先後關係有些爭議，但粒線體膜電位下降無疑仍與細胞凋亡有密切之關係[15]。 2.7 內質網與細胞凋亡內質網(endoplasmic reticulum, ER)是細胞內進行蛋白質合成、摺疊，以及儲存鈣離子的重要胞器。然而當與內質網摺疊能力有關的內質網受質蛋白(ER client protein)負荷過重時，將可能造成內質網中堆積摺疊錯誤的(misfolded)蛋白質，這便導致了內質網壓力(ER stress)。為了克服內質網壓力，便須活化許多可協調受質蛋白量與內質網摺疊機制的路徑，例如未折疊蛋白質反應(unfolded protein response, UPR) 便能促進對內質網壓力的適應性反應 (apaptative response)以及重新達到內質網的衡定狀態。然而雖然 UPR 可緩解摺疊錯誤蛋白質的堆積以及內質網壓力，但當 UPR 仍不足對抗內質網壓力時，內質網內摺疊錯誤蛋白質的堆積將導致毒性反應而最終造成細胞之死亡。其中，細胞凋亡是內質網壓力的情況下誘導細胞死亡的重要機制[10]。目前所知內質網壓力誘導細胞凋亡的機制有四：一、由依賴 Ca2+ 9.

(18) 之鈣蛋白酶(calpain)直接活化的 caspase-12 可活化 capsase-9 與 caspase-3。二、由內質網釋出之 Ca2+使得粒線體的 Ca2+過量將導致粒線體中的 cytochrome c 等促凋亡分子的釋出。三、藉 PERK/eIF2α/ATF4 活化之 CHOP 將導致促凋亡蛋白的表現增加、抗凋亡蛋白質 Bcl-2 家族成員的表現降低。四、由 IRE1/Traf2/ASK2 活化的 JNK 訊息可誘發凋亡路徑[10]。 2.8 其他細胞凋亡的相關機制研究指出，鈣離子因凋亡刺激湧入細胞中，而當細胞內鈣離子濃度長時間的增加時，將活化粒線體雙層膜間隙的鈣蛋白酶(calpain) ，並進而導致 AIF 的形成。AIF 的切割片段可經由 Bax/Bak 媒介的孔洞釋出至胞液後再進入細胞核中參與染色質濃縮及大規模的 DNA 碎裂[16]。粒線體是細胞活性氧物質(O2·-, H2O2 等)最主要的來源。其中 H2O2 誘導細胞凋亡的機制被認為是增加 Fas-FasL 系統的表現，進而導致 caspase-8 及其下游 caspases 的活化。此外，活性氧物質造成的 DNA 損傷可導致 p53 的活化與 p53 媒介之細胞凋亡。活性氧物質亦可活化 ASK1/JNK 激酶(kinase)信息路徑而誘導外在與內在之凋亡路徑。活性氧物質也能參與並打開與粒線體膜通透性有關之粒線體過渡性通透孔(mitochondria permeability transition pore, MPTP)複合體，繼而可能有助於細胞之凋亡與壞死。活性氧物質可藉由氧化粒線體內膜脂質 cardiolipin 而促進 cytochrome c 釋出 [14] 。在胞液中 cytochrome c 與 Apaf-1 的結合是形成凋亡小體的關鍵步驟。凋亡小體複合體可繼而活化 caspase-8 與 caspase-3。H2O2 也可以活化 NFκB、 AP-1 和 p53 等轉錄因子(nuclear transcription factors)，它們可促進 death proteins 的表現或產生 survival proteins 的抑制分子。細胞對抗活性氧物質的重要分子則包括 GSH 以及 SOD[17]。如同前面所述，促凋亡蛋白的釋放也是凋亡訊息的重要步驟，例如 cytochrome c、細胞凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor, AIF)、 10.

(19) Smac/DIABLO 以及 Omi/HtrA2 等自粒線體雙層膜間隙釋出。而這些釋出的蛋白將經由活化 caspase 依賴與非 caspase 依賴之路徑而促進細胞凋亡。其一，caspase 依賴路徑由 cytochrome c 與 Apaf-1、dATP、 procaspase-9 等於胞液中形成 apoptosome complex 開始，進一步自我活化 procaspase-9 並引發下游的 caspase cascade。而相對的，AIF 與內核酸酵素 G(endonuclease G, Endo G)等則為非 caspase 依賴路徑之 death effector，當其釋出後可進入細胞核中參與染色質濃縮與大規模的 DNA 碎裂[16][18]。 2.9 腫瘤轉移倘若腫瘤的位置侷限且體積不大，則其對宿主而言威脅性並不大，因此此類腫瘤被稱為良性(benign)腫瘤。但相反地，惡性(malignant) 腫瘤，或稱為癌症(cancer)者，通常在生長與分裂方面都較正常細胞為快，並隨著腫瘤演進更會侵入周圍組織、進入循環系統，甚至建立第二個增生的區域，此過程便稱之為轉移(metastasis)。大部分的惡性腫瘤細胞最終會有轉移的能力，因此要區分惡性或良性腫瘤的主要特徵便是其侵入(invasiveness)和散布(spread)的能力[19]。正常的細胞是以其附著之基底板(basal lamina)來限制它們得侷限於原本的位置，然而癌細胞與細胞外基質與基底板間卻擁有複雜的關聯性。癌細胞可降解基底板後得以穿透並進性轉移。而轉移的過程除了自原始腫瘤脫離並進入血流之外，散播出的腫瘤細胞亦須附著到血管內壁的內皮細胞上，穿透它而進入下層的組織之中[19]。根據統計，大約有 20%的大腸直腸癌患者被診斷出伴隨有癌細胞轉移。另外早期(early stage)大腸直腸癌患者亦高達有 50%最終會發生癌細胞轉移，而發生轉移的患者其五年存活率僅約 10%[20]。 2.10 腫瘤轉移與相關機轉轉移的過程(metastatic cascade)是一系列分子步驟所精心策劃，它 11.

(20) 策劃發展中細胞通過進行侵犯 (facilitate invasion) 與隨後轉移 (subsequent metastases)的一連串轉變而由原位腫瘤取得進展。步驟包括上皮細胞轉型成間質細胞 (epithelial-mesenchymaltransition, EMT)，伴隨基底膜(BM)與細胞外基質(ECM)的蛋白質水解；藉由改變黏附特性(adhesive properties)與抑制失巢凋亡(anoikis, 即因不當失去細胞黏附而造成的細胞凋亡)，腫瘤細胞可自大腫塊(bulk tumor)處分離；局部浸潤(local invasion)與細胞遷移(migration)；血管新生與內滲 (intravasation) ；可行的血管傳播伴隨免疫逃避 (immune evasion) ；自血管外滲 (extravasation) ；建立遠處栓塊 (embolization)的並在第二位置生存下來；最終完成一個微觀(micro) 與宏觀(macro)的轉移結果[21]。惡性腫瘤細胞為了達成成功的轉移，上述每個步驟都有許多必須被克服的障礙[21]，其中 MMPs 便是一個相當重要且被受重視的環節。科學界對於 MMP 家族的認識始於對蝌蚪脫去牠的尾巴之研究，接著因膠原蛋白(collagens)被視為阻礙腫瘤細胞轉移的主要結構蛋白後，MMPs 也被認定為在促進癌細胞散播(dissemination)的過程中扮演膠原蛋白分解酵素(collagenolytic enzymes)之重要角色[22]。 MMP 家族是由一群超過 25 個具有相同功能區域之鋅依賴酵素 (zinc-dependent enzymes)所組成。它們可依據其對應之受質所命名，也可以其被發現之順序來命名。整體而言，MMPs 幾乎可降解所有的 ECM 物質，例如 collagens、laminin、fibronectin、vitronectin、 enactin 與 proteoglycans 等。在癌症方面特別重視可被 MMP-2 與 MMP-9 降解的 type IV collagen，因為其為基底膜的主要蛋白成分。有些研究指出，被 MMP-2 與 MMP-9 降解的 type IV collagen 可能會增強血管新生(angiogenesis)作用[22]。 MMPs 在大腸直腸癌方面被廣泛研究，並被認為對於轉移過程 (metastatic process)中的侵犯環節(invasive aspects)是相當重要的。其中 ProMMP-2 在正常細胞中廣泛地被表現；相對地，活性的 MMP-2 則在腫瘤細胞中顯著增加，卻在大部分正常組織中缺乏。研究指出，在大腸癌檢體中活性 MMP-2/proMMP-2 的比例高於非腫瘤組織 12.

(21) 達 20 倍。另有研究指出，增高的 MMP-2 與大腸癌發生肝轉移有關 [22]. 。而臨床統計方面，MMP-2 之表現的確與大腸直腸癌患者有較. 差之整體存活期(overall survival)與無惡化存活期(progression-free survival)有關[23]。而 MMP-9 的過度表達亦與大腸癌細胞的同時發生轉移(synchronous metastasis)有關，與疾病的進展有關，也可能與較短的存活率有關[22][24]。有關癌細胞轉移與侵犯的機轉相當複雜，除 MMPs 之外，許多訊息路徑如 Rho/ROCK、Ras/MAPK 與 PI3K/AKT 等都與其有關。例如 PI3K 信息路徑在癌細胞增殖、生存、代謝、移動與侵犯中扮演一個重要的角色[25]。近來的研究認為 MMPs 與大腸直腸的致腫瘤性 (tumorigenicity)和 metastagenicity 有關，而 PI3K/Akt 媒介的侵犯行為便可能與增加 MMP-2 與 MMP-9 的表現有關[25]。另外，腫瘤細胞的遷移(migration)是轉移的重要步驟，而肌動蛋白細胞骨架(actin cytoskeleton)的重排(rearrangement)便牽涉其中。研究發現 Rho 的過度表達與人類癌症的進展有關，其原因可能便是 Rho/ROCK 路徑的活化藉由調節肌動蛋白細胞骨架的重組(reorganization)而介入腫瘤的進展，且特異性的 ROCK 抑制劑也確實可以抑制腫瘤的生長與轉移[26]。其它研究發現如 NF-κB 路徑等也是媒介癌細胞增殖、侵犯、血管增生與轉移的主要過程(cascade)[27]。而前列腺癌的研究指出， Raf/MEK/ERK 信息路徑活性的增強被認為與轉移的增加有關[28]。 2.11 大腸癌的中醫觀點大腸癌是個恆久的疾病，早在《靈樞》水脹篇中便有「寒氣客于腸外，與衛氣相搏，氣不得營，因有所繫癖而內著，惡氣乃起，瘜肉乃生，其始生也大如雞卵，稍以益大[29]」的描述，另於《外科達成》亦記載「鎖肛痔，肛門內外猶如竹節鎖緊，形如海蛇，裡急後重，便糞細而帶扁，時流臭水」[30]等與大腸直腸癌有關之敘述。但因文化背景的不同，傳統中醫不同於現代西方醫學對大腸癌的認知與描述，其對大腸直腸癌的認識應分屬於不同之病名、症狀與證型 13.

(22) 。例如有些學者以病名"腸覃"、"積聚"、"臟毒"、"鎖肛痔"、"腸風"、 "下痢"與"腸癖"等為傳統中醫對大腸癌之認識[4]。另有學者認為《金匱要略》對與大腸癌有關的論述分別散見於“臟腑經絡先後病篇”、 “血痹虛勞病篇”、“腹滿寒疝宿食病篇”、“五臟風寒積聚病篇”、“驚悸吐衄下血胸滿瘀血病篇”及“嘔吐噦下利病篇”等篇。其描述之大腸癌相關症狀包括下血、下利便膿血、腹滿、腹痛等，而可運用之治療方劑則可有大柴胡湯、大承氣湯、下瘀血湯、抵當湯等 [31] 。另有些學者從臨床症狀表現頻率經統計分析出腹痛 (48.8%)、納呆(41.0%)、腹瀉(36.4%)、腹滿(34.9%)、大便膿血(33.3%)、嘔吐(31.0%)、噁心(30.2%)、大便下血(27.9%)、大便秘結(25.6%)、裡急後重(19.4%)、局部腫塊(17.1%)、腹部脹墜(14.7%)、大便艱難 (4.6%)等為大腸癌患者常見之中醫臨床徵候[32]。如同前面所述，由於中西醫學觀點不同，因此中醫治療大腸直腸癌並不能以單一病因病機來考慮，使用之治療方劑當然也不盡相同。許多醫師臨床上將大腸癌區分為濕熱蘊結、瘀毒內阻、脾腎虧虛、肝腎陰虛等中醫證型[33]。其病因多屬本虛標實、虛實夾雜，而治法則多以扶正及祛邪為基本的治療原則[34][35]。雖然臨床醫師對於各證型的治療思路與方劑不盡相同，然而大腸直腸癌的主要臨床症狀仍為便秘、大便秘結、腹痛、腹滿、嘔吐、下膿血等腸道症狀，因而在中醫相對應的治療處方中便多有大黃之運用。例如治療陽明腑實便秘與腹痛的大承氣湯；治療太陰病腹滿大實痛之桂枝加大黃湯；治療腹滿發熱的厚朴七物湯；治療食已即吐之大黃甘草湯；治療腸癰腹腫痛的大黃牡丹湯等，都可能運用在大腸直腸癌的病例上。 2.12 大黃與大腸癌的中醫論治大黃為傳統中醫藥治療腸道疾患之重要藥物，除了做為緩解便秘的瀉下劑外，亦可用於治療黃膽、消化道出血、潰瘍等病症[13]。消化道症狀為大腸癌之主要臨床表現，很多病人在被診斷出大腸癌前已有大便習慣改變、或溏或秘、便下不暢、粘滯難解或肛門墜脹不 14.

(23) 適與出血等症狀[29]。因此許多運用方劑組成便含有大黃，經統計，大黃也是中醫臨床治療大腸癌的常用藥物之一[36]，甚至在臨床上也有大黃相關製劑灌腸治療而改善大腸癌相關症狀的作法[34]。因此大黃於傳統中醫藥治療大腸癌與其相關症狀上可說佔有相當重要的角色。傳統中醫藥之大黃來源植物為蓼科多年生草本植物掌葉大黃(北大黃)Rheum p almatum L.、唐古特大黃 R. tanguticum Maxim. ex Balf.、藥用大黃(南大黃)R. officinale Baill.或同屬別種植物的乾燥根和根莖[37][38]。《神農本草經》曰：「大黃味苦寒有毒。主下瘀血，血閉，寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水穀，調中化食，安和五臟。生山谷」[39]。《本草綱目》曰：「大黃苦，寒，無毒。下痢赤白，裡急腹痛，小便淋瀝，實熱燥結，潮熱譫語，黃膽諸火瘡」[40]。《本草備要》曰：「大苦大寒，治傷寒時疾，發熱譫語，溫熱瘴瘧，下痢赤白，腹痛裏急。黃膽水腫，癥瘕積聚，留飲宿食，心腹痞滿，二便不通。吐血衄血，血閉血枯，損傷積血，一切實熱，血中伏火」[41]。《本草正義》謂其：「迅速善走，直達下焦，深入血分，無堅不破，蕩滌積垢，有犁庭掃穴之功」[29]。含大黃之方劑雖然作用不一，但仍與蕩滌腸胃、推陳致新有關。例如可下瘀血者，桃仁承氣湯、抵當湯丸、下瘀血湯；可推宿食者，厚朴三物湯、厚朴大黃湯；除血閉寒熱者，柴胡加龍骨牡蠣湯、鱉甲煎丸；破癥堅積聚者，大黃蟅蟲丸、大黃牡丹皮湯；主去留飲者，大陷胸湯丸、已椒藶黃丸、大黃甘遂湯、桂苓五味甘草加薑辛半夏大黃湯。由此可知，大黃藥性迅速，且在中醫藥中相當重要且運用範圍十分廣泛，故宿有「將軍」之美稱，但其啟脾滯、通閉塞、盪積聚、行火用[42]，故治療腸道疾患仍是大黃主要之運用範疇，故多被歷代醫家歸入為脾、胃、肝、大腸經。. 15.

(24) 2.13 大黃的毒性與安全性雖然有過一些爭論，但動物研究顯示，連續三週口服相當於藥典建議人體劑量最高劑量之 6 倍與 40 倍的大黃(大鼠劑量每天每公斤體重 3、20g 大黃)後，雖然可能發生以劑量相關之關係最小(minimal) 至輕微(mild)的肝組織變化(hepatic hyaline droplets)，但服藥大鼠之存活率與腎組織切片仍與不服藥對照組相同。相反地研究亦發現，口服與前述相同的劑量卻可明顯增加以 adenine 誘發慢性腎病變造模大鼠的存活率，並改善其腎臟組織之病變[43]。類似的研究也指出，就算口服劑量每天每公斤體重高達 40g 之大黃亦不會影響年幼(immature)大鼠的存活率，僅在相同高劑量下降低年老大鼠之存活率[44]。這些研究資料為大黃臨床使用的安全性提供了一部份依據。 2.14 大黃的重要成分現代研究多認為大黃的活性成分主要為蒽醌(anthraquinone)類化合物，包括大黃素(Emodin)(圖 2.2)、蘆薈大黃素(Aloe-emodin)、大黃酸(Rhein)、大黃酚(Chrysophanol)與丹蒽醌(Danthron)等[13][45]。此外亦含有聯蒽醌類(dianthraquinones)、番瀉葉苷類(sennosides)、萘類(naphthalins)、二苯乙烯類(stilbenes)、單寧類(tannins)、類黃酮類 (flavonoids)和多酚類(polyphenols)等衍生物[45]。. 圖 2.2 大黃素的結構式. 16.

(25) 2.15 大黃素的現代研究大黃素 (Emodine, 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)是大黃的重要成分，相關研究指出其作用包括有瀉下、抗菌(antibacterial)、免疫抑制 (immunosuppressive) 、血管舒張 (vasorelaxent) 、強心 (cardiotonic)、保肝與抗癌等作用[45]。關於大黃素之抗癌作用逐漸受到研究人員所重視，一般認為大黃素因其醌型結構(quinoid structure)而具有產生活性氧物質(ROS)的能力，也因而與活性氧物質誘導之細胞凋亡有關[13]。例如在體外試驗中大黃素可增加活性氧物質產生、降低細胞內 pH 值，進而促進 EC-109 人類食道癌細胞株之凋亡[46]。亦可經由內在路徑促使 HepG2 人類肝癌細胞株粒線體釋放 cytochrome c、活化 caspase-8 和-9，也能造成活性氧物質堆積、增加 p53 表現、降低 NF-κB/p65 與 Bcl-2 表現，進而誘導 HepG2 細胞株凋亡 [47] 。大黃素可經由降低 NF-κB/p65 與 Bcl-2 表現，增加 Bax、caspase-8 和-9、p53 表現，增加細胞質 cytochrome c，進而促進 SW1990/Gem 胰臟癌細胞株凋亡，並可能因降低 MDR-1(P-gp)表現而改變 SW1990/Gem 癌細胞株對抗癌藥物 gemcitabine 的抗藥性[48]。大黃素亦可經由抑制 CXCR4 的表現而抑制前列腺癌與肺癌細胞的侵犯 (invasion) 與轉移 (migration)[49]。體內試驗方面，大黃素可經由減少 Survivn 與 XIAP 之蛋白質及 mRNA 表現，進而減少 PANC-1 人類胰臟癌細胞株異體移植之腫瘤體積與重量[50]。大黃素也可能經由抑制 Akt 與 NF-κB 的活化、降低 Bcl-2/Bax 比率、促進粒線體釋放 cytochrome c 等，進而增強 gemcitabine 抑制異體移植 SW1990 胰臟癌細胞株生長的作用[51][52] 。也可能經由降低 MMP-9 等表現進而抑制 SW1990 胰臟癌細胞株異體移植後的轉移能力[53]。大黃素也可能經由降低 survivin 表現、產生 ROS 等而加強 cisplatin 對異體移植 SGC996 人類膽囊癌細胞株的抑制作用[54]。綜觀相關研究發現，大黃素對於舌癌細胞[55]、食道癌細胞[46]、胰 17.

(26) 臟癌細胞[48][51][52][53]、膽囊癌細胞[54][56]、肝癌細胞[47][57] 、慢性骨髓性白血病[58]、非小細胞肺癌細胞[59]、肺腺癌細胞[60]、神經膠質瘤細胞[61]與前列腺癌細胞[49][62]等許多腫瘤細胞分別具有抑制增殖、促進凋亡、防止轉移或加強化療效果等作用。然而目前的研究成果對於中草藥大黃及其主成分大黃素對於大腸癌細胞的作用與機轉尚不清楚，因此本研究藉由生藥萃取、細胞型態觀察、流式細胞儀、DAPI 染色、西方墨點染色、real-time PCR、傷痕癒合試驗等技術，以體外試驗方式評估與探討生藥大黃粗萃物 (Crude extract of Rheum palmatum L, CERP)對於 LS1034 人類大腸癌細胞株之影響，以及大黃主成分大黃素對於 LS1034 細胞株之作用與相關機轉。並藉由異體轉殖動物造模來評估大黃素對於 LS1034 細胞株體內試驗之結果。. 18.

(27) 第三章材料與方法. 3.1 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉 3.1.1 大黃粗萃物之抽提製備取生藥材 100 克置於三角瓶中，加入 500 mL 去離子水。時時震搖同時抽氣過濾，並於靜置 24 小時後收集萃取液。將藥材再置於三角瓶中，加入 500 mL 去離子水，時時震搖與靜置 24 小時後合併兩次濾液，以減壓濃縮至乾為止。 3.1.2 大黃粗萃物之 Emodin 定量 3.1.2.1 儀器：高效液相層析儀(High performance liquid chromatography, HPLC)： (1) 幫浦： Waters 2695 Separations Module ； (2) 自動注入器： Autosampler 717+；(3)檢測器：Waters 2996 Photodiode Array Detector； (4)分析軟體：Waters Empower software；(5)層析柱：MERCK 公司 LiChroCART®254-4 HPLC- Cartridge Lichrospher 100 RP-18 (5 µm) 。前端加上管柱(MERCK 公司 LiChroCART®4-4 Lichrospher 100 RP-18 (5 µm)，以濾除雜質。 3.1.2.2 試驗方法： 1. 標準品之製備. 19.

(28) 稱取 1 mg emodin 之標準品，分別溶於 1 mL 甲醇中，以 0.45 µm (Nalgene®, New York, USA)濾膜過濾，為含量 1 mg/mL 之母液，供 HPLC 偵測 emodin 定性定量之用。 2. 檢品之製備材料稱取 100 mg 以 1 mL 甲醇經溶解後，並以 0.45 µm 濾膜過濾，供 HPLC 檢測 emodin 之含量。 3. 高效液相層析法 (1) 分析條件在以乙腈(acetonitrile)：0.1% 醋酸(acetic acid) = 60 : 40 固定比例為流動相，柱溫 25℃流速為 1 mL/min，檢測時間為 30 min，檢測波長為 254 nm。 (2) 檢量線之繪製取 emodin 之標準品，以濃度 1 mg/mL 作為稀釋母液，再分別稀釋成母液的 1、1/2、1/4、1/8、1/16 及 1/32 倍等 6 個濃度之標準品溶液，各以 0.45 µm 之微孔膜過濾，濾液用 autosampler 每次自動定量注射 10 µL 注入 HPLC 分析，每個濃度處理重複 3 次注射，將 3 次總和平均。以濃度及積分面積各為橫座標和縱座標，利用線性迴歸分析獲得方程式，製成標準檢量線。其迴歸方程式如下： emodin：Y= 44876868X+380788. 20. R2 = 0.99944.

(29) 3.1.3 試劑試劑品名與廠商品名. 廠商. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Sigma Chemical Co. potassium phosphates. Sigma Chemical Co. propidium iodide (PI). Sigma Chemical Co. ribonuclease-A (RNase A). Sigma Chemical Co. trypan blue. Sigma Chemical Co. Tris-HCl. Sigma Chemical Co. RPMI 1640 medium. Gibco BRL. fetal bovine serum. Gibco BRL. L-glutamine. Gibco BRL. penicillin-streptomycin. Gibco BRL. trypsin-EDTA. Gibco BRL. CaspaLux-L1D2. OncoImmunin, Inc.. CaspaLux-M1D2. OncoImmunin. PhiPhiLux-G1D1. OncoImmunin. 3.1.4 細胞培養人類大腸腺癌(human colon adenocarcinoma)細胞株 LS1034 購自臺灣新竹財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute)。其培養基為添加 2 mM L-glutamine、10% FBS、 100 Units/ml penicillin 與 100 lmg/ml streptomycin 之 RPMI 1640 培養基。將細胞置於 75 cm2 細胞培養瓶(tissue culture flasks)中，並於 37℃、 5% CO2、濕度 95%的培養箱中培養[63]。. 21.

(30) 3.1.5 流式細胞儀測定細胞存活率將 LS1034 細胞株以每 well 2*105 cells 種植於 12-well plate 培養 24 小時，隨後分別加入不同濃度(0, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 與 2500 µg/ml) 之大黃粗萃物與 1%DMSO(溶劑)的對照組，接著將細胞置於 37 ℃、5% CO2 與 95%空氣的環境下 48 小時。以 phosphate-buffered saline (PBS)清洗二次，再使懸浮於含 PI (5 µg/ml) 之 PBS 。接著細胞以 PI exclusion method 和流式細胞儀 (Becton-Dickinson, FACSCalibur, San Jose, CA, USA)測定存活率[64] 。 3.1.6 流式細胞儀測定細胞週期分布將 LS1034 細胞株以 2*105 cells/well 密度種植於 12-well plate，加入不同濃度(0, 250, 500, 750, 1000, 1500 與 2000 µg/ml)之大黃萃取液後培養 24 小時。隨後細胞以冷的 phosphate-buffered saline (PBS) 清洗、70% ethanol 固定，並於 4℃靜置隔夜。細胞以 PBS 清洗後加入 RNase A (200 µg/mL)後於 4℃下靜置 15 分鐘，接著以 PI (20 µg/mL)和 0.1% Triton X-100 染色並遮光 30 分鐘。最後利用 FACScan 流式細胞儀將待測細胞以 sub-G1、G0/G1、S 與 G2/ M 週期狀態來區分[65]。 3.1.7 彗星試驗與 DAPI 染色將 LS1034 細胞株以 2*105 cells/well 密度種植於 12-well plate，加入不同濃度(0, 500, 750, 1000 與 2000 µg/ml)之大黃萃取液後培養 24 小時。以 4 µM hydrogen peroxide (H2O2)作為對照組(positive control) 。接下來待測細胞以 PI 染色進行彗星試驗(Comet assay)，而以 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)進行 DAPI 染色，最後皆以螢光顯微鏡技術(fluorescence microscopy)拍攝[65]。彗星試驗可用來測定 22.

(31) 待測細胞 DNA 之損傷程度，而 DAPI 染色則可做為細胞核濃縮 (nuclear condensation)與斷裂(fragmentation)的依據。 3.1.8 測定流式細胞儀細胞內鈣離子濃度將 LS1034 細胞株以 2*105 cells/well 密度種植於 12-well plate，12 小時後投與 0 或 750 µg/ml 之大黃萃取液後分別培養不同時間週期。待測細胞 trypsinized 後經離心收集並以 PBS 清洗兩次，分別再懸浮於 500 µl 500 µl Fluo-3/AM (2.5 µg/ml)中以進行細胞內鈣離子濃度之測定，懸浮 30 分鐘後再以細胞流式儀進行分析測定[66]。 3.1.9 流式細胞儀測定 Caspase-3、caspase-8 與 caspase-9 之活性將 LS1034 細胞株以 2*105 cells/well 之密度種植於 12-well plate 中 24 小時，預先給與 caspase-3, caspase-8 和 caspase-9 之抑制劑後，投與 0 和 750 µg/ml 之大黃萃取液分別培養 0、24 與 48 小時。收集待測細胞後以 PBS 清洗兩次，接著將待測細胞再懸浮於以 50 µl、濃度 10 µM 之 PhiPhiLux-G1D1、CaspaLux-L1D2 與 CaspaLux-M1D2 分別作為 caspase-3、caspase-8 和 caspase-9 之 substrate solution 中，於 37℃環境下培養 60 分鐘。隨後以 PBS 清洗待測細胞樣品後，再以流式細胞儀分別測定其 caspase-3、caspase-8 和 caspase-9 之活性[66] 。 3.1.10 雷射共軛焦顯微鏡測定 LS1034 細胞株之蛋白質轉運將 LS1034 細胞株以 2*105 cells/well 之密度種植於 4-well 之細胞培養玻片(Chamber slides)中，並分別給與 0 或 10 µg/ml 之大黃萃取液後培養。24 小時後以溶於 PBS 中、濃度 4 %之甲醛(Formaldehyde) 固定 15 分鐘，再以溶於 PBS 中、濃度 0.3 %之 Triton-X 100 滲透 (permeabilized) 1 小時。接著以 2 %之 BSA 阻斷非特異性結合部位 23.

(32) (non-specific binding sites)，最後給與具有綠色螢光之 AIF、Endo G、 cytochrome c 或 GADD153 等初級抗體後靜置隔夜。隔夜後以 PBS 清洗待測細胞兩次，隨後再給與次級抗體(FITC-conjugated goat anti-mouse IgG)、具紅色螢光之粒線體專一性辨認染劑(Mito Tracker) 以進行 nuclein examination。最後利用 Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope 對待測細胞檢體進行檢測與顯微攝影 (photomicrograph)，以測定 LS1034 細胞株之蛋白質轉運(protein translocation)。 3.1.11 西方墨點法測定 LS1034 細胞株之細胞週期與凋亡相關蛋白質的表現將 LS1034 細胞株以 5*106 cells/well 之密度種植於 6-well plate 中，給與 750 µg/ml 之大黃萃取液後分別培養不同之時間(0, 6, 12, 24 與 48 小時)。接著再分別將待測細胞置於含有 40mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM EDTA、120mM NaCl、1 mM dithiothreitol、0.1% Nonide P-40 A 30 µg 之溶解液(lysis buffer)中。將待測細胞檢體之蛋白質置於 10% Tris-glycine-SDS-polyacrylamide 的膠體上進行西方墨點法，並以電泳點漬法 (electro-blotting)將蛋白質轉移至硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane)上。接著分別給予各種蛋白質之初級抗體，隨後再給與次級抗體結合以進行增強行化學發光法(enhanced chemiluminescence) (NEN Life Science Products, Inc, Boston, MA, USA)。本測定以 Anti-β-actin 作為 loading control。 3.1.12 統計方法所有研究皆進行三重複試驗，試驗結果以平均值 ± 標準差呈現。統計方式以 Student's t-test 進行統計分析，統計結果並以 p<0.05 設為具統計意義。 24.

(33) 3.2 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉 3.2.1 試劑試劑品名與廠商品名. 廠商. Emodin、propidium iodide (PI). Sigma-Aldrich Corp. Triton X-100、dimethyl sulfoxide (DMSO). Sigma-Aldrich Corp. N-acetylcysteine (NAC)和 trypan blue. Sigma-Aldrich Corp. RPMI 1640 medium. Gibco/Life Technologies. fetal bovine serum (FBS). Gibco/Life Technologies. L-glutamine penicillin-strptomycin. Gibco/Life Technologies. Trypsin-EDTA. Gibco/Life Technologies. Caspase-3 activity assay kits. OncoImmunin, Inc.. Caspase-8 activity assay kits. OncoImmunin, Inc.. Caspase-9 activity assay kits. OncoImmunin, Inc.. Caspase-3 inhibitor (Z-DEVD-FMK). R&D systems. caspase-9 inhibitor (Z-LEHD-FMK). R&D systems. Caspase-9 antibodies. Cell Signaling Technology. cytochrome c antibodies. Cell Signaling Technology. Bax. Santa Cruz, CA, USA. Bcl-2. Santa Cruz, CA, USA. AIF. Santa Cruz, CA, USA. b-actin. Santa Cruz, CA, USA. complex IV antibodies. Santa Cruz, CA, USA. Secondary antibodies conjugated with HRP. GE Healthcare. 25.

(34) 3.2.2 細胞培養人類大腸腺癌細胞株 LS1034 購自臺灣新竹財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute)。並於 37 ℃、潮濕、5% CO2 的環境下，將細胞置於 75 cm2 細胞培養瓶(tissue culture flasks)中，以添加 2 mM L-glutamine、10% FBS、100 Units/ml penicillin 與 100 µmg/ml streptomycin 之 RPMI 1640 培養基培養。 3.2.3 型態改變將 LS1034 細胞株以每 well 2*105 cells 種植於 12-well plate 培養 24 小時，隨後分別加入不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大黃素與 1% DMSO(溶劑)的對照組，接著將細胞置於 37℃、5% CO2 與 95% 空氣的環境下 24 或 48 小時，最後以位相差顯微鏡(phase contrast microscope)於 200 倍視野下觀察細胞並拍攝之。 3.2.4 流式細胞儀測定細胞存活率將 LS1034 細胞株以 2*105 cells/well 之密度種植於 12-well plate 培養 24 小時，隨後分別加入不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大黃素與 1%DMSO(溶劑)的對照組，接著將細胞置於 37 ℃、5% CO2 與 95%空氣的環境下 24 或 48 小時。以 phosphate-buffered saline(PBS) 清洗二次，再使懸浮於含 PI(5 µg/ml)之 PBS。接著細胞以 PI exclusion method 和流式細胞儀測(Becton-Dickinson, FACSCalibur, San Jose, CA, USA) 定存活率。另外細胞先以活性氧化清除劑 (ROS scavenger)( NAC, 10 mM)處置 2 小時後再給予大黃素 24 小時，接下來再依上述方法收集細胞並測量其存活率。. 26.

(35) 3.2.5 DNA content 測定與 sub-G1(Apoptosis)測定每 well 2*105 cells LS1034 細胞株種植於 12-well plate 不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大黃素培養 24 小時與 48 小時，細胞 trypanized 後離心收集、PBS 清洗、以 70%之乙醇固定，並於-20℃ 下放置隔夜。細胞再懸浮於含 40 µg/ml PBS、0.1 mg/ml RNase A 和 0.1% Triton X-100 之 PBS 中，並於 37℃的暗房中靜置 30 分鐘後再以流式細胞儀測定分析。cell cycle distribution 與 sub-G1 group(凋亡) 的測定方法如同先前所敘述[67]。 3.2.6 DAPI 染色每 well 1*105 cells LS1034 細胞株種植於 6-well plate，24 小時後分別加入不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大黃素培養 24 小時。依不同濃度收取細胞，加 3% Formaldehyde (PBS)於 4℃冰箱固定 10~15 分鐘，加入 PBS 洗二次，加入 0.1 % Triton X-100 / in 1 ml PBS 15 分鐘，再用 PBS 洗二次，加入 DAPI 染液 (1 µg/ml)在 37℃ incubator 避光 30 分鐘，再用 PBS 洗三次後再以螢光顯微鏡於 F 200X 倍率下觀察與拍攝。 3.2.7 活性氧物質、粒線體膜電位與鈣離子濃度測定將 LS1034 細胞株以每 well 2*105 cells 種植於 12-well plate 後，加入 0 或 30 µM 大黃素後分別等待不同時間(1, 3, 6, 12 和 24 小時)以測定其 ROS、粒線體膜電位與鈣離子濃度。細胞收集後於 500 µl DCFH-DA (Molecular Probes/Life Technologies, Eugene, OR, USA) (10 µM)再懸浮以測定 ROS，和於 500 µl rhodamine 123 (1 µg/ml) (Molecular Probes)以測定粒線體膜電位，以及 500 µl Fluo-3/AM (2.5 µg /ml, Molecular Probes)以測定鈣離子濃度。細胞於 37℃培育 30 分鐘，並以流式細胞儀測定分析。 27.

(36) 3.2.8 流式細胞儀與特異性抑制劑測定 Caspase-3 和 Caspase-9 之活性預先以 caspase-3 抑制劑 Z-DEVD-FMK 和 caspase-9 抑制劑 Z-LEHD-FMK 處理 2 小時後，將處理或未處理過之 LS1034 細胞株以每 well 2*105 cells 之密度種植於 12-well plate。投與 30 µg/ml 大黃素後分別等待不同時間(0, 24 和 48 小時)，最後經不同處治之所有待測細胞經 trypsinized 與離心後收集並以 PBS 清洗兩次。接著將待測細胞再懸浮於以 50 µl、濃度 10 µM 之 PhiPhiLux-G1D1 與 CaspaLux9-M1D2 分別作為 caspase-3 和 caspase-9 之 substrate solution (OncoImmunin, Inc.)中。接著於 37℃環境下培養 60 分鐘，隨後以 PBS 清洗待測細胞樣品後，再以流式細胞儀分別測定其 caspase-3 和 caspase-9 之活性。 3.2.9 西方墨點法測定 LS1034 細胞株凋亡相關蛋白質之表現將 LS1034 細胞株以 5*105 cells/well 之密度種植於 12-well plate 中，給與 30 µg/ml 之大黃素後分別培養不同之時間(0, 6, 12, 18 與 24 小時)。隨後待測細胞經 trypsinized 與收集後溶解(lysed)於 PRO-PREPTM protein extraction solution (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Gyeonggi-Do, Korea)中。細胞裂解液(lysates)(40 µg of each) 以 polyacrylamide gel 之 SDS-PAGE 分離，並電轉移 (electrotransfer)至 PVDF membrane (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA, USA)上。分別給予各種蛋白質之初級抗體(1:1000 dilutions in blocking buffer)後於 4℃環境下靜置隔夜。清洗後給與以 1:20,000 比例稀釋於 blocking buffer 中、標定 horseradish peroxidase (HRP)之次級抗體，並於室溫中靜置 1 小時。HRP-conjugated goat anti-rabbit 或 anti-mouse IgG (GE Healthcare,Piscataway, NJ, USA)作為次級抗體以進行增強行化學發光法(enhanced chemiluminescence) (ECL Kit, Millipore, Billerica, MA, USA)[67]。細胞質與粒線體之 cytochrome c 的測定方法乃依據製造商的操作手冊 (Mitochondria/Cytosol 28.

(37) Fractionation Kit, BioVision, Inc., Mountain View, CA, USA)進行。大黃素影響 LS1034 細胞株體外試驗之蛋白質 (Bax, Bcl-2, AIF, caspase-9, cytochrome c, b-actin 和 Complex IV)表現藉由西方墨點法測定[65] ，而每條 band 之 relative abundance 則藉由 NIH ImageJ software 來計算。 3.2.10 RNA 製備與 real-time PCR 將 LS1034 細胞株以 1*106 cells/well 之密度種植於 6-well plate 中，給與 30 µg/ml 之大黃素後分別培養不同之時 24 或 48 小時。培養後待測細胞經 trypsinized、收集，並以 PBS 清洗兩次。使用 Qiagen Neasy Mini Kit (Qiagen, Inc.,Valencia, CA, USA)萃取待測細胞之 total RNA[65]。使用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 在 42℃環境下作用 30 分鐘進行反轉錄(reverse transcription)。加入 SYBR Green PCR Master Mix，最後以 Biosystems 7300 Real-Time PCR system 以 CT method 分析待側檢品[68]。Primers 的 DNA 序列藉 Primer Express Software 評估並列於下。 Primers Primer name. Primer sequence. Homo caspase-3-F. CAGTGGAGGCCGACTTCTTG. Homo caspase-3-R. TGGCACAAAGCGACTGGAT. Homo caspase-9-F. TGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTT. Homo caspase-9-R. GTGAGCCCACTGCTCAAAGAT. Homo GAPDH-F. ACACCCACTCCTCCACCTTT. Homo GAPDH-R. TAGCCAAATTCGTTGTCATACC. 29.

(38) 3.2.11 統計分析以 Student's t-test 統計分析大黃素與對照組間的差異，並以 p<0.05 為達統計意義。體內試驗部分藉 Dunnett's test 與 oneway ANOVA 分析各試驗組間之差異，並以 p<0.05 為達到顯著差異。 3.3 體內抗癌試驗 3.3.1 實驗動物 30 隻年齡為 6~8 週之 BALB/c nu/nu 裸鼠購自國研院動物中心 (National Laboratory Animal Center)。實驗動物飼養於中國醫藥大學實驗動物中心(Laboratory Animal Center)內，並遵守中國醫藥大學實驗動物照護及使用委員會(IACUC)所制定的指導方針(Affidavit of Approval of Animal Use Protocol, No. 97-25-N)。 3.3.2 動物造模與試驗由 BALB/c nu/nu 裸鼠之側腹經皮注射 LS1034 細胞 (6*106 cells/mouse)。注射後每隔三天利用 calipers 與公式 V = L ×W2/2(V 體積、L 長度、W 寬度)測量計算每隻實驗動物之腫瘤大小直到第 39 天，期間當個別實驗動物之腫瘤體積達到約為 200 mm3 時便開始大黃素治療。實驗動物被隨機區分為三組，每組共 10 隻。第一組實驗動物給與基劑(1 % DMSO)，第二組給與 5-FU (fluorouracil) (33 mg/kg)，而第三組則給與大黃素(40 mg/kg)。接種第 39 天時將所有實驗動物以 CO2 麻醉、犧牲後取出腫瘤並測量其重量[69](圖 3.1)。計算相對腫瘤重量(g)與抑制率(%)時以平均值 ± 標準差(n=10)來表示。. 30.

(39) 圖 3.1. 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 異體轉殖腫瘤作用之作用之流程圖. 大腸癌細胞株 LS1034 轉移與侵犯之作用與機轉之作用與機轉 3.4 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 3.4.1 試劑試劑品名與廠商品名. 廠商. RPMI 1640 medium. Gibco BRL. fetal bovine serum. Gibco BRL. L-glutamine. Gibco BRL. penicillin-streptomycin streptomycin. Gibco BRL. trypsin-EDTA. Gibco BRL. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Sigma Chemical Co.. propidium iodide (PI). Sigma Chemical Co.. trypan blue. Sigma Chemical Co.. Tris-HCl. Sigma Chemical Co.. 3.4.2 傷口癒合試驗傷口癒合試驗(Wound (Wound healing Assay)可用於測量癌細胞的轉移 Assay) 用於測量癌細胞的轉移 31.

(40) (migration)能力。將 LS1034 細胞株以 1*106 cells/well 之密度種植於 10 cm 培養皿(petri dish)中直到培養細胞形成接合之全面細胞層 (confluent)，使用滅菌的 yellow micropipette tip 刮除單細胞層並以 PBS 清洗三次。細胞分別以不同濃度(0, 100 或 250 µg/ml)之大黃粗萃物培養 24 或 48 小時，最後以倒立顯微鏡(inverted microscope)拍攝與量測傷口癒合試驗之結果[64][70]。 3.4.3 基底膜基質侵犯能力試驗基底膜基質侵犯能力試驗(Matrigel invasion assay)利用以 matrigel 塗覆孔徑 8 µm 之穿膜小室(transwell cell culture chambers)進行 matrigel invasion assay。將 LS1034 細胞株分別以不同濃度(0, 100 或 250 µg/ml)之大黃粗萃物培養 24 小時後，以棉籤(cotton swab)移除膜上層面未侵犯之細胞，而膜下層面已侵犯之癌細胞則以 H&E 固定、染色與記數。與侵犯試驗相同，但以未塗覆 matrigel 之 transwell cell culture chambers 則可測試癌細胞之轉移(migration)能力[70][71]。 3.4.4 明膠酶譜分析試驗利用明膠酶譜分析試驗(Gelatin zymography assay)測定 MMP-2 及 MMP-9 之活性。將 LS1034 細胞株以 1*106 cells/well 之密度種植於 6-well plate 中，以 serum-free RPMI 1640 medium 培養並分別給與不同濃度(0, 250 或 500 µg/ml)之大黃粗萃物培養 24 或 48 小時。培養後分別收集個組之 conditioned medium，共 50 µg 之全蛋白質再藉由含有 0.2% gelatin 之 10% SDS-PAGE 電泳分離。電泳後，將電泳膠浸泡於 2.5% Triton X-100 兩次共 60 分鐘，接著再將其置於 substrate buffer (50 mM Tris HCl, 5 mM CaCl2, 0.02% NaN3 與 1% triton X-100, pH 8.0)中，並於 37°C 下靜置 18 小時。最後與 MMP-2 與 MMP-9 活性相關之電泳帶(bands)利用 0.2% Coomassie blue 進行負染色法 (negative staining)顯示[72]。 32.

(41) 3.4.5 西方墨點法測定 LS1034 細胞株轉移與侵犯相關蛋白質之表現將 LS1034 細胞株以 5*105 cells/well 之密度種植於 12-well plate 中，給與 250 µg/ml 之大黃粗萃物後分別培養不同之時間(0, 6, 12, 24 與 48 小時)。收集各組細胞後以含有 40 mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM EDTA、120 mM NaCl、1mM dithiothreitol 與 0.1% Nonide P-40 之裂解緩衝液溶解。以 10% sodium dodecyl sulphate (SDS)/polyacrylamide 電泳膠電泳 30 µg 之全蛋白質以進行西方墨點法，並續將分離之蛋白質電轉移至硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane)之上。給予各種蛋白質之初級抗體 24 小時後清洗，接著再給予次級抗體以進行化學發光法 (enhanced chemiluminescence)(NEN Life Science Products, Inc, Boston, MA, USA)。試驗以 Anti-β-actin 作為 loading control[73]。 3.4.6 統計分析三次獨立、重複試驗所獲得的結果以平均值 ± 標準差所呈現。大黃粗萃物與對照組之差異以 student's t-test 進行統計，並以 p<0.05 為具統計差異。. 33.

(42) 第四章結果. 4.1 大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉 4.1.1 大黃粗萃物含大黃素之測定高效液相層析儀(HPLC)可將混合物中的成分分離，並與標準品比較以進行待測成分之定性及定量分析。生藥材置去離子水，經震搖、抽氣過濾、靜置 24 小時後收集萃液。過濾後藥材經上述方法再收集萃液，合併兩次濾液並經減壓濃縮至乾為本次實驗製備之大黃檢品。經由 HPLC 對大黃素標準品(圖 4.1)與大黃檢品(圖 4.2)的測定，並利用 3.1.2.2 描述之公式計算可計算出本次研究製備之大黃粗萃物中大黃素之平均含量約 0.77 mg/g 。 4.1.2 大黃粗萃物對 LS1034 細胞株存活率之影響觀察細胞存活率，可得知大黃粗萃物對 LS1034 細胞株是否具有存活抑制的作用。利用死亡細胞細胞膜之不完整性，以及 Propidium iodide (PI)可通過受損細胞膜與 DNA 結合的特點，便可使用雷射光激發 PI 產生螢光再藉由流式細胞儀偵測出待測細胞的存活率。因此將 LS1034 細胞株分別投以不同濃度(0, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 和 2500 µg/ml)之大黃粗萃物，經 48 小時培養後再以 PI exclusion method 和流式細胞儀測定待測細胞之存活率。研究結果指出，大黃粗萃物可以濃度依賴關係造成 LS1034 細胞株死亡(圖 4.3)，並於濃度 500 µg/ml 以上皆達統計意義，其 IC50 約為 750 µg/ml。 34.

(43) 3.00. AU. 2.00. 1.00. 0.00 5.00. 圖 4.1. 10.00. 15.00 Minutes. 20.00. 25.00. 30.00. 大黃素標準品的 HPLC 測定。. 1.60 1.40 1.20. AU. 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 2.00. 圖 4.2. 4.00. 6.00. 8.00. 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes. 大黃檢品的 HPLC 測定。 35.