大黃粗萃物對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉

3.1.1 大黃粗萃物之抽提製備

取生藥材 100 克置於三角瓶中，加入 500 mL 去離子水。時時震 搖同時抽氣過濾，並於靜置 24 小時後收集萃取液。將藥材再置於 三角瓶中，加入 500 mL 去離子水，時時震搖與靜置 24 小時後合併 兩次濾液，以減壓濃縮至乾為止。

3.1.2 大黃粗萃物之 Emodin 定量

3.1.2.1 儀器：

高效液相層析儀(High performance liquid chromatography, HPLC)：

(1) 幫 浦 ： Waters 2695 Separations Module ； (2) 自 動 注 入 器 ： Autosampler 717+；(3)檢測器：Waters 2996 Photodiode Array Detector；

(4)分析軟體：Waters Empower software；(5)層析柱：MERCK 公司 LiChroCART®254-4 HPLC- Cartridge Lichrospher 100 RP-18 (5 µm)

。前端加上管柱(MERCK 公司 LiChroCART^®4-4 Lichrospher 100 RP-18 (5 µm)，以濾除雜質。

3.1.2.2 試驗方法：

1. 標準品之製備

稱取 1 mg emodin 之標準品，分別溶於 1 mL 甲醇中，以 0.45 µm (Nalgene®, New York, USA)濾膜過濾，為含量 1 mg/mL 之母液，供 HPLC 偵測 emodin 定性定量之用。

2. 檢品之製備

材料稱取 100 mg 以 1 mL 甲醇經溶解後，並以 0.45 µm 濾膜過濾

，供 HPLC 檢測 emodin 之含量。

3. 高效液相層析法

(1) 分析條件

在以乙腈(acetonitrile)：0.1% 醋酸(acetic acid) = 60 : 40 固定比例 為流動相，柱溫 25℃流速為 1 mL/min，檢測時間為 30 min，檢測 波長為 254 nm。

(2) 檢量線之繪製

取 emodin 之標準品，以濃度 1 mg/mL 作為稀釋母液，再分別稀 釋成母液的 1、1/2、1/4、1/8、1/16 及 1/32 倍等 6 個濃度之標準品 溶液，各以 0.45 µm 之微孔膜過濾，濾液用 autosampler 每次自動定 量注射 10 µL 注入 HPLC 分析，每個濃度處理重複 3 次注射，將 3 次總和平均。以濃度及積分面積各為橫座標和縱座標，利用線性迴 歸分析獲得方程式，製成標準檢量線。

其迴歸方程式如下：

emodin：Y= 44876868X+380788 R2 = 0.99944

3.1.3 試劑

試劑品名與廠商

品名 廠商

Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Chemical Co potassium phosphates Sigma Chemical Co propidium iodide (PI) Sigma Chemical Co ribonuclease-A (RNase A) Sigma Chemical Co

trypan blue Sigma Chemical Co

Tris-HCl Sigma Chemical Co

RPMI 1640 medium Gibco BRL

fetal bovine serum Gibco BRL

L-glutamine Gibco BRL

penicillin-streptomycin Gibco BRL

trypsin-EDTA Gibco BRL

CaspaLux-L1D2 OncoImmunin, Inc.

CaspaLux-M1D2 OncoImmunin

PhiPhiLux-G1D1 OncoImmunin

3.1.4 細胞培養

人類大腸腺癌(human colon adenocarcinoma)細胞株 LS1034 購自 臺灣新竹財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute)。其培養基為添加 2 mM L-glutamine、10% FBS、

100 Units/ml penicillin 與 100 lmg/ml streptomycin 之 RPMI 1640 培養 基。將細胞置於 75 cm²細胞培養瓶(tissue culture flasks)中，並於 37℃、

5% CO2、濕度 95%的培養箱中培養^[63]。

3.1.5 流式細胞儀測定細胞存活率

將 LS1034 細胞株以每 well 2*10⁵ cells 種植於 12-well plate 培養 24 小時，隨後分別加入不同濃度(0, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 與 2500 µg/ml) 之大黃粗萃物與 1%DMSO(溶劑)的對照組，接著將 細胞置於 37 ℃、5% CO2 與 95%空氣的環境下 48 小時。以 phosphate-buffered saline (PBS)清洗二次，再使懸浮於含 PI (5 µg/ml) 之 PBS 。 接 著 細 胞 以 PI exclusion method 和 流 式 細 胞 儀 (Becton-Dickinson, FACSCalibur, San Jose, CA, USA)測定存活率^[64]

。

3.1.6 流式細胞儀測定細胞週期分布

將 LS1034 細胞株以 2*10⁵ cells/well 密度種植於 12-well plate，加 入不同濃度(0, 250, 500, 750, 1000, 1500 與 2000 µg/ml)之大黃萃取 液後培養 24 小時。隨後細胞以冷的 phosphate-buffered saline (PBS) 清洗、70% ethanol 固定，並於 4℃靜置隔夜。細胞以 PBS 清洗後加 入 RNase A (200 µg/mL)後於 4℃下靜置 15 分鐘，接著以 PI (20 µg/mL)和 0.1% Triton X-100 染色並遮光 30 分鐘。最後利用 FACScan 流式細胞儀將待測細胞以 sub-G1、G0/G1、S 與 G2/ M 週期狀態來 區分^[65]。

3.1.7 彗星試驗與 DAPI 染色

將 LS1034 細胞株以 2*10⁵ cells/well 密度種植於 12-well plate，加 入不同濃度(0, 500, 750, 1000 與 2000 µg/ml)之大黃萃取液後培養 24 小時。以 4 µM hydrogen peroxide (H2O2)作為對照組(positive control)

。接下來待測細胞以 PI 染色進行彗星試驗(Comet assay)，而以 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)進行 DAPI 染色，最後皆以螢光

待測細胞 DNA 之損傷程度，而 DAPI 染色則可做為細胞核濃縮 (nuclear condensation)與斷裂(fragmentation)的依據。

3.1.8 測定流式細胞儀細胞內鈣離子濃度

將 LS1034 細胞株以 2*10⁵ cells/well 密度種植於 12-well plate，12 小時後投與 0 或 750 µg/ml 之大黃萃取液後分別培養不同時間週期

。待測細胞 trypsinized 後經離心收集並以 PBS 清洗兩次，分別再懸 浮於 500 µl 500 µl Fluo-3/AM (2.5 µg/ml)中以進行細胞內鈣離子濃 度之測定，懸浮 30 分鐘後再以細胞流式儀進行分析測定^[66]。

3.1.9 流式細胞儀測定 Caspase-3、caspase-8 與 caspase-9 之活性

將 LS1034 細胞株以 2*10⁵ cells/well 之密度種植於 12-well plate 中 24 小時，預先給與 caspase-3, caspase-8 和 caspase-9 之抑制劑後

，投與 0 和 750 µg/ml 之大黃萃取液分別培養 0、24 與 48 小時。收 集待測細胞後以 PBS 清洗兩次，接著將待測細胞再懸浮於以 50 µl、

濃度 10 µM 之 PhiPhiLux-G1D1、CaspaLux-L1D2 與 CaspaLux-M1D2 分別作為 caspase-3、caspase-8 和 caspase-9 之 substrate solution 中，

於 37℃環境下培養 60 分鐘。隨後以 PBS 清洗待測細胞樣品後，再 以流式細胞儀分別測定其 caspase-3、caspase-8 和 caspase-9 之活性^[66]

。

3.1.10 雷射共軛焦顯微鏡測定 LS1034 細胞株之蛋白質轉運

將 LS1034 細胞株以 2*10⁵ cells/well 之密度種植於 4-well 之細胞 培養玻片(Chamber slides)中，並分別給與 0 或 10 µg/ml 之大黃萃取 液後培養。24 小時後以溶於 PBS 中、濃度 4 %之甲醛(Formaldehyde) 固定 15 分鐘，再以溶於 PBS 中、濃度 0.3 %之 Triton-X 100 滲透 (permeabilized) 1 小時。接著以 2 %之 BSA 阻斷非特異性結合部位

(non-specific binding sites)，最後給與具有綠色螢光之 AIF、Endo G、

cytochrome c 或 GADD153 等初級抗體後靜置隔夜。隔夜後以 PBS 清洗待測細胞兩次，隨後再給與次級抗體(FITC-conjugated goat anti-mouse IgG)、具紅色螢光之粒線體專一性辨認染劑(Mito Tracker) 以進行 nuclein examination。最後利用 Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope 對 待 測 細 胞 檢 體 進 行 檢 測 與 顯 微 攝 影 (photomicrograph)，以測定 LS1034 細胞株之蛋白質轉運(protein translocation)。

3.1.11 西方墨點法測定 LS1034 細胞株之細胞週期與凋亡相關蛋白質的 表現

將 LS1034 細胞株以 5*10⁶ cells/well 之密度種植於 6-well plate 中

，給與 750 µg/ml 之大黃萃取液後分別培養不同之時間(0, 6, 12, 24 與 48 小時)。接著再分別將待測細胞置於含有 40mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM EDTA、120mM NaCl、1 mM dithiothreitol、0.1% Nonide P-40 A 30 µg 之溶解液(lysis buffer)中。將待測細胞檢體之蛋白質置 於 10% Tris-glycine-SDS-polyacrylamide 的膠體上進行西方墨點法

，並以電 泳點漬法(electro-blotting)將蛋 白質轉 移至硝化 纖維膜 (nitrocellulose membrane)上。接著分別給予各種蛋白質之初級抗體

，隨後再給與次級抗體結合以進行增強行化學發光法(enhanced chemiluminescence) (NEN Life Science Products, Inc, Boston, MA, USA)。本測定以 Anti-β-actin 作為 loading control。

3.1.12 統計方法

所有研究皆進行三重複試驗，試驗結果以平均值 ± 標準差呈現

。統計方式以 Student's t-test 進行統計分析，統計結果並以 p<0.05 設為具統計意義。