第三章 材料與方法
3.2 大黃素對大腸癌細胞株 LS1034 體外試驗之作用與機轉
3.2.1 試劑
試劑品名與廠商
品名 廠商
Emodin、propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich Corp Triton X-100、dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Corp N-acetylcysteine (NAC)和 trypan blue Sigma-Aldrich Corp RPMI 1640 medium Gibco/Life Technologies fetal bovine serum (FBS) Gibco/Life Technologies L-glutamine penicillin-strptomycin Gibco/Life Technologies
Trypsin-EDTA Gibco/Life Technologies
Caspase-3 activity assay kits OncoImmunin, Inc.
Caspase-8 activity assay kits OncoImmunin, Inc.
Caspase-9 activity assay kits OncoImmunin, Inc.
Caspase-3 inhibitor (Z-DEVD-FMK) R&D systems caspase-9 inhibitor (Z-LEHD-FMK) R&D systems
Caspase-9 antibodies Cell Signaling Technology cytochrome c antibodies Cell Signaling Technology
Bax Santa Cruz, CA, USA
Bcl-2 Santa Cruz, CA, USA
AIF Santa Cruz, CA, USA
b-actin Santa Cruz, CA, USA
complex IV antibodies Santa Cruz, CA, USA Secondary antibodies conjugated with HRP GE Healthcare
3.2.2 細胞培養
人類大腸腺癌細胞株 LS1034 購自臺灣新竹財團法人食品工業發 展研究所(Food Industry Research and Development Institute)。並於 37
℃、潮濕、5% CO2的環境下，將細胞置於 75 cm2細胞培養瓶(tissue culture flasks)中，以添加 2 mM L-glutamine、10% FBS、100 Units/ml penicillin 與 100 µmg/ml streptomycin 之 RPMI 1640 培養基培養。
3.2.3 型態改變
將 LS1034 細胞株以每 well 2*105 cells 種植於 12-well plate 培養 24 小時，隨後分別加入不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大黃素 與 1% DMSO(溶劑)的對照組，接著將細胞置於 37℃、5% CO2與 95%
空氣的環境下 24 或 48 小時，最後以位相差顯微鏡(phase contrast microscope)於 200 倍視野下觀察細胞並拍攝之。
3.2.4 流式細胞儀測定細胞存活率
將 LS1034 細胞株以 2*105 cells/well 之密度種植於 12-well plate 培養 24 小時，隨後分別加入不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大 黃素與 1%DMSO(溶劑)的對照組，接著將細胞置於 37 ℃、5% CO2 與 95%空氣的環境下 24 或 48 小時。以 phosphate-buffered saline(PBS) 清洗二次，再使懸浮於含 PI(5 µg/ml)之 PBS。接著細胞以 PI exclusion method 和流式細胞儀測(Becton-Dickinson, FACSCalibur, San Jose, CA, USA) 定 存 活 率 。 另 外 細 胞 先 以 活 性 氧 化 清 除 劑 (ROS scavenger)( NAC, 10 mM)處置 2 小時後再給予大黃素 24 小時，接下 來再依上述方法收集細胞並測量其存活率。
3.2.5 DNA content 測定與 sub-G1(Apoptosis)測定
每 well 2*105 cells LS1034 細胞株種植於 12-well plate 不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大黃素培養 24 小時與 48 小時，細胞 trypanized 後離心收集、PBS 清洗、以 70%之乙醇固定，並於-20℃
下放置隔夜。細胞再懸浮於含 40 µg/ml PBS、0.1 mg/ml RNase A 和 0.1% Triton X-100 之 PBS 中，並於 37℃的暗房中靜置 30 分鐘後再 以流式細胞儀測定分析。cell cycle distribution 與 sub-G1 group(凋亡) 的測定方法如同先前所敘述[67]。
3.2.6 DAPI 染色
每 well 1*105 cells LS1034 細胞株種植於 6-well plate，24 小時後 分別加入不同濃度(0, 5, 10, 20, 30 和 50 µM)之大黃素培養 24 小時。
依不同濃度收取細胞，加 3% Formaldehyde (PBS)於 4℃冰箱固定 10~15 分鐘，加入 PBS 洗二次，加入 0.1 % Triton X-100 / in 1 ml PBS 15 分鐘，再用 PBS 洗二次，加入 DAPI 染液 (1 µg/ml)在 37℃
incubator 避光 30 分鐘，再用 PBS 洗三次後再以螢光顯微鏡於 F 200X 倍率下觀察與拍攝。
3.2.7 活性氧物質、粒線體膜電位與鈣離子濃度測定
將 LS1034 細胞株以每 well 2*105 cells 種植於 12-well plate 後，加 入 0 或 30 µM 大黃素後分別等待不同時間(1, 3, 6, 12 和 24 小時)以 測定其 ROS、粒線體膜電位與鈣離子濃度。細胞收集後於 500 µl DCFH-DA (Molecular Probes/Life Technologies, Eugene, OR, USA) (10 µM)再懸浮以測定 ROS，和於 500 µl rhodamine 123 (1 µg/ml) (Molecular Probes)以測定粒線體膜電位，以及 500 µl Fluo-3/AM (2.5 µg /ml, Molecular Probes)以測定鈣離子濃度。細胞於 37℃培育 30 分鐘，並以流式細胞儀測定分析。
3.2.8 流式細胞儀與特異性抑制劑測定 Caspase-3 和 Caspase-9 之活性
預先以 caspase-3 抑制劑 Z-DEVD-FMK 和 caspase-9 抑制劑 Z-LEHD-FMK 處理 2 小時後，將處理或未處理過之 LS1034 細胞株 以每 well 2*105 cells 之密度種植於 12-well plate。投與 30 µg/ml 大 黃素後分別等待不同時間(0, 24 和 48 小時)，最後經不同處治之所 有待測細胞經 trypsinized 與離心後收集並以 PBS 清洗兩次。接著將 待測細胞再懸浮於以 50 µl、濃度 10 µM 之 PhiPhiLux-G1D1 與 CaspaLux9-M1D2分別作為 caspase-3 和 caspase-9 之 substrate solution (OncoImmunin, Inc.)中。接著於 37℃環境下培養 60 分鐘，隨後以 PBS 清洗待測細胞樣品後，再以流式細胞儀分別測定其 caspase-3 和 caspase-9 之活性。
3.2.9 西方墨點法測定 LS1034 細胞株凋亡相關蛋白質之表現
將 LS1034 細胞株以 5*105 cells/well 之密度種植於 12-well plate 中，給與 30 µg/ml 之大黃素後分別培養不同之時間(0, 6, 12, 18 與 24 小 時 )。隨 後待 測 細胞 經 trypsinized 與 收集後 溶解 (lysed) 於 PRO-PREPTM protein extraction solution (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Gyeonggi-Do, Korea)中。細胞裂解液(lysates)(40 µg of each) 以 polyacrylamide gel 之 SDS-PAGE 分 離 ， 並 電 轉 移 (electrotransfer)至 PVDF membrane (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA, USA)上。分別給予各種蛋白質之初級抗體(1:1000 dilutions in blocking buffer)後於 4℃環境下靜置隔夜。清洗後給與以 1:20,000 比例稀釋於 blocking buffer 中、標定 horseradish peroxidase (HRP)之 次級抗體，並於室溫中靜置 1 小時。HRP-conjugated goat anti-rabbit 或 anti-mouse IgG (GE Healthcare,Piscataway, NJ, USA)作為次級抗 體以進行增強行化學發光法(enhanced chemiluminescence) (ECL Kit, Millipore, Billerica, MA, USA)[67]。細胞質與粒線體之 cytochrome c
Fractionation Kit, BioVision, Inc., Mountain View, CA, USA)進行。大 黃 素 影 響 LS1034 細 胞 株 體 外 試 驗 之 蛋 白 質 (Bax, Bcl-2, AIF, caspase-9, cytochrome c, b-actin 和 Complex IV)表現藉由西方墨點法 測定[65]，而每條 band 之 relative abundance 則藉由 NIH ImageJ software 來計算。
3.2.10 RNA 製備與 real-time PCR
將 LS1034 細胞株以 1*106 cells/well 之密度種植於 6-well plate 中
，給與 30 µg/ml 之大黃素後分別培養不同之時 24 或 48 小時。培養 後待測細胞經 trypsinized、收集，並以 PBS 清洗兩次。使用 Qiagen Neasy Mini Kit (Qiagen, Inc.,Valencia, CA, USA)萃取待測細胞之 total RNA[65]。使用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 在 42℃環境下作用 30 分鐘進行反轉錄(reverse transcription)。加入 SYBR Green PCR Master Mix，最後以 Biosystems 7300 Real-Time PCR system 以 CT
method 分析待側檢品[68]。Primers 的 DNA 序列藉 Primer Express Software 評估並列於下。
Primers
Primer name Primer sequence Homo caspase-3-F CAGTGGAGGCCGACTTCTTG Homo caspase-3-R TGGCACAAAGCGACTGGAT
Homo caspase-9-F TGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTT Homo caspase-9-R GTGAGCCCACTGCTCAAAGAT
Homo GAPDH-F ACACCCACTCCTCCACCTTT Homo GAPDH-R TAGCCAAATTCGTTGTCATACC
3.2.11 統計分析
以 Student's t-test 統計分析大黃素與對照組間的差異，並以 p<0.05 為達統計意義。體內試驗部分藉 Dunnett's test 與 oneway ANOVA 分 析各試驗組間之差異，並以 p<0.05 為達到顯著差異。