認識身旁的小傢伙(22)－利用免疫抑制藥物探討昆蟲包囊作用的分子機制

認識身旁的小傢伙

(22)－利用免疫抑制

藥物探討昆蟲包囊作用的分子機制

趙事柔

1

吳雨璇

2

_蔡任圃

3

*

1_{臺 北 醫 學 大 學 藥 學 系} 2_{國 立 臺 北 大 學 不 動 產與 城 鄉 環 境學 系} 3_{臺 北 市 立 第 一 女 子 高 級 中 學}

壹、前言

前 人 已 建 立 昆 蟲 包 囊 作 用 的 觀 察 與 量 化 的 方 法 ， 且 對 包 囊 作 用 進 行 若 干 的 探 討 (蔡，2014、吳 與蔡，2017)，例 如：蟑 螂 免 疫 系 統 具 有 敵 我 辨 識 的 能 力 、 具 有 記 憶 性 質 、 具 加 成 性 、 不 具 可 逆 性 等 。 比 較 昆 蟲 的 免 疫 作 用 與 人 體 的 免 疫 機 制 比 較( 表 一)，也發 現 許 多異 同 之 處。雖然 前 人 對昆 蟲 包 囊 作 用 的 性 質 已 做 了 不 少 的 研 究 ， 但 是 引 發 包 囊 作 用 之 機 制 的 探 討 卻 相 當 缺 乏 (吳 與蔡，2017)。另 一 方 面，在 我 們 生 病時 由 醫 生 開 立 的 處 方 中 ， 時 常 含 有 消 炎 藥 、 解 熱 鎮 痛 藥 等 ， 服 用 後 可 抑 制 特 定 免 疫 反 應 以 減 緩 症 狀 ， 且 前 人 發 現 抗 發 炎 藥 與 減 少 部 分 癌 症 機 率 有 關(Ross, et al., 2011)。 因 此 我 們 想 ： 也 許 可 利 用 這 些 藥 物 的 作 用 機 制，用 來 研 究 昆 蟲 包 囊 作 用 的 生 化 路 徑。 昆 蟲 主 要 以 先 天 性 免 疫 來 對 抗 入 侵 物 ， 其 機 制 為 ： 入 侵 物 進 入 昆 蟲 體 內 ， 經 由 辨 識 後 ， 快 速 引 發 體 內 的 先 天 性 免 疫 ， 包 括 ： 包 囊 作 用 、 細 胞 吞 噬 作 用 、 抗 微 生 物 成 分 的 產 生 以 及 補 體 反 應 等 (Stanley *為本 文 通 訊 作 者

and Shapiro, 2007；Stanley, et al., 2012)。 其 中 ， 包 囊 作 用 是 指 入 侵 物 進 入 昆 蟲 體 內 後，為 避 免 入 侵 物 擴 散 以 及 為 使 其 去 活 化， 而 引 發 體 內 細 胞 聚 集 包 圍 入 侵 物 的 過 程 。 此 外 ， 對 於 昆 蟲 包 囊 作 用 的 量 化 方 法 ， 前 人 已 建 立 一 套 動 物 模 式(吳 與蔡，2017)：藉 由 將 蟑 螂 自 身 及 非 自 身 的 觸 角 植 入 於 體 腔 內 ， 經 過 一 段 時 間 後 取 出 ， 測 量 觸 角 上 包 囊 的 截 面 積 大 小 ， 作 為 包 囊 作 用 強 弱 的 指 標 。 透 過 這 些 研 究 方 法 ， 已 證 實 蟑 螂 包 囊 作 用 具 辨 識 敵 我(self or non-self)的 特 性， 也 具 有 與 後 天 性 免 疫 相 似 的 記 憶 效 應 。 蔡 (2014)與 吳 與 蔡 (2017) 發 現 電 荷 性 質 亦 會 影 響 蟑 螂 的 包 囊 作 用 。 若 將 連 接 電 池 正 負 極 的 銅 絲 插 入 蟑 螂 體 內 形 成 迴 路 ， 可 增 強 正 極 銅 絲 的 包 囊 作 用 ， 而 抑 制 負 極 銅 絲 的 包 囊 作 用 。 我 們 於 研 究 初 期 ， 依 照 前 人 進 行 包 囊 作 用 的 測 量 方 法 時 ， 發 現 以 此 方 法 操 作 失 敗 率 頗 高 ， 且 易 受 操 作 熟 練 度 的 影 響 。 因 操 作 期 間 需 將 植 入 的 觸 角 取 出 體 外 進 行 測 量 ， 但 觸 角 上 的 包 囊 細 胞 可 能 會 碰 觸 到 蟑 螂 的 背 部 骨 板 或 體 內 其 他 組 織 ， 使 沾 附 於

觸 角 上 的 包 囊 被 擠 壓 甚 至 刮 除 。 因 此 我 們 思 考 ： 除 了 測 量 植 入 物 外 的 包 囊 直 徑 外，是 否 可 利 用 包 囊 的 物 化 特 性， 開 發 出 更 易 操 作 又 準 確 的 測 量 方 式 ， 以 利 研 究 工 作 的 進 行 與 推 廣 。 若 植 入 物 上 的 包 囊 較 大 ， 代 表 有 較 多 層 的 免 疫 細 胞 包 覆 ， 則 該 包 囊 的 電 阻 應 較 大 。 也 許 我 們 可 以 測 量 植 入 物 所 引 發 包 囊 後 的 電 阻 ， 作 為 包 囊 程 度 的 指 標 。 藉 由 昆 蟲 包 囊 作 用 之 量 化 方 式 的 改 良 ， 我 們 便 可 以 使 昆 蟲 包 囊 作 用 之 測 量 更 為 方 便 、 精 確 、 穩 定 ， 進 而 推 廣 成 中 學 的 生 物 實 驗 活 動 。 人 體 的 發 炎 反 應 中 ， 常 透 過 二 十 碳 脂 肪 酸 衍 生 物(eicosanoids) 做 為 訊 息 分 子 (蔡，2003)，例 如：前 列 腺 素與 白 三 烯 等(圖 一)，引 發 發 炎 反應。其 中，當 細胞 受 傷時， 體 內 一 些 特 定 的 細 胞 因 子 便 會 活 化 自 身 的 環 氧 酶(cyclooxygenase, COX)。 環 氧 酶 包 括 COX-1 及 COX-2 兩 大 類，而 COX 會 使 花 生 四 烯 酸 轉 變 為 前 列 腺 素(蔡 ， 2003； Scheller, et al., 2011 ； Miranda, et al., 2006)，進而 引 發許 多 發 炎、發 燒、疼 痛等 症 狀 。 許 多 藥 物 就 是 透 過 抑 制 各 種 症 狀 之 生 化 路 徑 的 關 鍵 酵 素 或 受 體(表 二 )， 達 到 減 緩 症 狀 的 效 果(Kumar, et al., 2013 ； Simmons, et al., 2000) 。 例 如 ： 普 拿 疼 (Panadol) 的 主 要 成 份 － 乙 醯 胺 酚 (Acetaminophen, Ace) 可 抑 制 環 氧 酶 (COX)， 其 中 以抑 制 COX-2 的 效 果 較 強， 而 有 止 痛、鎮 熱(退 燒)的 藥效，但 對 COX-1 抑 制 效果 極 弱，幾乎 無 消炎 藥 效(Burd, et 表 一 、 人 體 與 昆 蟲 免 疫 作 用 的 比 較(修 改 自 ： 吳與 蔡 ， 2017)。 人 體 昆 蟲 最 初 防 線 皮 膜 組 織( 含 角 質 層 ) 及 其 分 泌 物(淚液 、 唾 液 、消 化 液) 皮 膜 組 織(幾 丁 質 外 骨 骼 )及 其 分 泌 物(唾液、消 化 液、各 種 腺 體分 泌 物) 發 炎 反 應 受 傷 組 織、嗜 中 性 白 血 球 分 泌 組 織 胺 所 引 起 甚 少 相 關 研 究 吞 噬 作 用 由 巨 噬 細 胞、嗜 中 性 白 血 球、樹 突 細 胞 等 執 行 由 漿 血 細 胞 、 粒 血 細 胞 等 執 行 包 囊 作 用 例 子 甚 少 ， 如 肺 結 核 之 結 核 由 漿 血 細 胞 、 粒 血 細 胞 等 執 行 組 織 黑 化 (malanization) 甚 少 相 關 研 究 相 關 者 為 具 有 酚 氧 化 酶 (phenoloxidase) 活 性 之 類 絳 色 細 胞 (oenocytoids) 排 斥 反 應 可 ， 主 要 由 T 淋巴 球 執 行 可 可 辨 識 敵 我 可 可 免 疫 具 專 一 性 具 有 ， 由 抗 體 或 T 淋 巴 球與 B 淋 巴 球 的 受 體 執 行 甚 少 相 關 研 究 免 疫 具 記 憶 性 由 記 憶 B 淋 巴 球及 記 憶 T 淋 巴 球 執 行 甚 少 相 關 研 究

圖 一 、 二 十 碳 脂 肪 酸 衍 生 物(eicosanoids)的 代 謝 路 徑 (引 用 自： 蔡 ， 2003)。 表 二 、 不 同 免 疫 相 關 藥 物 的 比 較 乙 醯 胺 酚 Acetaminophen, Ace 普 立 朗 錠 Prednisolone, Pre 非 索 非 那 定 fexofenadine, Fex 抑 制 的 酵 素 或 受 體 環 氧 酶(cyclooxygenase) (其 中 COX-2 較 強) 磷 脂 酶(phospholipase A2) (轉 錄與 轉 譯 階 層) 組 織 胺 受 體 (H1 receptor) 功 能 止 痛 、 鎮 熱(退 燒) 消 炎 抗 組 織 胺 ， 舒 緩 過 敏 症 狀 備 註 降 低 前 列 腺 素 不 會 ： 1.抑 制血 栓 形 成 2.使 人精 神 改 變 3.產 生上 癮 與 依賴 性 降 低 前 列 腺 素 與 白 三 烯 固 醇 類 藥 物 依 是 否 有 鎮 靜 作 用 分 為 兩 代

al., 2010；Fracon, et al., 2010；Hinz, et al.,

2008)，故乙 醯 胺酚 不 屬 於 消炎 藥。普 立朗 錠(Prednisolone, Pre)是 葡 萄醣 皮 質 素 的擬 似 劑 ， 屬 於 類 固 醇 藥 物 ， 可 於 轉 錄 與 轉 譯 階 層 抑 制 磷 脂 酶(phospholipase A2)， 具有 消 炎 藥 效 ( 蔡 ， 2016) 。 非 索 非 那 定 (fexofenadine, Fex)可 抑 制 組 織 胺 受 體 (H1 receptor)，屬 於 抗組 織 胺 藥 物，具 舒 緩 過敏 症 狀 藥 效(del Cuvillo, et al., 2006)。我 們 思 考 是 否 可 藉 由 上 述 不 同 作 用 機 制 的 消 炎 、 解 熱 、 鎮 痛 藥 物 的 施 用 ， 探 討 對 蟑 螂 包 囊 形 成 的 效 應，並 透 過 各 種 藥 物 的 作 用 機 制， 進 而 推 論 昆 蟲 包 囊 形 成 的 可 能 過 程 及 機 制 。

為 實 踐 以 上 的 想 法 ， 我 們 的 研 究 目 的 可 分 為 以 下 兩 方 面(圖 二 )： 一 、 改 量 前 人 包 囊 作 用 的 測 量 方 式 ， 嘗 試 建 立 測 量 包 囊 電 阻 作 為 包 囊 作 用 強 弱 的 指 標 ， 此 新 的 量 化 方 法 ， 除 了 可 符 合 本 研 究 的 需 求 外 ， 也 可 推 廣 於 中 學 的 探 討 活 動 課 程 。 二 、 利 用 各 種 消 炎 、 解 熱 、 鎮 痛 藥 物 研 究 對 蟑 螂 包 囊 作 用 的 效 應 ， 進 而 探 討 蟑 螂 包 囊 形 成 過 程 可 能 的 生 化 路 徑 。 圖 二 、 本 研 究 兩 大 目 的 ： (a) 嘗 試 以 植 入物 電 阻 增 加值 作 為 包 囊作 用 強 弱 的 指 標 。 (b) 利 用 各 種 消炎 、 解 熱 、鎮 痛 藥 物 對蟑 螂 包 囊 作 用 的 效 應 進 而 探 討 包 囊 形 成 過 程 可 能 的 生 化 路 徑 。

貳、研究方法或過程

(一) 實驗裝置與器材

名 稱 型 號 或 規 格 備 註 複 式 顯 微 鏡 Nikon 附 顯 微 測 微 鏡 頭 蟑 螂 屋 貼 紙 上 黏 蟑 螂 屋 錐 形 瓶 解 剖 器 械 鑷 子 與 小 剪 二 氧 化 碳 鋼 瓶 載 玻 片 76*26mm 相 機

(二) 實驗藥物

名 稱 來 源 備 註 Acetaminophen ACROS ORGANICS 非 固 醇 類 消 炎 藥 Prednisolone SIGMA 固 醇 類 藥 物 Fexofenadine 中 國 化 學 製 藥 股 份 有 限 公 司 抗 組 織 胺 藥 物

(三) 實驗動物

美 洲 蟑 螂(Periplaneta americana) 成 蟲 ， 為 本 校 自 行 飼 養 繁 殖 。 飼 養 方 式 與 實 驗 動 物 篩 選 參 考 自 蔡(民 103)。美 洲 蟑螂 之 成 蟲 體 長 全 長 約 3~4cm， 背部 骨 板 間 隙具 有 薄 膜 ， 易 於 植 入 育 植 入 物 。 為 方 便 植 入 異 物 的 進 行 ， 本 研 究 均 先 以 二 氧 化 碳 麻 醉 蟑 螂 後 再 進 行 實 驗 。

測量包囊

截面積大小

測量

電阻變化

？

(a)

測量包囊

截面積大小

測量

電阻變化

？

(a)

常用的

消炎藥

減緩人體

發炎作用

包囊作用

？

(b)

常用的

消炎藥

減緩人體

發炎作用

包囊作用

？

(b)

(四) 發 展 以 測 量 電 阻 作 為 包 囊 程

度指標的實驗方法

前 人 已 發 展 出 一 套 觀 測 昆 蟲 包 囊 作 用 之 實 驗 方 法 ， 但 該 法 易 受 操 作 者 對 於 此 方 法 的 經 驗 及 熟 練 度 影 響 。 昆 蟲 的 包 囊 是 由 其 血 球 細 胞 包 圍 入 侵 物 所 形 成 ， 細 胞 的 數 量 較 多 ， 代 表 細 胞 膜 的 層 數 較 多 ， 侵 入 物 與 外 界 的 電 阻 差 應 較 大 。 因 此 本 研 究 擬 以 測 量 植 入 物 的 電 阻 變 化 作 為 包 囊 作 用 程 度 的 指 標，同 時 也 佐 以 傳 統 之 包 囊 測 量 方 法， 以 驗 證 此 改 良 方 法 是 否 具 可 行 性 。 實 驗 操 作 過 程 如 下 ： 將 蟑 螂 觸 角 由 鞭 節 基 部 剪 下 ， 並 把 銅 絲(直 徑約 150 微 米) 從 觸 角 基 部 插 入 觸 角 內 ， 同 時 注 意 使 銅 絲 完 全 被 觸 角 包 覆 而 不 外 露(圖三)。接 下 來， 取 此 複 合 植 入 物 共 兩 組 ， 分 別 由 背 部 骨 板 左 右 兩 側 第 四 節 與 第 五 節 之 縫 隙 植 入 蟑 螂 體 腔 內 ， 此 兩 組 銅 絲 分 別 連 結 兩 具 三 用 電 表 的 正 極 。 蟑 螂 腹 部 中 央 則 插 入 第 三 條 銅 絲，連 結 兩 具 三 用 電 表 的 負 極(圖 四 )。此 兩 具 三 用 電 表 同 時 記 錄 電 阻 變 化 ， 每 次 觀 測 時 間 共15 分 鐘 。 於 電 阻 記 錄 完 成 後 ， 再 將 蟑 螂 體 腔 中 已 引 發 包 囊 作 用 的 植 入 物(觸 角 )取 出 ， 置 於 載 玻 片 上 ， 透 過 光 學 顯 微 鏡 與 顯 微 測 微 器 觀 察 與 測 量 包 囊 直 徑 ， 以 計 算 包 囊 截 面 積(圖 五 )。 本 研 究 先 以 已 知 的 包 囊 作 用 特 性 － 具 敵 我 辨 識 ， 測 試 以 電 阻 變 化 作 為 包 囊 作 用 之 指 標 的 可 行 性 。 圖 三 、 在 已 剪 下 的 蟑 螂 觸 角 內 植 入 銅 絲 。 左 為 示 意 圖 ， 右 為 實 際 照 片

圖 四 、 測 量 植 入 觸 角 之 電 阻 值 變 化 的 實 驗 裝 置 。 上 為 示 意 圖 ， 下 為 實 體 照 片 。

(a) (b)

圖 五 、 待 包 囊 作 用 完 成 後 ， 取 出 蟑 螂 觸 角(a)(b)， 並 在 顯 微鏡 下 觀 察 (c)(d)、 測 量 包囊 直 徑(e)。

(五) 透 過 藥 物 探 討 引 發 蟑 螂 包 囊

作用機制

(1) 乙 醯 胺 酚 (Acetaminophen, Ace.)的 作 用 以 重 量 百 分 濃 度 0.8% 生 理 食 鹽 水 (蟑 螂的 等 張 溶 液，Cohen, et al., 2002)為 藥 物 的 溶 劑 ， 且 依 實 驗 需 求 將 其 分 別 配 置 成 濃 度10-3 _{M 與 10}-5 _{M 的 乙 醯胺 酚 溶} 液 。 蟑 螂 經 二 氧 化 碳 麻 醉 後 ， 以 腹 面 朝 下 之 姿 勢 黏 貼 固 定 於 貼 紙 上 。 以 皮 下 注 射 針 筒 抽 取 0.2 毫 升之 特 定濃 度 之 乙 醯 胺 酚 溶 液 ， 經 蟑 螂 背 部 骨 板 縫 隙 注 入 蟑 螂 之 體 腔 中，依 實 驗 需 求 分 別 等 待15 分 鐘 或24 小 時 後 插入 植 入 物，並 操 作 上 述 的 電 阻 測 量 方 法。電 阻 測 量 歷 經15 分 鐘 後 ， 將 蟑 螂 體 內 植 入 物 取 出 ， 置 於 載 玻 片 上，利 用 複 式 顯 微 鏡 觀 察 包 囊 截 面 積， 比 較 實 驗 組 與 對 照 組 之 電 阻 值 變 化 與 包 囊 截 面 積 大 小 。 對 照 組 為 注 射 0.2 毫 升 蟑 螂 生 理 食 鹽 水，其 餘 操 作 流 程 皆 一 致。 (2) 普 立 朗 錠 (Prednisolone, Pre.)的 作 用 由 於 普 立 朗 錠 屬 於 脂 溶 性 藥 物 ， 故 需 先 使 用 體 積 比 1:19 之 DMSO(二 甲基 亞 碸，Dimethyl sulfoxide)與 0.8%生 理 食 鹽 水 為 溶 劑 ， 依 實 驗 需 求 將 其 分 別 配 置 成 濃 度10-3 _{M 與 10}-5 _{M 的 溶液。除 使 用} 藥 物 不 同 外，其 實 驗 步 驟 皆 與 實 驗(1)相 同 。 (3) 非 索 非 那 定 (Fexofenadine, Fex.)的 作 用 如 同 乙 醯 胺 酚 組 的 操 作 步 驟 ， 依 實 驗 需 求 將 其 分 別 配 置 成 濃 度 10-3 _{M 與} 10-5 _{M 的 溶 液 。除 使 用 藥 物不 同 外 ， 其} 實 驗 步 驟 皆 與 實 驗(1)相 同 。

參、研究結果

(一) 包 囊 作 用 新 測 量 方 法 可 信 度

證明

將 自 體 與 異 體 觸 角 植 入 蟑 螂 體 內 ， 測 量 其 包 囊 電 阻 ， 發 現 電 阻 包 囊 隨 時 間 逐 漸 增 加，代 表 包 囊 越 來 越 厚(圖六)，且 異 體植 入 物 電 阻 的 增 加 程 度 大 於 自 體 植 入 物(圖 七)。 而 取 出 植 入 物 後 所 測 量 的 包 囊 截 面 積 ， 也 證 明 異 體 植 入 物 包 囊 的 截 面 積 大 於 (d) (e)

自 體 植 入 物(圖 八 )， 其 結 果 與 前 人 測 量 的 結 果 趨 勢 一 致 ， 且 觸 角 包 囊 截 面 積 與 其 電 阻 增 加 值 相 關 係 數(r)為 0.904(圖九)。 圖 六 、 自 體 觸 角 與 異 體 觸 角 於 體 腔 內 的 電 阻 變 化(平 均 ± 標 準 誤 ， n = 15, 15)。 與 自 體 觸 角 組 相 比(單 尾配 對 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 圖 七 、 自 體 觸 角 與 異 體 觸 角 於 植 入 體 腔 後 60 分 鐘 時 的 電 阻變 化 量 (平 均 ± 標準 誤 ， n = 15, 15)。 與 自 體 觸 角 組 相 比(單 尾配 對 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 圖 八 、 自 體 觸 角 、 異 體 觸 角 與 負 極 銅 絲 於 植 入 體 腔 後60 分 鐘 時 包 囊 截面 積 (平 均 ± 標準 誤 ， n = 16, 16, 5)。 與 自 體 觸 角 組 相 比(單 尾配 對 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 0 2 4 6 8 10 12 14 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 時間(分鐘) 電阻增加程度 (百萬歐姆 ) 自體 異體 * * * * * * * * * 0 2 4 6 8 10 12 14 自體 異體 電阻增加 量( 百萬 歐姆) * 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 自體 異體 負極銅絲 包囊截 面積 (百 萬 平 方 微米) * *

圖 九 、 觸 角 包 囊 截 面 積 與 其 電 阻 增 加 值 之 迴 歸 曲 線(n = 12)。 相 關 係 數 (r) =0.904。

(二) 不同藥物對蟑螂對植入觸角包囊截面積的效應

1. 普 立 朗 錠 將 注 射10-3 _{M 及 10}-5 _{M 普 立朗 錠 的 實 驗組 與 對 照 組進 行 結 果 統計，可 看 出施 藥 15 分} 鐘 後 對 觸 角 包 囊 截 面 積 的 效 應，實 驗 組 與 對 照 組 未 達 統 計 上 之 顯 著 差 異(圖十)。但 施 藥 24 小 時 後 ，10-5 _{M 普 立朗 錠 組的 包 囊 作 用降 低(p < 0.05)(圖十 一)。} 圖 十 、 不 同 濃 度 普 立 朗 錠(Prednisolone, Pre.) 施 藥 15 分 鐘 後 ， 對 植入 觸 角 包 囊截 面 積 的 效 應(平 均 ± 標 準 誤 ， n = 取 樣 數 )。 與 對 照 組 相比 (單 尾 t 檢 定 )： 未 達 統計 顯 著 差 異 。 圖 十 一 、 不 同 濃 度 普 立 朗 錠(Prednisolone, Pre.) 施 藥 24 小 時 後 ， 對 植入 觸 角 包 囊截 面 積 的 效 應(平 均 ± 標 準 誤，n = 取 樣 數 )。與對 照 組相 比 (單 尾 t 檢 定 )：*：p < 0.05。 y = 2E-06x + 1.9129 R2 _{= 0.8172} 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 10 12 包囊截面積(百萬平方微米) 電阻 增加 値 (百萬 歐姆 ) 施藥15分鐘後 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Pre 10^-3M Pre 包囊直徑( 十萬平方微米) n = 32 40 31 施藥24小時後 0 1 2 3 4 5 6 7 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Pre 10^-3M Pre 包 囊直徑( 十萬平方微米) * n = 38 22 22

2. 乙 醯 胺 酚 將 注 射10-3 _{M 及 10}-5 _{M 乙 醯胺 酚 的 實 驗組 與 對 照 組進 行 結 果 統計 ， 我 們 發現 施 藥 15} 分 鐘 後 對 觸 角 包 囊 截 面 積 的 效 應 ，10-3 _{M 及 10}-5 _{M 乙 醯 胺 酚 組 的 包 囊 作 用 皆 降 低 (p <} 0.05)(圖 十二 )。但 施 藥 24 小 時 後，實 驗組 與 對 照 組的 包 囊 作 用未 達 統 計 上之 顯 著 差 異(圖 十 三)。 圖 十 二 、 不 同 濃 度 乙 醯 胺 酚(Acetaminophen, Ace.) 施 藥 15 分 鐘 後 ， 對植 入 觸 角 包囊 截 面 積 的 效 應(平均 ± 標 準 誤， n =取 樣 數 )。 與 對 照 組相 比 (單 尾 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 圖 十 三 、 不 同 濃 度 乙 醯 胺 酚(Acetaminophen, Ace.) 施 藥 24 小 時 後 ， 對植 入 觸 角 包囊 截 面 積 的 效 應(平均 ± 標 準誤 ， n = 取 樣 數 )。 與 對照 組 相 比 (單尾 t 檢 定 )： 未 達 統 計 顯 著 差 異 。 3. 非 索 非 那 定 將 注 射10-3 _{M 及 10}-5 _{M 非 索非 那 定 的 實驗 組 與 對 照組 進 行 結 果統 計 ， 可 看出 不 管 是} 施 藥 15 分 鐘 還是 24 小 時後 對 觸 角 包囊 截 面 積 的效 應 ， 實 驗組 與 對 照 組的 包 囊 作 用皆 未 達 統 計 上 之 顯 著 差 異(圖 十 四、 圖 十 五)。 施藥15分鐘後 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Ace 10^-3M Ace 包 囊直徑 (十萬平 方微米 ) n = 32 40 30 施藥24小時後 0 1 2 3 4 5 6 7 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Ace 10^-3M Ace 包囊 直徑 (十萬平 方微 米) n = 38 32 32 * *

圖 十 四 、 不 同 濃 度 非 索 非 那 定(Fexofenadine, Fex.) 施 藥 15 分 鐘 後 ， 對植 入 觸 角 包囊 截 面 積 的 效 應(平均 ± 標 準 誤，n = 取 樣 數 )。各 組 間 未 達 統 計 顯 著差 異 (單 尾 t 檢 定 )。 圖 十 五 、 不 同 濃 度 非 索 非 那 定(Fexofenadine, Fex.) 施 藥 24 小 時 後 ， 對植 入 觸 角 包囊 截 面 積 的 效 應(平均 ± 標 準誤，n = 取 樣數 )。各 組間未 達 統 計 顯著 差 異 (單尾 t 檢 定 )。

(三) 不同藥物對蟑螂對電阻增加值的效應

1. 普 立 朗 錠 將 注 射 10-3_{M 及 10}-5_{M 普 立朗 錠 的 實 驗組 與 對 照 組進 行 結 果 統計 ， 可 看 出施 藥 15 分} 鐘 後 對 植 入 之 觸 角 的 電 阻 增 加 值 效 應 ， 實 驗 組 與 對 照 組 未 達 統 計 上 之 顯 著 差 異(圖 十 六)。 但 施 藥24 小 時 後，10-5_{M 普 立 朗錠 組 的電 阻 增 加 值增 加(p < 0.05)(圖十 七)。} 施藥15分鐘後 0 2 4 6 8 10 12 14 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Fex 10^-3M Fex 包囊 直徑 (十 萬平 方微 米) n = 32 24 22 施藥24小時後 0 2 4 6 8 10 12 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Fex 10^-3M Fex 包囊 直徑( 十萬平方 微米) n = 38 30 40

圖 十 六、不 同 濃 度 普 立 朗 錠(Prednisolone, Pre.)施 藥 15 分 鐘 後，對 植 入 觸 角 電 阻 增加 值 的 效 應(平 均 ± 標 準 誤 ， n = 取 樣 數 )。 與 對 照 組 相比 (單 尾 t 檢 定 )： 未 達 統計 顯 著 差 異 。 圖 十 七 、 不 同 濃 度 普 立 朗 錠(Prednisolone, Pre.) 施 藥 24 小 時 後 ， 對 植入 觸 角 電 阻增 加 值 的 效 應(平 均 ± 標 準 誤，n = 取 樣 數 )。與對 照 組相 比 (單 尾 t 檢 定 )：*：p < 0.05。 2. 乙 醯 胺 酚 將 注 射 10-3_{M 及 10}-5_{M 乙 醯胺 酚 的 實 驗組 與 對 照 組進 行 結 果 統計 ， 可 看 出施 藥 15 分} 鐘 與 24 小 時 後後 對 植 入 之觸 角 的 電 阻增 加 值 效 應， 實 驗 組 與對 照 組 未 達統 計 上 之 顯著 差 異(圖十 八 、 十 九)。 圖 十 八、不 同 濃 度 乙 醯 胺 酚(Acetaminophen, Ace)施 藥 15 分 鐘 後，對 植 入 觸 角 電 阻增 加 值 的 效 應(平 均 ± 標 準 誤 ，n = 取 樣 數 )。 與 對 照 組相 比 (單 尾 t 檢 定 )： 未 達統 計 顯 著 差 異 。 施藥15分鐘後 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Pre 10^-3M Pre 電阻 增加 量( 百 萬 歐 姆 ) n = 32 40 32 施藥24小時後 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Pre 10^-3M Pre 電阻增 加量( 百 萬歐姆) * n = 40 22 24 施藥15分鐘後 0 1 2 3 4 5 6 7 8 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Ace 10^-3M Ace 電阻增 加量( 百萬歐 姆) n = 32 40 30

圖 十 九、不 同 濃 度 乙 醯 胺 酚(Acetaminophen, Ace)施 藥 24 小 時 後，對 植 入 觸 角 電 阻增 加 值 的 效 應(平 均 ± 標 準 誤， n = 取 樣 數 )。 與 對 照組 相 比 (單尾 t 檢 定 )： 未 達 統 計 顯 著 差 異 。 3. 非 索 非 那 定 將 注 射 10-3_{M 及 10}-5_{M 非 索非 那 定 的 實驗 組 與 對 照組 進 行 結 果統 計 ， 可 看出 施 藥 15} 分 鐘 後，10-3_{M 及 10}-5_{M 非 索非 那 定 組 的的 電 阻 增 加值 皆 增 加(圖二 十)。但 施 藥 24 小 時後} 對 植 入 之 觸 角 的 電 阻 增 加 值 效 應 ， 實 驗 組 與 對 照 組 未 達 統 計 上 之 顯 著 差 異(圖 二 十 一)。。 圖 二 十 、 不 同 濃 度 非 索 非 那 定(Fexofenadine, Fex.) 施 藥 15 分 鐘 後 ， 對植 入 觸 角 電阻 增 加 值 的 效 應(平均 ± 標 準 誤， n = 取 樣 數 )。 與 對 照 組 相 比(單 尾 t 檢 定 )： # : p = 0.078； *: p < 0.05。 圖 二 十 一、不 同 濃 度 非 索 非 那 定(Fexofenadine, Fex.) 施 藥 24 小 時 後，對 植 入 觸 角電 阻 增 加 值 的 效 應(平 均 ±標 準誤 ， n =取 樣 數 )。 與 對 照組 相 比 (單尾 t 檢 定 )： 未 達 統 計 顯 著 差 異 。 施藥24小時後 0 2 4 6 8 10 12 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Ace 10^-3M Ace 電 阻 增 加 量 (百 萬 歐 姆 ) n = 39 32 32 施藥15分鐘後 0 2 4 6 8 10 12 14 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Fex 10^-3M Fex 電 阻 增 加 量 (百 萬 歐 姆 ) # * n = 32 24 22 施藥24小時後 0 2 4 6 8 10 12 14 16 生理食鹽水(0.8%) 10^-5M Fex 10^-3M Fex 電 阻增加 量( 百萬歐 姆) n = 40 30 39

將 各 組 同 藥 物 、 同 濃 度 、 同 時 間 的 數 據 進 行 算 術 平 均 數 的 計 算 ， 將 觸 角 包 囊 截 面 積( 圖 十 至 圖 十 五 ) 與 觸 角 電 阻 增 加 值 (圖 十六 至 圖 二 十一)的 數 據，整 理、繪 製 成 XY 分 布 圖(圖 二十 二)與 計 算相 關 係 數。以 10-3 _{M 乙 醯 胺 酚 (Acetaminophen, Ace.)為} 例 ， 注 入 蟑 螂 體 內 十 五 分 鐘 後 所 得 的 包 囊 截 面 積 與 電 阻 增 加 值 ， 即 為 圖 二 十 二 中 的 藍 色 圓 形 A-3_{。 若 比 較 注 射 藥 物 十 五 分 鐘} 後 ， 各 組 包 囊 截 面 積 與 電 阻 增 加 值 的 相 關 係 數 為0.63。若 比 較 注 射 藥物 二 十 四 小時 後，其 相 關 係 數 為-0.02，其 中 10-5 _{M 普 立} 朗 錠(圖 二 十 二 中 的 桃 紅 色 方 型 P-5 _{)的 電} 阻 增 加 值 為 極 端 值 ， 再 去 除 該 組 數 據 後 ， 包 囊 截 面 積 與 電 阻 增 加 值 的 相 關 係 數 為 0.96。

肆、討論

本 研 究 嘗 試 利 用 電 阻 增 加 值 來 觀 測 蟑 螂 包 囊 作 用 ， 期 以 此 方 法 使 實 驗 者 更 方 便 操 作 及 量 化 結 果 ， 但 此 方 法 會 受 其 他 變 因 對 電 阻 增 加 值 的 影 響 所 限 制 。 此 外 ， 我 們 還 發 現 昆 蟲 引 發 包 囊 作 用 的 可 能 途 徑 ， 且 不 同 的 藥 物 於 昆 蟲 體 內 有 藥 效 快 慢 之 分 。 在 進 行 藥 物 實 驗 前 ， 我 們 先 閱 讀 文 獻 ， 得 知 不 同 藥 物 的 機 轉 。 普 立 朗 錠 (Prednisolone, Pre.)會 抑 制 磷脂 酶 作 用，減 少 花 生 四 烯 酸 的 釋 放 量 ， 以 減 緩 之 後 環 氧 化 酶 的 發 炎 反 應 機 制(蔡，2016)；乙 醯 胺酚 (Acetaminophen, Ace.)則 會 抑制 環 氧 化 酶 圖 二 十 二 、 在 藥 物 實 驗 中 包 囊 直 徑 大 小 與 電 阻 增 加 值 的 回 歸 曲 線 及 相 關 係 數 。 A-3_：10-3 _{M 乙 醯 胺 酚 ；A}-5_：10-5 _{M 乙 醯 胺 酚 ；} C： 對 照 組 (生 理 食 驗 水 )； F-3_：10-3 _{M 非 索 非 那 定； F}-5_：10-5 _{M 非 索 非 那 定 ；} P-3_：10-3 _{M 普 立 朗 錠 ；P}-5_：10-5 _{M 普 立 朗 錠 。} y = 7E-06x + 2.9163 r = 0.63 y = -3E-07x + 10.127 r = -0.02 y = 1E-05x + 3.9607 r = 0.96 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 包囊直徑(十萬平方微米) 電 阻增加 量( 百萬 歐姆 ) 15分鐘 24小時

P

-5

P

-3

A

-3

F

-3

_A

-5

C

F

-5

P

-5

P

-3

A

-3

F

-3

A

-5

C

F

-5 y = 7E-06x + 2.9163 r = 0.63 y = -3E-07x + 10.127 r = -0.02 y = 1E-05x + 3.9607 r = 0.96 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 包囊直徑(十萬平方微米) 電 阻增加 量( 百萬 歐姆 ) 15分鐘 24小時

P

-5

P

-3

A

-3

F

-3

_A

-5

C

F

-5

P

-5

P

-3

A

-3

F

-3

A

-5

C

F

-5

作 用(尤 其 是 COX-2)， 減少 前 列 腺 素的 釋 放 量，以 抑 制 發 炎 反 應(Burd, et al., 2010； Fracon, et al., 2010；Hinz, et al., 2008)；非 索 非 那 定(Fexofenadine, Fex.)會 抑 制 組 織 胺 受 體 作 用 ， 減 少 組 織 胺 釋 放 量 ， 達 到 減 緩 發 炎 反 應 的 目 的(del Cuvillo, et al., 200)(圖二 十 三)。 注 射 普 立 朗 錠(Prednisolone)15 分 鐘 後 ， 蟑 螂 的 包 囊 作 用 均 未 與 對 照 組 達 統 計 上 之 顯 著 差 異 。 但 考 慮 到 類 固 醇 藥 物 因 需 透 過 調 節 基 因 表 現 以 發 揮 藥 效 ， 故 所 需 時 間 較 長 ， 因 此 將 藥 物 作 用 所 需 時 間 這 項 因 子 納 入 本 研 究 的 設 計 中 ， 發 現 注 射 普 立 朗 錠24 小 時 後 會 抑制 蟑 螂 的 包囊 作 用，由 於 普 立 朗 錠 在 人 體 內 會 抑 制 磷 脂 酶 ， 故 我 們 推 論 ： 蟑 螂 體 內 可 能 含 有 磷 脂 酶 ， 且 其 參 與 包 囊 作 用 的 發 生 機 制 ， 另 一 方 面 ， 普 立 朗 錠 在 蟑 螂 體 內 需 要 經 過 一 段 時 間 才 能 發 揮 藥 效 ， 代 表 其 可 能 如 同 在 人 體 內 一 般 ， 須 透 過 基 因 的 轉 錄 過 程 而 產 生 效 應 。 將 乙 醯 胺 酚(Acetaminophen) 注 射 入 蟑 螂 體 內 15 分 鐘後，蟑 螂 的包 囊 作 用 受到 抑 制，我 推 論 蟑 螂 體 內 可 能 具 有 環 氧 化 酶， 且 其 中 的 COX-2 可 能 參 與 昆 蟲 包 囊 作 用 的 分 子 機 制 。 此 外 ， 我 們 觀 察 到 乙 醯 胺 酚 注 射 入 蟑 螂 體 內 24 小 時 後 其藥 效 減 弱，我 們 對 此 現 象 原 因 的 推 論 為 蟑 螂 對 藥 物 的 代 謝 ， 而 此 現 象 恰 與 在 人 體 內 結 果 雷 同 。 由 前 述 的 兩 種 藥 物 的 實 驗 結 果 與 推 論 ， 我 們 認 為 蟑 螂 的 包 囊 作 用 與 引 發 人 體 發 炎 反 應 的 部 分 生 化 路 徑 相 同 ， 即 為 ： 外 來 物 入 侵 後 ， 會 使 某 些 特 定 的 細 胞 因 子 活 化 磷 脂 酶 。 其 後 ， 磷 脂 酶 會 釋 放 出 花 生 四 烯 酸 ， 並 催 化 COX-2 放 出 發 炎 性 前 列 腺 素 ， 進 而 引 發 昆 蟲 的 包 囊 作 用 。 另 外 ， 我 們 在 非 索 非 那 定 (Fexo fenadine) 藥 物 實驗 的 實 驗 結果 發 現：不 管 是 否 有 經 過 一 日 等 待 後 再 進 行 量 測 ， 其 實 驗 組 數 據 均 未 與 對 照 組 達 統 計 上 之 顯 著 差 異 ， 此 應 代 表 昆 蟲 的 包 囊 作 用 與 組 織 胺 或 其 受 體 無 關 。 圖 二 十 三 、 本 研 究 所 使 用 之 藥 物 於 人 體 內 之 作 用 機 制 。 Fexofenadine

在 著 手 進 行 藥 物 實 驗 之 前 ， 我 們 希 望 以 電 阻 增 加 值 作 為 包 囊 作 用 的 指 標 ， 便 先 嘗 試 以 此 新 方 法 測 量 蟑 螂 的 自 體 觸 角 及 異 體 觸 角 插 入 蟑 螂 體 內 後 ， 其 包 囊 程 度 所 導 致 的 電 阻 變 化 量 ， 並 同 時 量 測 兩 觸 角 的 包 囊 截 面 積 大 小 。 我 們 將 兩 種 測 量 方 式 的 實 驗 結 果 進 行 統 計 及 相 關 係 數 的 計 算 後 ， 發 現 兩 者 的 相 關 係 數 屬 高 度 相 關(0.7≤|r|<1)。 但 為 確 定 利 用 電 阻 增 加 值 作 為 包 囊 作 用 的 指 標 ， 具 有 穩 定 度 與 有 效 度 ， 於 是 在 之 後 的 藥 物 實 驗 中 ， 我 們 便 同 時 測 量 電 阻 增 加 值 及 包 囊 截 面 積 大 小 ， 以 確 保 此 新 方 法 的 可 行 性 。 我 們 考 慮 到 在 藥 物 實 驗 中 ， 實 驗 組 和 對 照 組 分 屬 不 同 的 個 體 具 個 體 差 異 ， 因 此 在 進 行 相 關 係 數 的 計 算 前 ， 我 們 會 先 將 同 藥 物 、 同 濃 度 、 同 時 間 的 數 據 進 行 算 術 平 均 數 的 計 算 ， 發 現 注 射 藥 物 15 分 鐘 後 ， 包 囊 截 面 積 與 電 阻 增 加 值 的 相 關 係 數 屬 於 中 度 相 關(r = 0.63)。 若比 較 注 射 藥物 二 十 四 小 時 後 ，10-5 _{M 普 立朗 錠 的 電 阻增} 加 值 為 極 端 值 ， 參 考 文 獻 後 發 現 普 立 朗 錠 (Prednisolone, Pre. ) 除 了 會抑 制 發 炎 反應 外 ， 也 會 降 低 血 鈣 值 及 抑 制 脂 肪 分 解 等 ， 且 普 立 朗 錠 作 用 時 間 具 延 遲 性 ， 且 透 過 調 節 多 種 基 因 表 現，同 時 影 響 多 種 生 理 指 標， 而 這 些 會 造 成 電 阻 增 加 值 受 到 包 囊 包 覆 厚 度 之 外 的 變 因 影 響 ， 進 而 導 致 所 測 得 的 電 阻 增 加 值 無 法 直 接 反 映 包 囊 作 用 的 強 度 。 而 我 們 實 際 測 量 包 囊 截 面 積 大 小 所 得 的 結 果，10-5 _{M 普 立朗 錠(Prednisolone, Pre. )在} 蟑 螂 體 內 會 抑 制 包 囊 作 用 ， 可 發 揮 藥 效 ， 比 對 圖 二 十 二 中 的 24 小 時 條 件 下 的 點 P-5_{，可 發 現 若 此 數 據 點 未 參 與 相 關 係 數 的} 運 算 ， 則 所 得 的 相 關 係 數 值 從 低 度 相 關 變 成 高 度 相 關 ， 此 現 象 說 明 其 為 極 值 ， 即 在 注 射 10-5 _{M 普 立 朗 錠 (Prednisolone, Pre.)} 24 小 時 後的 生 理環 境 下，無 法 以 電 阻 增加 值 作 為 指 標 ， 而 於 其 他 條 件 下 ， 電 阻 增 加 值 可 作 為 包 囊 作 用 程 度 的 指 標 ， 尤 其 是 在 不 影 響 血 淋 巴 性 質 的 條 件 下 。 綜 上 所 述 ， 本 研 究 「 以 電 阻 加 值 作 為 包 囊 作 用 的 指 標 」 的 新 方 法 雖 會 受 到 實 驗 環 境 限 制 ， 但 在 大 部 分 的 實 驗 中 ， 此 方 法 是 可 行 的 ， 且 可 與 前 人 的 量 測 方 法 同 時 進 行 ， 提 高 所 得 數 據 的 準 確 度 。 除 此 之 外 ， 我 們 也 由 不 同 免 疫 抑 制 藥 物 的 實 驗 ， 得 知 昆 蟲 包 囊 作 用 可 能 的 分 子 機 制( 圖 二 十 四)。 圖 二 十 四 、 蟑 螂 包 囊 作 用 可 能 的 分 子 機 制 。

參考文獻

Burd, N. A., Dickinson, J. M., Lemoine, J.K., Carroll, C. C., Sullivan, B. E., Haus, J. M., Jemiolo, B., Trappe, S. W., Hughes, G. M., Sanders, C. E. Jr. and Trappe, T. A. 2010. Effect of a cyclooxygenase-2 inhibitor on post exercise muscle protein synthe sis in humans. Am. J. Physiol. Endo crinol.

Metab. 298(2): E354-361.

Cohen, R. W., Mahoney, D. A. and Can, H. D. 2002. Possible Regulation of Feeding Behavior in Cockroach Nymphs by the Neurotransmitter Octopamine. J. Insect Behavior. 15(1): 37-50.

del Cuvillo, A., Mullol, J., Bartra, J., Dávila, I., Jáuregui, I., Montoro, J., Sastre, J. and Valero, A. L. 2006. Comparative pharmacology of the H1 antihi stamines. J. Investig. Allergol. Clin.

Immunol. 16: 3-12.

Fracon, R. N,, Teófilo, J. M., Moris, I. C. and Lamano, T. 2010. Treatment with paracetamol, ketorolac or etoricoxib did not hinder alveolar bone healing: a histometric study in rats. J. Appl.

Oral. Sci. 18(6): 630-634.

Hinz, B., Cheremina, O. and Brune, K. 2008. Acetaminophen (paracetamol) is a selective cyclooxygenase-2 inhibitor in man. FASEB J. 22 (2): 383–390. Kumar, R., Jain, S. and Jain, N. 2013.

Synthesis and evaluation of ace taminophen derivatives as analgesic, antipyretic and anti-inflammatory agents. Der Pharma. Chemica. 5: 73-78.

Miranda, H. F., Puig, M. M., Prieto, J. C. and Pinardi, G. 2006. Synergism between paracetamol and nonsteroidal anti-inflammatory drugs in experimental acute pain. Pain. 121(1-2): 22-28. Ross, J. A., Blair, C.K., Cerhan, J. R., Soler,

J.T., Hirsch, B. A., Roesler, M. A., Higgins, R. R. and Nguyen, P. L. 2011. Nonsteroidal anti-inflamma tory drug and acetamino phen use and risk of adult myeloid leukemia. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20(8): 1741-50.

Scheller, J., Chalaris, A., Schmidt-Arras, D. and Rose-John, S. 2011. The pro- and anti-inflammatory properties of the cytokine interleukin-6. Biochim.

Biophys. Acta. 1813(5): 878-88.

Simmons, D. L. Wagner, D. and Westover, K. 2000. Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs, Acetamino phen, Cyclooxygenase 2,and Fever.

Clin. Infect. Dis. 5: S211-8

Stanley, D and Shapiro, M. 2007. Eicosanoid biosynthesis inhibitors increase the susceptibility of Lymantria dispar to nucleopolyhedrovirus LdMNPV. J.

Invertebrate Pathology. 95(2): 119–

124.

Stanley, D., Haas, E. and Miller, J. 2012. Eicosanoids: Exploiting Insect Immunity to Improve Biological Control Programs. Insects. 3(2): 492-510. 吳 季 昀、蔡 任 圃(2017)。探 討昆 蟲 免 疫 系統 之 敵 我 辨 識 與 記 憶 效 應 等 性 質 的 實 驗 方 法 。 科 學 教 育 月 刊 ，398， 25-38。 蔡 世 滋(2016)。 期 待 減 少 疾 病 活 性 及 醣 皮 質 類 固 醇 之 合 理 使 用。思 樂 醫 之 友， 97，3-7。 蔡 任 圃(2003)。傳統 激 素 概 念的 省 思-來 自 脂 雙 層 的 訊 息 — 前 列 腺 素 與 白 三 烯 。 科 學 新 天 地 ，5，42-47。 蔡 任 圃(2014)。認識 身 旁 的 小傢 伙(14)－ 昆 蟲 包 囊 作 用 的 觀 察。科 學 教 育 月 刊， 371，41-47。