誘引劑對高氏柴胡懸浮細胞生長與柴胡皂苷含量累積之影響

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(1)台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 61(2):112–123 (2012). 誘引劑對高氏柴胡懸浮細胞生長與柴胡皂苷含量累積之影響 1 陳威臣 2 夏奇鈮 2 葉茂生 3 曹進義 2 蔡新聲 4,5 摘要陳威臣、夏奇鈮、葉茂生、曹進義、蔡新聲。2012。誘引劑對高氏柴胡懸浮細胞生長與柴胡皂苷含量累積之影響。台灣農業研究 61:112–123。. 高氏柴胡 (Bupleurum kaoi Liu, Chao et Chuang) 懸浮細胞於含有 0.2 mg/L 二氯苯氧基乙酸 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 之 1/2 MS 液態培養基中於低光照下以 100 rpm 轉速培養，細胞之生長在接種後 0–2 週為緩慢生長期，在 2–4 週呈現快速生長期，在培養 4 週後進入生長靜止期。振盪速度試驗結果顯示， 80 rpm 較 100 rpm 振盪速率在培養 4 週後，具有較高之細胞生長量。細胞接種密度試驗結果顯示，以 12% 密度接種之細胞生長最佳，接種密度較高 (24%) 或較低 (6%) 的細胞生長表現均較差，但同樣接種密度 (12%) 下，以較大培養容器為佳 (125-mL vs. 250-mL 錐形瓶)。添加誘引劑之試驗結果顯示，在處理 2 週後，所有誘引劑處理之細胞鮮重皆受到顯著抑制；但在細胞乾重方面，酵母抽出物處理與對照組之乾重相較並無顯著差異，僅茉莉酸與高濃度離層酸處理對細胞乾重有顯著抑制之效果，但三種誘引劑處理對懸浮細胞之柴胡皂苷 (saikosaponin a 及 saikosaponin d) 累積均有促進效果，柴胡皂苷含量可提高 1.9–2.0 倍，產量可提高 1.6–1.8 倍。進一步施用 500 mg/L 酵母抽出物作為誘引劑，結果顯示施用 2 週後柴胡皂苷含量較對照組增加 2.1 倍，而柴胡皂苷產量可達對照組之 2.8 倍，顯示在細胞生長後期施用誘引劑並在特定反應時間後收穫細胞，有助於二次代謝產物柴胡皂苷之產生與累積。關鍵詞：高氏柴胡、藥用植物、懸浮細胞培養、柴胡皂苷、誘引劑。. 前言. 南柴胡 (Bupleurum scorzonerifolium)，日本則. 柴胡 (Chai-Hu, Radix Bupleuri) 為重要之. 以三島柴胡 (Bupleurum falcatum) 為正品 (Gan. 傳統中藥材，中國藥典所列正品柴胡為柴胡屬. 1985; Pan et al. 2002)，台灣特有種高氏柴胡. (Bupleurum) 之北柴胡 (Bupleurum chinense) 與. (Bupleurum kaoi) 之柴胡皂苷含量及保肝效果. 1. 2. 3. 4. 5.. 行政院農業委員會農業試驗所研究報告第 2666 號。接受日期：101 年 5 月 24 日。本所生物技術組助理研究員、副研究員、聘用助理研究員。台灣台中市。國立中興大學農藝學系教授。台灣台中市。朝陽科技大學生物技術研究所教授。台灣台中市。通訊作者，電子郵件：[email protected]；傳真機：(04)23304921。.

(2) 誘引劑與柴胡皂苷含量 113. 已被證實優於北柴胡與三島柴胡 (Chen et al. 2005; Yen et al. 2005)。柴胡根部所含之柴胡皂. 2008) 與二氫血根鹼 (dihydrosanguinarine) (Cho et al. 2008) 的含量。然而，亦有報告指出施用. 苷 a 與 d (saikosaponin a, d; SSa, SSd) 為具有藥理生物活性的主要物質，近來許多團隊積極針. 誘引劑會導致細胞生長受到抑制 (Chen & Chen 2000; Li et al. 2003)。Chen et al. (2005, 2008). 對南柴胡與高氏柴胡之醫療機制加以研究，證. 的研究結果顯示，高氏柴胡癒合組織培養 8 週. 實具有優異的保肝、抗 B 型肝炎病毒、抗氧. 後之柴胡皂苷 SSa 與 SSd 加總含量達約市售. 化、消炎、促進腸蠕動與抑制癌細胞增生效果，在現代醫藥學的重要性與日俱增 (Hsu et. 品 (北柴胡乾燥根) 的 9%；如何優化此一懸浮. al. 2004; Wang et al. 2004; Cheng et al. 2005)。. 人進一步研究。本研究首先建立高式柴胡懸浮. 細胞培養系統以提高柴胡皂苷的生產，值得吾. 藥用植物的開發與利用是植物與藥學專家. 細胞培養之生長曲線，用以瞭解細胞隨著時間. 的共同努力目標，在合成藥當道的今日，仍有. 增加的生長量變化，並針對振盪速率與細胞接. 許多藥物須由傳統植物萃取而來；近年來許多. 種密度優化懸浮細胞生長，而後並藉由添加. 野生藥用植物生長環境遭受破壞已瀕臨滅種；. YE、JA 與 ABA 等誘引劑提高柴胡皂苷產量，. 且有鑑於許多藥用植物需特殊環境栽培，或因. 逐步建立高氏柴胡細胞懸浮培養生產柴胡皂苷. 生育緩慢而無法大量取得，這些因素讓利用離. 之生產系統。. 體細胞或器官培養生產二次代謝物成為最佳替代方式 (Nalawade et al. 2003; Tripathi & Tripa-. 材料與方法. thi 2003; Mulabagal et al. 2004)；例如利用細胞培養方式生產紫杉醇 (taxol) (Chang et al. 2004). 供試材料與培養條件. 與喜樹鹼 (camptothecine) (Fulzele et al. 2001). 養於 1/2 MS (Murashige & Skoog 1962) 基本鹽. 等重要藥物成分，亦已證實此一模式用於商業. 類添加 0.2 mg/L 2,4-D 及 3% 蔗糖之培養基 (D2. 生產的可行性。. 培養基) 以誘導癒傷組織；取 0.5 g 癒合組織. 就懸浮細胞培養增殖效率而言，影響因子除培養基組成分外，振盪速度 (Chueh et al.. 切碎後，移入內含 20 mL D2 培養基之 125-mL. 2000) 與細胞接種密度 (Chang et al. 2004) 也是影響之重要因子。Radman et al. (2003) 指. 取高氏柴胡 (Bupleurum kaoi) 瓶苗葉片培. 錐形瓶中，以 100 rpm 轉速振盪培養，培養基每 3 週更換一次，經 5–6 次繼代培養後，利. 出，細胞培養時添加誘引劑 (elicitors) 可提高. 用篩網 (0.84 mm) 過篩取得大小一致之懸浮細胞作為後續試驗的材料。培養環境為 25 ± 1℃. 培養細胞之二次代謝物含量。前人研究結果顯. 低光照 (10 μmol/m 2 /s)，培養之錐形瓶置於. 示，YE 處理可促進丹參酮 (tanshinones) (Chen & Chen 2000)、人參皂苷 (ginsenoside) (Lu et al. 2000) 與紫杉醇 (Wang et al. 2001) 含量；. SanKuan, Taiwan) 以 80 或 100 rpm 轉速進行培養 (Chen et al. 2005)。. Li et al. (2003) 指出，添加酵母抽出物 (yeast. 懸浮培養細胞之生長曲線調查. 水平迴轉振盪器 (Orbital Shaker, SK-302AB,. extract, YE) 之處理則可能導致離層酸 (abscisic. 取 1 mL 沉降體積 (packed cell volume, PCV). acid, ABA) 含量增加，因而促進丹參酮累積。. 細胞接種於含 24 mL D2 液態培養基之 125-mL. 添加茉莉酸 (jasmonic acid, JA) 或甲基茉莉酸. 有臂錐形瓶 (總體積為 25 mL)，以 100 rpm 振. (Methyl Jasmonate, MJ) 則可增加人參皂苷 (Lu et al. 2000)、青蒿素 (artemisinin) (Baldi & Dixit. 盪速率進行培養，共培養 25 支有臂錐形瓶，每週利用錐形瓶之側臂調查懸浮細胞之 PCV.

(3) 114. 台灣農業研究第 61 卷第 2 期. 值，共培養 5 週。以培養時間為橫座標，PCV. 柴胡檢品之柴胡皂苷含量分析. 值為縱座標，繪出細胞之生長曲線。. 柴胡皂苷含量測定以高壓液相層析法 (HPLC 法) 測定 (Chen et al. 2008)，方法簡述. 振盪速率與細胞接種密度對懸浮培養細胞生長增殖之影響. 如下：檢品包括柴胡皂苷標準品 SSa 與 SSd，. 將 3 mL PCV 細胞接種於含 22 mL D2 液態. 以及上述處理所得乾燥細胞樣品。標準品係利. 培養基之 125-mL 有臂錐形瓶 (總體積為25 mL)，. 用甲醇溶解成系列濃度，進樣檢測後製成檢量. 分別以 80 與 100 rpm 振盪速度培養，每 2 天. 線；乾燥細胞檢品磨碎後以甲醇為溶劑，經超. 調查一次 PCV 值至第 28 天。細胞接種密度試驗係利用 3 mL PCV 細胞接種於 125-mL 與 250-mL 錐形瓶，培養總體積在兩種錐形瓶中分別為 25 及 50 mL，細胞接種密度分別為 12% (3 mL/25 mL × 100%) 及 6% (3 mL/50 mL × 100%)；以同樣方式接種 6 mL PCV 細胞於兩種容積之錐形瓶中，接種密度則分別為 24% (6 mL/25 mL × 100%) 及 12% (6 mL/50 mL × 100%)，以 80 rpm 振盪速率進行細胞懸浮培養，於培養 2、3 與 4 週後調查各處理之細胞乾重。. 誘引劑對懸浮培養細胞乾重與柴胡皂苷含量之影響以 3 mL PCV 細胞接種於內含 22 mL D2 液態培養基之 125-mL 錐形瓶，以 80 rpm 振盪速率進行培養，誘引劑於細胞培養 3 週後，分別添加 1 mL YE (500, 1000 mg/L)、JA (0.119, 1.19 mM) 或 ABA (5, 50 μM) 溶液，並以添加 1 mL 無菌水與 0.2% 乙醇溶液作為對照組，再經過 1 週的培養後調查細胞乾重及其柴胡皂苷含量。. 酵母抽出物處理時間對懸浮培養細胞乾重與柴胡皂苷含量之影響以 6 mL PCV 細胞接種於內含 44 mL D2 液態培養基之 250-mL 錐形瓶 (接種密度. 音波震盪 30 分鐘後以濾紙過濾並收集濾液，重複萃取 3 次且合併濾液，經真空減壓濃縮後再加入甲醇定量，以 0.22 μm 濾膜過濾備用。 HPLC 層析條件如下，利用氰化甲烷 (acetonitrile)：水＝ 40：60/50：50/40：60 (v/v) 為流動相進行定溫 (35℃) 梯度洗提分析，流速 1 mL/min，紫外線檢定波長為 203 nm，用以分析各檢品 SSa 與 SSd 含量。細胞檢品萃取液重複注射 3 次，每次進樣 10 μL 濾液，並依檢量線的線性迴歸方程式推算各檢品的 SSa 及 SSd 含量。. 資料統計與分析懸浮細胞生長曲線以 25 個有臂錐形瓶細胞 PCV 值的平均值繪製；振盪速率係調查 5 個有臂錐形瓶細胞 PCV 值的平均值；細胞接種密度與誘引劑試驗則是以每處理取樣 3 個錐形瓶進行調查。試驗均採用完全逢機設計 (completely randomized design, CRD) 設計，所得資料經 SAS 8.2 版套裝統計分析軟體進行變方分析 (analysis of variance, ANOVA)，若處理效應顯著 (P < 0.05)，則利用最小顯著性差異 (least significant difference, LSD) 測驗比較各處理平均值間之差異。. 結果培養時間對懸浮培養細胞生長增殖之影響. 12%)，以 80 rpm 振盪速率進行培養，培養 3. 取 1 mL PCV 之細胞培養於含有 24 mL D2. 週後分別添加 1 mL 之 500 mg/L YE 溶液與無. 液態培養基，培養 2 週後之細胞 PCV 值約為. 菌水 (對照組)，再繼續培養 1 與 2 週後調查細. 2.97 mL，培養 3 週之細胞 PCV 值達 6.23 mL，. 胞乾重及其柴胡皂苷含量。. 最大細胞生長量出現在培養 4–5 週間，其細胞.

(4) 誘引劑與柴胡皂苷含量 115. PCV 值約為 11.5 mL，但此兩週間之細胞 PCV. 12% 細胞接種密度但培養容器為 250-mL 錐形. 值並無明顯差異 (圖 1)。. 瓶得到之細胞乾重為 0.51 g。細胞接種密度為. 振盪速率與接種細胞密度對懸浮培養細胞生長增殖之影響. 24% (125-mL 錐形瓶) 之懸浮細胞初期生長較為快速，在第 3 週後即可得最大乾重，但在培. 將 12% 接種密度之高氏柴胡懸浮細胞分. 養 4 週後其細胞乾重與使用相同 125-mL 容器. 別以 80 及 100 rpm 的振盪速率培養，結果如. 但接種密度為 12% 之處理並無顯著差異。. 圖 2 所示。培養前期 (0–14 天) 兩種振盪速率處理之 PCV 值並無明顯差異；培養後期 (15–. 誘引劑對懸浮培養細胞生長增殖與柴胡皂苷含量之影響. 28 天) 雖然以 80 rpm 振盪速率處理之懸浮細. 誘引劑試驗結果如表 1 所示，就細胞鮮重. 胞 PCV 值較高，但兩處理間仍無明顯差異，. 而言，處理 1 週後各誘引劑處理之細胞生長與. 直到培養後第 28 天，由於 100 rpm 處理之細胞. 對照組相較均未受到明顯影響，僅 JA 與 ABA. PCV 值下降，致使兩處理結果開始呈現差異。. 高濃度處理相較於對照組呈現顯著降低 (P <. 在培養 28 天後利用 80 及 100 rpm 振盪速率處. 0.05) 的結果；在處理 2 週後，以無菌水對照. 理的細胞 PCV 值分別約為 12.5 及 11.2 mL。. 組之細胞鮮重最高為 4.41 g/瓶，0.2% 乙醇對. 細胞接種密度試驗結果如圖 3 所示，當. 照組之細胞鮮重次之為 3.81 g/瓶，其餘各誘引. 細胞接種密度為 6% (250-mL 錐形瓶) 懸浮細. 劑處理之細胞鮮重介於 1.90–3.42 g/瓶，誘引. 胞無明顯生長，經 4 週培養後細胞呈現褐化. 劑間呈現顯著差異。若再就各誘引劑濃度效應. 狀態。細胞接種密度為 12% (125-mL 錐形瓶). 而言，在培養 2 週後僅 1000 mg/L 較 500 mg/L. 經 4 週培養後之細胞乾重約為 0.26 g，而同樣. YE 處理在濃度增加時對細胞鮮重有明顯抑. 圖 1. 高氏柴胡懸浮細胞之生長增殖曲線。將 1 mL PCV 細胞添加於 24 mL 含有 0.2 mg/L 2,4-D 之 1/2 MS 液態培養基中以 100 rpm 振盪培養 5 週之生長情形，每週取樣調查 5 重複，圖中誤差線為標準誤差。 Fig. 1. Growth curve of cell suspension cultures of Bupleurum kaoi. One mL PCV cells were inoculated into a 24-mL 1/2 MS medium containing with 0.2 mg/L 2,4-D. Cultures were incubated at 25℃ on a shaker at 100 rpm and 5 flasks were sampled weekly for five weeks to measure the packed cell volume. Vertical bar indicates standard error of mean..

(5) 116. 台灣農業研究第 61 卷第 2 期. 圖 2. 高氏柴胡懸浮細胞於不同振盪速度中生長之情形。接種 3 mL PCV 細胞於 22 mL D2 液態培養基之 125-mL 有臂錐形瓶，每 2 天調查細胞 PCV 值，共培養 4 週之細胞生長情形，每處理調查 3 重複，圖中誤差線為標準誤差。 Fig. 2. Effect of speed of shakers (80 and 100 rpm) on cell proliferation of Bupleurum kaoi. Cells grew in a 1/2 MS basal medium containing 0.2 mg/L 2,4-D. Cultures were sampled at 2-day-interval for 4 weeks, 3 flasks/sampling date/treatment, and measured the packed cell volume. Vertical bar indicates standard error of mean.. 圖 3. 不同細胞接種密度下高氏柴胡懸浮細胞生長之情形。以 3 mL 及 6 mL PCV 接種於 125-mL 或 250-mL 之錐形瓶，兩種容器內之培養總體積分別為 25 mL 及 50 mL。懸浮細胞在培養後第 2、3 及 4 週後調查乾重，每處理調查 3 重複，圖中誤差線為標準誤差。 Fig. 3. Effect of inoculum density on cell proliferation of Bupleurum kaoi. Cells grew in a 1/2 MS basal medium containing 0.2 mg/L 2,4-D. Packed cell volume (PCV) of 3 mL or 6 mL were added into the culture medium to make a total 25 mL culture volume in the 125-mL flask for inoculum density of 12% and 24%, respectively. Larger culture medium volume of 50 mL in the 250-mL flask was also conducted by adding 3 mL or 6 mL PCV cultures to make 6% and 12% inoculum density, respectively. Data of cell dry weight was collected on 2nd, 3rd, and 4th week, 3 flasks/ sampling date/treatment. Vertical bar indicates standard error of mean..

(6) 誘引劑與柴胡皂苷含量 117. 表 1. 誘引劑酵母抽出物、茉莉酸與離層酸在添加 1 及 2 週後對高氏柴胡懸浮細胞生長之影響 Table 1. Effect of elicitors on cell proliferation of Bupleurum kaoi after 1 and 2 week(s) coculture z Fresh weight (g/flask) Elicitor (Con.). 1 wk. Dry weight (g/flask). 2 wks. 1 wk. 2 wks. Control-1 (H2O). 3.74 ± 0.28 a y. 4.41 ± 0.20 a. 0.40 ± 0.013 a. 0.38 ± 0.008 a. Control-2 (0.2% EtOH). 3.29 ± 0.33 a. 3.81 ± 0.11 b. 0.37 ± 0.024 b. 0.36 ± 0.003 b. YE (500 mg/L). 3.49 ± 0.05 a. 3.42 ± 0.10 c. 0.39 ± 0.004 ab. 0.38 ± 0.009 a. YE (1000 mg/L). 3.33 ± 0.36 ab. 3.05 ± 0.10 d. 0.36 ± 0.016 bc. 0.36 ± 0.010 b. JA (0.119 mM). 3.16 ± 0.30 ab. 2.07 ± 0.00 f. 0.32 ± 0.006 d. 0.26 ± 0.006 d. JA (1.19 mM). 3.10 ± 0.40 b. 1.90 ± 0.10 f. 0.28 ± 0.016 e. 0.22 ± 0.002 e. ABA (5 μM). 3.11 ± 0.45 ab. 2.86 ± 0.16 e. 0.36 ± 0.010 bc. 0.36 ± 0.009 b. ABA (50 μM). 2.95 ± 0.28 b. 2.81 ± 0.13 e. 0.33 ± 0.022 cd. 0.34 ± 0.006 c. z. Cultures of Bupleurum kaoi were grown in a 1/2 MS basal medium containing 0.2 mg/L 2,4-D for 3 weeks on a shaker at 80 rpm and then treated with various concentration of YE, JA and ABA for 1 or 2 week(s). Autoclaved water (Control-1) and 0.2% EtOH (Control-2) in the medium were used as controls. y Values are mean ± standard error and means within a column followed by the same letter(s) are not significantly different at 5% level by LSD test. There were 3 replicate flasks per treatment.. 制，提高 JA 與 ABA 濃度對鮮重影響並不顯. 酵母抽出物對懸浮培養細胞生長增殖之影響. 著。在細胞乾重方面仍以無菌水對照組之細胞. 以 500 mg/L YE 處理懸浮細胞 1 週及 2 週. 乾重較高，誘引劑中以 YE 處理有較高之細胞. 後對柴胡皂苷誘導累積結果顯示 (圖 4)，添加. 乾重，ABA 處理次之，而以 JA 處理之細胞乾. 500 mg/L YE 對於懸浮培養細胞之柴胡皂苷累. 重最低。. 積確有促進效果，施用 1 週後即可測得細胞之. 在柴胡皂苷含量方面，表 2 顯示當懸浮細胞培養至第 3 週時之 SSa 與 SSd 加總含量為 0.076 mg/g dry wt (DW)，此時分別進行誘引劑 (處理組)、0.2% 乙醇 (對照組) 與無菌水 (對照組) 之添加；當懸浮細胞培養至第 4 週時，無菌水對照組之 SSa 與 SSd 之加總含量為 0.098 mg/g DW，而 0.2% 乙醇對照組為 0.092 mg/g DW，三種誘引劑處理組之 SSa 與 SSd 之加總含量均高於對照組，500 mg/L YE、0.119 mM JA 與 5 μM ABA 處理組柴胡皂苷依序約為 0.18、. SSa 與 SSd 加總含量約 0.45 mg/g DW，相較於對照組 SSa 與 SSd 加總含量 (0.21 mg/g DW)，增加約 2.14 倍；而 YE 施用達 2 週後其細胞之 SSa 與 SSd 加總含量達 1.67 mg/g DW，約為對照組細胞之 SSa 與 SSd 加總含量 (0.6 mg/g DW) 的 2.78 倍。. 討論建立不同物種懸浮細胞培養之生長曲線除有助於了解各別物種細胞之生長習性外，更可利用細胞特有之生長週期決定細胞培養操作策. 0.19 與 0.20 mg/g DW，分別為無菌水對照組. 略，例如繼代培養之最佳時期、添加誘引劑時. 之 1.84、1.94 與 2.04 倍。依柴胡皂苷產量而. 機以及瞭解細胞內二次代謝物累積的情形作為. 言，則 500 mg/L YE 與 5 μM ABA 處理效果相. 收穫時間的參考等 (Chen & Chen 2000; Chueh. 當，分別為 3.51 及 3.58 mg/L，約為對照組之. et al. 2000)。本研究結果顯示，高氏柴胡懸浮. 1.79 與 1.83 倍，0.119 mM JA 處理效果次之為. 細胞培養於 D2 液態培養基以 100 rpm 振盪速. 3.04 mg/L，約為對照組之 1.55 倍。. 度於低光照環境中培養，其細胞增殖變化呈 S.

(7) 118. 台灣農業研究第 61 卷第 2 期. 表 2. 誘引劑酵母抽出物、茉莉酸與離層酸施用 1 週後對高氏柴胡懸浮細胞內柴胡皂苷含量之影響 Table 2. Content of saikosaponins in cell suspension cultures of Bupleurum kaoi after treating with elicitors for 1 week Saikosaponins content (mg/g) SSa y. SSd. SSa + SSd (A). Cell production (B) (g/L). Productivity (A) × (B) (mg/L). Control. 0.050 ± 0.002 d x. 0.026 ± 0.006 c. 0.076. 17.0. 1.292. Control-1 (H2O). 0.066 ± 0.006 c. 0.032 ± 0.006 c. 0.098. 20.0. 1.960. Control-2 (0.2% EtOH). 0.062 ± 0.003 c. 0.030 ± 0.004 c. 0.092. 19.0. 1.748. 500 mg/L YE. 0.142 ± 0.004 a. 0.038 ± 0.003 b. 0.180. 19.5. 3.510. 0.119 mM JA. 0.134 ± 0.003 a. 0.054 ± 0.006 b. 0.190. 16.0. 3.040. 5 μM ABA. 0.109 ± 0.004 b. 0.090 ± 0.006 a. 0.199. 18.0. 3.582. Treatment z. z. Cultures of Bupleurum kaoi were grown in a 1/2 MS basal medium containing 0.2 mg/L 2,4-D, on a shaker (80 rpm) for 3 weeks and then treated with elicitors (500 mg/L YE, 0.119 mM JA or 5 μM ABA) for 1 week. Autoclaved water (Control-1) and 0.2% EtOH (Control-2) in the medium were used as controls. y SSa: saikosaponin a; SSd: saikosaponin d. x Values are mean ± standard error and the means within a column followed by same letter(s) are not significantly different at 5% level by LSD test. There were 3 replicate flasks per treatment.. 圖 4. 高氏柴胡懸浮細胞培養於添加 0.2 mg/L 2,4-D 之 1/2 MS 基本培養基中 3 週後施用無菌水 (A) 與 500 mg/L YE (B)，繼續培養 1 及 2 週後細胞之柴胡皂苷單位含量之變化，每處理調查 3 重複，圖中誤差線為標準誤差。 Fig.4. Changes of saikosaponins content of Bupleurum kaoi in cultures grown in a 1/2 MS basal medium containing 0.2 mg/L 2,4-D for 3 weeks and then treated with autoclaved water (A) and 500 mg/L YE (B) for 1 or 2 weeks. There were 3 replicate flasks per treatment. SSa: saikosaponin a; SSd: saikosaponin d..

(8) 誘引劑與柴胡皂苷含量 119. 型生長曲線 (圖 1)，其中 0–2 週為緩慢生長期. 均不利於高氏柴胡 (B. kaoi) 細胞之生長增殖；. (lag phase)、2–4 週為快速生長期 (log phase) 及. 另外在相同細胞接種密度 (12%) 條件，以不同. 4 週以後之生長靜止期 (stationary phase)，而後. 大小容器培養之細胞增殖效率也不相同，顯示. 細胞即開始呈現褐化現象，因此判斷其繼代培. 不僅細胞接種密度會影響細胞培養效率，培養. 養時間應在培養 3–4 週後較適宜。. 容器的容積大小也是影響細胞增殖的因子之一. 振盪速率主要影響液態培養基中氣體的交. (圖 3)。. 換，若振盪轉速過慢可能導致培養細胞因氣體. 許多研究報告指出，植物細胞培養過程中. 交換不足而死亡，振盪速率太快則容易造成細. 添加誘引劑可誘使其二次代謝物產量增加 (Radman et al. 2003; Mulabagal et al. 2004)。近年. 胞間彼此的撞擊而影響生長；此外，懸浮細胞種密度過低，易因缺乏細胞相互間的支持造. 來，人參皂苷 (Lu et al. 2000)、紫杉醇 (Chang et al. 2004)、青蒿素 (artemisinin) (Baldi & Dixit. 成細胞生長過於緩慢或死亡；若接種密度太. 2008) 與丹參酮 (Chen & Chen 2000) 等重要藥. 高，則可能因為營養的迅速耗盡，以及空間. 用成分均有利用誘引劑促進培養細胞之藥用成. 的不足而無法縮短生長期，達到最高細胞產. 分生產的成功實例。本研究結果顯示，施用. 量，所以尋求適當振盪速率與細胞接種密度對提高懸浮培養的效率十分重要 (Chang et al.. YE、JA 或 ABA 均會促進高氏柴胡懸浮細胞. 之生長速率也會受到細胞接種密度的影響，接. 1993; Chueh et al. 2000)。台灣龍膽 (Gentiana davidii) 懸浮細胞於80–100 rpm轉速培養時，細. 中柴胡皂苷的累積，然而在較高濃度或較長時間處理下，則顯示有抑制細胞生長的結果 (表. 胞生長情形最佳，轉速過快 (120 rpm) 或過慢. 1)。誘引劑種類對二次代謝物累積具有不同的效果，添加 YE 可提高丹參 (Salvia miltiorrhi-. (60 rpm)，對細胞生長均產生不利影響 (Chueh et al. 2000)。Chang et al. (1993) 報告指出台灣. za) 細胞之丹參酮含量 (Chen & Chen 2000)。人參皂苷 (Lu et al. 2000) 與紫杉醇 (Wang et al.. 白芷 (Angelica dahurica) 懸浮細胞適合培養於 120 rpm 之振盪速率，其生長速率較以 100 及. 2001) 可因為添加 YE 而大量形成。添加茉莉酸 (JA) 在人參 (P. ginseng) 細胞培養中，人參. 80 rpm 培養之細胞為高。本試驗結果顯示高氏柴胡 (B. kaoi) 懸浮細胞培養達第 4 週後，. 皂苷含量可隨著 JA 濃度的增加而增加 (Lu et al. 2000)。Baldi & Dixit (2008) 指出添加甲基. 80 rpm 振盪處理所得之細胞 PCV 值較 100 rpm. 茉莉酸 (Methyl Jasmonate, MJ) 於青蒿 (Artemisia annua) 細胞培養，對於青蒿素 (artemis-. 處理為高 (圖 2)，顯示不同物種細胞應有其適合的振盪培養速度。Chang et al. (2004) 於台灣紅豆杉 (Taxus mairei) 細胞培養研究指出，在 2–5% 低密度 (25–50 g/L) 接種條件下，細胞體積增加效果較佳。Chang et al. (1993) 於台. inin) 的誘導效果最佳。金英花 (Eschscholtzia californica) 之細胞培養則顯示，MJ 對於金英花細胞中二氫血根鹼 (dihydrosanguinarine) 的. 灣白芷 (A. dahurica) 懸浮細胞培養研究指出，. 誘導效果較佳，但血根鹼 (sanguinarine) 累積則以添加 YE 處理最好 (Cho et al. 2008)。Li. 20% (v/v) 細胞接種密度具有最佳增殖效果，. et al. (2003) 於丹參細胞培養報告指出，添加. 較低接種密度培養 (2–4% v/v) 則會延長其生. YE 可能導致 ABA 含量增加而使細胞生長受. 長週期。本研究結果顯示高氏柴胡以12%細胞. 抑制，但卻能提高丹參酮含量。本研究結果亦. 接種密度 (250-mL 錐形瓶)，具有較佳增殖效. 顯示，直接施用 ABA 對促進高氏柴胡懸浮培. 果，較高 (24%) 或較低 (6%) 的細胞接種密度. 養細胞中柴胡皂苷 SSa 與 SSd 的累積效果最.

(9) 120. 台灣農業研究第 61 卷第 2 期. 佳，雖然添加 YE 對提高柴胡皂苷的效果稍低. 本研究後續採用對於細胞生長抑制較輕微. 於 ABA，但 YE 處理對細胞生長之抑制影響. 的 YE 進行進一步試驗，結果顯示在細胞培養. 較小，因此在整體柴胡皂苷產量上與 ABA 相近，呼應 Li et al. (2003) 之試驗結果 (表 2)。. 抑制作用 (資料未列)，但具有促進柴胡皂苷累. 細胞培養中加入誘引劑雖可增加其二次. 積之效果，在施用 1 週及 2 週後其細胞之柴胡. 代謝物產量，但誘引劑亦有可能抑制懸浮細胞的增殖 (Radman et al. 2003)。Chen & Chen. 皂苷含量分別為對照組之 2.14 及 2.78 倍；在. 3 週後施用 500 mg/L YE 對細胞生長並無明顯. 圖 4B 中可以看到 YE 處理後 1 週細胞之柴胡皂. (2000) 與 Li et al. (2003) 研究指出，不當濃度. 苷尚未大量累積，處理 2 週後柴胡皂苷大幅上. 之 YE 與 JA 處理對丹參細胞生長具有相當大. 升。上述結果顯示，高氏柴胡細胞懸浮培養可. 的抑制效果，因此對細胞二次代謝的生產而. 藉由利用細胞生長之中後期施用 YE 誘引劑，. 言，誘引劑的最適添加時機是在細胞生長週. 並繼續培養 2 週後，提高柴胡皂苷之生產。. 期中的快速生長後期 (late log phase) 或生長靜. 表 2 結果顯示 500 mg/L YE 處理 1 週後柴胡. 止前期 (early stationary phase)，可減少對細胞. 皂苷含量為 0.18 mg/g，而圖 4 結果顯示在同. 生長的影響；此外添加誘引劑的劑量與處理時間對於二次代謝物形成也極為重要 (Lu et al.. 樣處理時間下之柴胡皂苷含量可達 0.45 mg/g；根據本研究之接種試驗方法與結果顯示，有可. 2000; Wang et al. 2001)。Chen & Chen (2000). 能導因於不同容積大小之培養容器，但此推論. 研究指出，生長快速之丹參細胞系僅含有少. 仍需進一步研究證實。此外，由於 500 mg/L. 量丹參酮，但是當此細胞系培養於含 YE 的培. YE 處理 2 週後之懸浮細胞已呈現褐化現象，因. 養基後則可大量形成丹參酮，於是建議以兩. 此未能持續觀察後續柴胡皂苷累積結果 (圖 4)。. 階段培養 (two-stage cultural process) 方式進行丹參酮大量生產。然而 Lu et al. (2001) 研究指. 例子，然實際應用於商業化生產者卻寥寥可. 出，0–3 g/L YE 於細胞培養之第 1 天即加入，. 屬，其中有效成分之經濟價值固然是影響能否. 對人參細胞生長並無顯著影響，但在細胞培養. 商業化的主要原因之一，然而植物細胞的低增. 達 5、10 及 15 天後再加入 YE，其細胞生長. 殖率以及有效成分過低則是需要克服的技術. 藥用植物建立細胞懸浮培養系統已有眾多. 情形均較接種時即加入 YE 之處理為差，MJ. 問題。許多研究報告指出，藉由分化器官培養. 處理也有相似的趨勢。本研究結果顯示 YE、. (differentiated organ culture)、細胞固定化培養. JA 及 ABA 此三種誘引劑處理均會抑制高氏. (immobilized cell culture) 與應用生物反應器 (bio-. 柴胡懸浮細胞生長增殖，其中以 YE 處理對細胞生長的影響較輕微，而 JA 及 ABA 處理. reactor) 生產技術，均是達成增產目標的有效方法 (Gao et al. 2001; Tripathi & Tripathi 2003)。本. 對高氏柴胡細胞生長有較大抑制作用 (表 1)；. 研究結果顯示，雖然藉由目前懸浮細胞培養系. 若以柴胡皂苷 SSa 與 SSd 之加總含量來看，. 統所得之柴胡皂苷含量現階段仍屬偏低，但未. 顯示三種誘引劑之處理效果相當，且均高於. 來可經由篩選高產細胞系及優化培養條件，以. 對照組；但以成分產量而言，則 YE 與 ABA. 及誘引劑選擇、處理時機與時間等技術及配合. 處理效果相當，均較 JA 處理為佳，三種誘. 培養操作策略，加上利用生物反應器大量培養. 引劑處理組之柴胡皂苷產量均高於對照組，. 生產之優點，應有助於利用細胞培養生產柴胡. 顯示三種誘引劑雖然對細胞之生長有影響，. 皂苷系統之實用性，此一模式的建立亦可作為. 但均能促進及提高柴胡皂苷之累積 (表 2)。. 其他重要藥用植物相關研究之參考依據。.

(10) 誘引劑與柴胡皂苷含量 121. 誌謝本研究承虎尾科技大學石麗仙博士對於 HPLC 成分分析相關技術之協助，特此申謝。. 引用文獻 (Literature cited) Baldi, A. and V. K. Dixit. 2008. Yield enhancement strategies for artemisinin production by suspension cultures of Artemisia annua. Bioresource Technol. 99:4609–4614. Chang, W. D., C. C. Chen, Y. S. Chang, and H. S. Tsay. 1993. Study on tissue culture of Angelica dahurica var formosana I. callus induction and medium evaluation. Jour. Agric. Res. China. 42:253–264. (in Chinese with English abstract) Chang, S. H., C. K. Ho, and J. Y. Tsay. 2004. Cell cultures and taxane production of Taxus mairei. Taiwan J. For. Sci. 19:43–52. (in Chinese with English abstract) Chen, U. C., F. S. Chueh, C. N. Hsia, M. S. Yeh, and H. S. Tsay. 2005. Influence of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on leaf callus induction, proliferation and saikosaponin formation of in vitro Bupleurum kaoi Liu, Chao et Chuang. Crop Environ. Bioin. 2:39–49. (in Chinese with English abstract) Chen, U. C., C. N. Hsia, M. S. Yeh, C. Y. Tsao, and H. S. Tsay. 2008. Influence of medium components on callus proliferation and saikosaponin content of Bupleurum kaoi. J. Taiwan Agric. Res. 57:119– 132. (in Chinese with English abstract) Chen, H. and F. Chen. 2000. Effect of yeast elicitor on the secondary metabolism of Ti-transformed Salvia miltiorrhiza cell suspension cultures. Plant Cell Rep. 19:710–717. Cheng, Y. L., S. C. Lee, S. Z. Lin, W. L. Chang, Y. L. Chen, N. M. Tsai, Y. C. Liu, C. Tzao, D. S. Yu, and H. J. Harn. 2005. Anti-proliferative activity of Bupleurum scorzonerifolium in A549 human lung cancer cell in vitro and in vivo. Cancer Lett. 222:183–193. Cho, H. Y., S. Y. Son, H. S. Rhee, S. Y. Yoon, C. W. Lee-Parsons, and J. M. Park. 2008. Synergistic effects of sequential treatment with methyl jasmonate, salicylic acid and yeast extract on benzophenanthridine alkaloid accumulation and protein expression in Eschscholtzia californica suspension cultures. J. Biotechnol. 135:117–122.. Chueh, F. S., C. C. Chen, A. P. Sagare, and H. S. Tsay. 2000. Quantitative determination of secoiridoid glucosides in in vitro propagated plants of Gentiana davidii var. formosana by high performance liquid chromatography. Planta Med. 66:1–4. Fulzele, D. P., R. K. Satdive, and B. B. Pol. 2001. Growth and production of camptothecin by cell suspension cultures of Nothapodytes foetida. Planta Med. 67:150–152. Gan, W. S. 1985. Bupleurum kaoi Liu, Chao et Chuang. p.651. in: Manual of Medicinal Plants in Taiwan (Gan, W. S., ed.). National Research Institute of Chinese Medicine. Taipei. 699 pp. (in Chinese) Gao, W., L. Fan, E. J. Hahn, and K. Y. Paek. 2001. Pigment and saikosaponin production through bioreactor culture of Carthamus tinctorius and Bupleurum falcatum. J. Plant Biotechnol. 3:1–5. Hsu, Y. L., P. L. Kuo, T. C. Weng, M. H. Yen, L. C. Chiang, and C. C. Lin. 2004. The antiproliferative activity of saponin-enriched fraction from Bupleurum kaoi is through fas-dependent apoptotic pathway in human non-small cell lung cancer A549 cells. Biol. Pharma. Bull. 27:1112–1115. Li, G. J., S. C. Wang, K. Xia, and X. Zhou. 2003. Effect of yeast elicitor and salicylic acid on the fluctuation of phytohormone contents in Ti-transformed Salvia miltiorrhiza cell cultures. Plant Growth Regul. 39:27–32. Lu, M. B., H. L. Wong, and W. L. Teng. 2000. Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of Panax ginseng. Plant Cell Rep. 20:674– 677. Mulabagal, V., C. Y. Lee, S. F. Lo, S. M. Nalawade, C. Y. Lin, and H. S. Tsay. 2004. Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures. Bot. Bull. Acad. Sin. 45:1–22. Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15:473–497. Nalawade, S. M., A. P. Sagare, C. Y. Lee, C. L. Kao, and H. S. Tsay. 2003. Studies on tissue culture of Chinese medicinal plant resources in Taiwan and their sustainable utilization. Bot. Bull. Acad. Sin. 44:79–98. Pan, S. L., Q. S. Shun, Q. M. Bo, and X. S. Bao. 2002. The Coloured Atlas of the Medicinal Plants from.

(11) 122. 台灣農業研究第 61 卷第 2 期. genus Bupleurum in China. Shanghai Scientific and Technical Literature Press. Shanghai. 148 pp. (in Chinese) Radman, R., T. Saez, C. Bucke, and T. Keshavarz. 2003. Elicitation of plants and microbial cell systems. Biotechnol. Appl. Biochem. 37:91–102. Tripathi, L. and J. N. Tripathi. 2003. Role of biotechnology in medicinal plants. Trop. J. Pharm. Res. 2:243–253. Wang, B. J., C. T. Liu, C. Y. Tseng, C. P. Wu, and Z. R. Yu. 2004. Hepatoprotective and antioxidant effect of Bupleurum kaoi Liu (Chao et Chuang) extract and its fractions fractionated using supercritical. CO2 on CCl4-induced liver damage. Food Chem. Toxicol. 42:609–617. Wang, C., J. Wu, and X. Mei. 2001. Enhancement of taxol production and excretion in Taxus chinensis cell culture by fungal elicitation and medium renewal. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55:404–410. Yen, M. H., T. C. Weng, S. Y. Liu, C. Y. Chai, and C. C. Lin. 2005. The hepatoprotective effect of Bupleurum kaoi, an endemic plant to Taiwan, against dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in rats. Biol. Pharm. Bull. 28:442–448..

(12) 誘引劑與柴胡皂苷含量 123. Influence of Elicitors on Cell Proliferation and Saikosaponin Production of Bupleurum kaoi in Suspension Culture1 Uei-Chern Chen2, Chi-Ni Hsia2, Mau-Shing Yeh3, Chin-Yi Tsao2, and Hsin-Sheng Tsay4, 5 Abstract Chen, U. C., C. N. Hsia, M. S. Yeh, C. Y. Tsao, and H. S. Tsay. 2012. Influence of elicitors on cell proliferation and saikosaponin production of Bupleurum kaoi in suspension culture. J. Taiwan Agric. Res. 61:112−123.. Bupleurum kaoi, a native medicinal plant in Taiwan which contains saikosaponins higher than other commercial Bupleurum species, was chosen for producing saikosaponins in vitro. Cell suspension cultures of B. kaoi were cultured in a half-strength MS liquid medium containing 0.2 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and used for studying effect of speed of shaker, size of flasks and inoculum density on cell proliferation as well as studying effect of elicitors, yeast extract (YE), abscisic acid (ABA), and jasmonic acid (JA), on saikosaponin production. Results showed that cell proliferation of B. kaoi in suspension cultures was higher using shaker speed at 80 rpm than that of 100 rpm with peak period of cell growth at 3−4 weeks. Cell proliferation of B. kaoi was also affected by inoculum density and flask size, with the optimum inoculum density of 12% by adding 6 mL packed cell volume (PCV) cultures in 250-mL flasks. Three elicitors (YE, ABA, and JA) tested in 3-week-old suspension cultures of B. kaoi were found reducing cell fresh weight and dry weight significantly. However, one week after the treatments of elicitors, saikosaponin contents and its productivity increased 1.9−2.0 folds and 1.6−1.8 folds, respectively. Further study using 500 mg/L YE as elicitor in cultures of B. kaoi for two weeks, similar increasing tendency on saikosaponin contents and its productivity was found with 2.1-fold and 2.8-fold, respectively. This study concludes that adding 500 mg/L YE into cell suspension cultures of B. kaoi after the lag phase of cell cycle for one to two weeks would not reduce cell growth but increase saikosaponin production. Key Words: Bupleurum kaoi, Medicinal plant, Cell suspension culture, Saikosaponin, Elicitor.. 1. Contribution No. 2666 from Taiwan Agricultural Research Institute (TARI), Council of Agriculture. Accepted: May 24, 2012. 2. Respectively, Assistant Researcher, Researcher, Assistant Researcher, Biotechnology Division, TARI, Taichung, Taiwan, ROC. 3. Professor, Department of Agronomy, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan, ROC. 4. Professor, Graduate Institute of Biotechnology, Chaoyang University of Technology, Taichung, Taiwan, ROC. 5. Corresponding author, E-mail: [email protected]; Fax: (04)23304921..

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