行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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對小鼠大部分肝臟血流阻斷後肝臟卵圓細胞的活化現象
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Activation of hepatic oval cell after ligation of major
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hepatic vascular inflow in mice
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計畫類別：■個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號： NSC 89- 2314- B- 002- 436
執行期間： 89 年 8 月 1 日 至 90 年 7 月 31 日
計畫主持人：袁瑞晃 國立台灣大學醫學院外科部
共同主持人：陳惠玲 國立台灣大學醫學院附設醫院肝炎中心
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立台灣大學醫學院外科部
中
華
民
國
89 年
10 月 24
日
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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
對小鼠大部分肝臟血流阻斷後肝臟卵圓細胞的活化現象
Activation of hepatic oval cell after ligation of major hepatic
vascular inflow in mice
計畫編號：NSC 89-2314-B-002-436
執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
主持人：袁瑞晃 國立台灣大學醫學院外科部
共同主持人：陳惠玲 國立台灣大學醫學院附設醫院肝炎中心
一、中文摘要 肝臟是人體中極為重要的器官，但是 肝臟的疾病如 B 型肝炎、C 型肝炎、肝硬 化、肝癌等向來是東方人尤其是中國人健 康極大的問題，肝臟疾病末期病人往往令 人束手無策，近年來雖然可以進行肝臟移 植，但由於捐贈者不多因此受益者有限， 因此希望可發展出新的技術以照顧肝臟疾 病末期病患。 在許多的研究發現肝臟有很強的再生 作用，切除百分之七十左右的肝臟也可以 再生，以往分離出肝細胞雖然可以加以培 養，但數代之後肝細胞便呈現老化現象無 法長期培養，因此尋找肝臟幹細胞也就是 所謂的卵圓細胞便顯的非常重要。由於目 前實驗所知對於肝臟的再生作用主要都是 原本存在的成熟肝細胞分裂所產生，而 Acetylaminofluorene (AAF)可以在肝臟中 被肝細胞代謝成有毒性的 N-hydroxy 衍生 物，抑制成熟肝細胞的生長分裂，因而本 實驗希望探討除了阻斷大部分肝臟血流造 成肝細胞大量喪失後（阻斷肝臟血流的方 式是保留供給右葉之肝動脈及門靜脈，而 將肝臟中葉以及左葉的血流完全阻斷，由 先驅研究知道其相當於百分之七十左右的 肝臟切除），再藉由此藥物抑制肝成熟臟 細胞的再生作用，進而刺激肝臟卵圓細胞 的大量活化。 本實驗將小鼠任意分成四組，第一組 (V-group)不給 AAF 而只經由手術綁掉血 管；第二組(AV-L-group)術前五天開始餵低 劑量 AAF (5mg/kg)，綁完血管後繼續餵食 AAF 直到犧牲；第三組(AV-H-group)術前 五天開始餵高劑量 AAF (7.5mg/kg)，綁完 血管後繼續餵食 AAF 直到犧牲；第四組 (C-group)為控制組，只進行 Sham operation，不餵食 AAF 也不綁掉血管。各 組小鼠在分別術後第三、五、七、九及十 四天時犧牲，取其肝臟作分析。 至於肝臟細胞再生能力的分析是利用 BrdU incorporation 方式，而 cytokeratin18, cytokeratin19, cytokeratin7, Thy-1 的測定則 用以分析肝臟卵圓細胞的活化現象。 關鍵詞：肝臟血流阻斷、肝臟卵圓細胞、 cytokeratin、Thy-1Abstract
Liver is a very important visceral organ for the life. In the oriental country, especially in China and Taiwan, hepatic disease
including hepatitis and liver cirrhosis is common and plays an important role in the health problem. For patients with end-staged liver disease, nothing can be done except liver transplantation. It’s not easy to have a
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donor suitable for the recipient from time to time and further new ways for this problem is required in the near future.
The liver is usually able to mount a prompt proliferative response to parenchymal loss and other hyperplastic stimuli. Following 70% partial hepatectomy in the rat,
hepatocyte proliferation is greatly accelerated for a relatively short period while the deficit in hepatocyte number is replaced. Even though primary culture of the hepatocytes had been done for years the proliferative ability and viability decreased after several generations. So further researches for the hepatic stem cells that can be cultured for a long period and have the ability to
differentiate to mature hepatocytes become more and more important. The principle in animal model is that when majority of the hepatic parenchyma is damaged, the ability of surviving hepatocytes can be regenerated quickly without activation of hepatic stem cells (oval cells). Further hepatic insult that inhibits hepatocyte regeneration is required for activation of oval cells.
Acetylaminofluorene (AAF), an aromatic amine, can be metabolized in hepatocytes and resulted in N-hydroxy derivatives which was cytotoxic and mitoinhibitory for hepatocytes but not biliary cells or oval cells. The purpose of this study is to evaluate the additional effect of major hepatic vascular ligation (ligation of the vascular inflow to the middle and left lobes and preserve the right lobe only, that equal to about 70% partial hepatectomy in our preliminary study) and hepatotoxic agent administration in activation of hepatic oval cells.
Animals were randomly assigned to four different groups. Mice receiving vascular
occlusion only (V-group); mice receiving low dose (5mg/kg) of AAF and vascular ligation (AV-L-group); mice receiving high dose (7.5mg/kg) of AAF and vascular ligation (AV-H-group); and control group (C-group). AAF was given continuously until the mouse was sacrificed in all groups. After various time intervals (3, 5, 7, 9, 14 days)
postoperatively, the mice were sacrificed and the liver was taken for further studies.
BrdU incorporation with BrdU-FLUOS kit was used for regeneration evaluation and immunohistochemical studies about the cytokeratin18, cytokeratin19, cytokeratin7, Thy-1, were used to evaluate the activation of hepatic oval cell.
Keywords: hepatic vascular inflow ligation, hepatic oval cell, cytokeratin、Thy-1 二、緣由與目的 器官移植如腎臟移植、肝臟移植、心 臟移植，一直是器官功能末期病人疾病存 活所仰賴的主流，但是由於器官的來源非 常有限，許多病人無法度過等待器官期而 失去生命。腎臟衰竭病人可以利用洗腎機 度過等待期，心臟衰竭病人則可暫時利用 人工心臟輔助失去的功能，只有肝臟則因 其功能複雜，困難度更高而無法完全克 服，雖然有報告利用活體近親捐贈部分肝 臟以克服肝臟器官來源不易的現象，但畢 竟來源也有限，而且捐贈者仍須冒手術的 危險，並非長久之計。近年來醫學界雖然 致力於人工肝臟的製造，但是成果到目前 還是不顯著，因此一些學者便導入細胞移 植(Cell transplantation)以及肝臟細胞再殖 民(Hepatocyte repopulation)1 的觀念，希望 以此概念可以克服肝臟器官移植捐贈者不 足的缺點。 目前的報告有利用培養後的肝細胞進 行細胞移植，因此要進行肝臟細胞移植首 先要做的是就是肝臟細胞的培養，但是目
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前對於肝臟細胞培養最大的問題就在於培 養的代數有限，且肝細胞經過數代分裂後 便呈現老化現象，也就是說正常肝細胞無 法如同肝癌細胞可以形成細胞株(Cell line) 而長期培養，隨時可以得到需要的細胞。 因此尋找肝細胞的前趨細胞(Progenitor cells)並進行培養便顯得很重要。 本實驗所使用的 Acetylaminofluorene (AAF)為芳香族胺類化學劑，可以經由肝臟 細胞代謝成具有細胞毒性的分裂抑制劑 N-hydroxy derivative。由於肝臟細胞中所富 含的 phase I metabolic enzyme 為代謝 AAF 的重要酵素，但在膽管細胞以及卵圓細胞 中主要含的是 phase II enzymes，而 phase I enzyme 的含量很低，因此食物中加入 AAF 會造成肝臟細胞在肝臟受到其它損傷時喪 失再生能力，而相對的卵圓細胞因沒被抑 制而可以再生，因此理論上肝臟組織中的 幹細胞就會被大量的活化，在所有肝臟內 細胞所佔的百分比就會明顯增加。 設計此研究計畫的目的是： 1. 建立小鼠肝臟再生的實驗模式 2. 建立活化小鼠肝臟幹細胞（卵圓細胞） 的研究模式 3. 評估肝臟大部分血流阻斷後肝臟卵圓 細胞活化的情況 4. 評估不同劑量的 AAF 對肝臟幹細胞刺 激作用的差別 5. 評估血流阻斷及藥物抑制對於小鼠肝 臟卵圓細胞活化是否有加成作用 6. 探討小鼠肝臟卵圓細胞於肝臟再生組 織中所在的位置 7. 評估各種因子表現與肝臟卵圓細胞以 及肝臟再生間的相互關係 本實驗最終目的就是尋找能夠刺激小 鼠肝臟產生多量肝臟幹細胞的方法，建立 往後培養肝臟幹細胞的基礎，為將來進行 肝臟的再殖民的研究建立基礎。 三、結果與討論 第一組 (V-group)不給 AAF，而只經由 手術綁掉血管，相當於切除百分之七十的 肝臟，雖然可以見到明顯的肝細胞再生， 但沒有膽管增生現象。第二組(AV-L-group) 餵食低劑量 AAF (5mg/kg)從第三天即可以 見到在 Periportal area 開始有膽管的增生現 象，到第七天時膽管增生更加明顯，並且 有朝向中央靜脈區域擴張的頃向。但到了 第十四天此種現象反而較不明顯，殘餘的 膽管增生分散在 periportal 以及中央靜脈區 域之間。利用免疫組織化學染色可在此些 膽管細胞發現 cytokeratin 7、18 及 19，而 Thy-1 則於九天後才開始較明顯。第三組 (AV-H-group)餵食高劑量 AAF (7.5mg/kg) 第三天可以見到較明顯的膽管增生現象， 到第七天時膽管增生且有分支並朝向中央 靜脈區域明顯擴張。到了第十四天此種現 象仍然持續，利用免疫組織化學染色同樣 可在此些膽管細胞發現 cytokeratin 7、18 及 19。而 Thy-1 從五天起就可以見到，且 到十四天仍然可以見到。此種膽管再生除 了膽管數量增加外，由於增生方向會朝向 中央靜脈區域，因此在切片中有時候會像 膽管細胞週遭圍繞著肝細胞，此外此種膽 管再生細胞可以明顯見到細胞核呈現卵圓 形，和原有的膽管細胞有極大的差別。利 用 BrdU incorporation 發現上兩組在七天時 染色侷限於膽管細胞，都沒有肝臟細胞的 再生。於十四天時第二組有一些肝細胞再 生現象但第三組則仍然沒有明顯肝細胞再 生。第四組 (C-group)為控制組，只進行 Sham operation 並沒有餵食 AAF 也沒有切 除肝臟，在肝臟組織中並沒有見到膽管增 生，也沒有肝臟細胞再生現象。 近年來醫學界的研究著重於肝臟器官 移植以及人工肝臟的製造，肝臟器官移植 雖然可以進行部分肝臟移植但仍侷限於捐 贈者不足，人工肝臟的製造雖然也有進步 但是成果到目前還是不顯著。因此一些學 者 便 導 入 另 一 種 新 的 細 胞 移 植 (Cell transplantation) 以 及 肝 臟 細 胞 再 殖 民 (Hepatocyte repopulation)1的觀念，希望以 此概念可以克服肝臟器官移植中捐贈者不 足的缺點。 正常肝臟中肝細胞的翻新主要是由成 熟肝細胞所執行，肝臟具有很強的再生能 力，根據研究，正常肝臟切除三分之二後
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剩餘肝臟的成熟肝細胞在 15 小時後會離開 G0 期進入 S 期開始合成 DNA 2,3,4，其中又 以位於門脈周圍的肝臟細胞率先進入 S 期 5，並在數天內加速分裂直到肝臟重量回到 原先般大小6。同樣的膽管上皮細胞也可在 肝臟切除後 18 到 24 小時開始分裂產生新 生膽管7。肝臟再生除了由原先存在的成熟 肝細胞分裂產生---稱為代償性增生 (compensatory hyperplasia)外也可由幹細胞 (stem cell)產生---稱為卵圓細胞反應 (oval cell reaction)8。此卵圓細胞直徑約 3-5μ m，比小膽管細胞更小(6μm)9。早在 1958 年就有報告卵圓細胞或稱小膽管細胞 (cholangioles)，可以分化成成熟肝細胞10， 目前也有許多報告證實此觀點11, 12, 13。此 外更有報告認為卵圓細胞可以分化成腸胃 道幹細胞14、杯狀細胞(goblet cells)15、內 分泌細胞及 Paneth 氏細胞16, 17、甚至心肌 細胞18，且其具有及高的生長潛力19。至 於卵圓細胞的來源則被認為是由膽管細胞 分裂增生而來20，此外也有報告認為卵圓 細胞和主細胞（mast cell）、白血球細胞 （leukocyte）及造血細胞（hematopoietic cell）都可表現 stem cell factor 的接受器 c-kit21。 目前研究肝臟幹細胞的動物模式主要 為餵食 furan22、或餵食 dipin23 ，主要目的 是使存在的肝細胞喪失再生能力，此外餵 食 choline-deficient ethionine-containing (CDE) 的食物也可以誘導出膽管細胞的增 生24。本實驗所使用的 Acetylaminofluorene (AAF)為芳香族胺類化學劑，可以經由肝臟 細胞代謝成具有細胞毒性的分裂抑制劑 N-hydroxy derivative。由於肝臟細胞中所富 含的 phase I metabolic enzyme 為代謝 AAF 的重要酵素，但在膽管細胞以及卵圓細胞 中主要含的是 phase II enzymes，而 phase I enzyme 的含量很低，因此食物中加入 AAF 會造成肝臟細胞在肝臟受到其它損傷時喪 失再生能力11，而相對的卵圓細胞因沒被 抑制而可以再生，因此理論上肝臟組織中 的幹細胞就會被大量的活化，在所有肝臟 內細胞所佔的百分比就會明顯增加。 在此研究中發現雖然阻斷百分之七十 的肝臟血流，相當於切除百分之七十的肝 臟組織，使肝臟喪失大部分的細胞仍然無 法促使肝臟幹細胞(卵圓細胞)活化，而必須 加上藥物的作用抑制原有肝臟成熟細胞的 再生。此外，低劑量的 AAF 雖然可以刺激 卵圓細胞的再生，但其作用較短無法持續 則實用性相對較低。而高劑量的 AAF 所造 成的卵圓細胞活化作用產生較早，所產生 的卵圓細胞數量也比低劑量時多，且作用 持續較久，因此適合將來要由小鼠中分離 卵圓細胞進行肝臟幹細胞培養甚至肝細胞 移植提供了新的方向。 四、計畫成果自評 由此研究我們建立了小鼠肝臟幹細胞 的實驗動物模式，經由大部分肝臟血流的 阻斷加上藥物抑制肝臟細胞再生成功的活 化了肝臟的幹細胞-卵圓細胞。此提供培養 中的肝臟細胞老化問題另一解決的途徑。 此研究較不足的是，進行大部分肝臟血流 的阻斷後壞死的肝臟仍然留置在體內，雖 然我們前驅實驗看到，只保留肝臟右葉血 流而結紮中葉及左葉血流造成大部分的肝 臟細胞壞死後的小鼠，不但可以存活而且 剩餘肝臟有明顯再生現象，但壞死組織所 造成的影響無法預料。小鼠的手術困難度 雖然較高，但目前我們已經可以進行小鼠 百分之七十以及百分之九十以上的肝臟切 除手術，因此利用百分之七十的切除加上 AAF 抑制作用將是另一步的發展。百分之 九十以上的肝臟切除雖然造成高的小鼠死 亡率，但活化肝臟卵圓細胞的能力也是直 得探討的。此外較不足的是，Cytokeratin 19 的免疫組織化學染色遭遇到較大的困難， 原先生產者已經中斷生產，因此必須另謀 來源，耗費許多。 雖然在此研究中我們成功的活化了肝 臟卵圓細胞，但將來必須對於此細胞的特 性加以研究，對此細胞的分離以及培養也 需繼續進行，期望不久的將來可以進行肝
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臟幹細胞的移植。 五、參考文獻
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