Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4174
124
0
0
全文
(2) 致 謝 猶記得懷著忐忑的心進入校園，怎的一轉眼就將要離開。首先感謝 台北醫學大學圓了我研究所夢，我珍惜重回校園當學生的經驗、感覺真 好! 兩年的研究生訓練感謝指導教授 何元順博士亦師亦友般的信任與 體諒，接受學生在服務單位完成檢體之採集及實驗，以有限的時間達到 最高的效益，並適時指點臨床應用之無限可能，學生受益匪淺。 多蒙口試委員台灣大學醫學檢驗暨生物技術研究高全良副教授、台 北醫學大學醫學檢驗暨生物技術研究李宏謨所長對於論文內容細心審 查與指正。對於醫檢師全聯會張來發理事長及三軍總醫院臨床病理科張 錦標技術主任，您是我邁向研究所之路的幕後推手。謝謝您! 更感謝亞東紀念醫院院內計畫(FEMH-93-C–033)提供所有研究經 費。病理科主任蔡建誠醫師、臨床病理科主任朱芳業醫師的專業指導， 器官移植小組陳國鋅醫師、血清室吳宗盈組長、美欣、怡芳的協助，使 計劃得以順利完成。 最後，由衷的感謝家人的體諒與配合，讓我無後顧之憂，尤其親愛 的老公除負責上學時的專車接送外，還包括電腦軟體操作及硬體設施等 的技術支援。這份得來不易的喜悅將與所有關心我的家人、朋友及同事 共同分享. I.
(3) 中文摘要 論文名稱︰探討PRA預測國人移植後排斥反應、病患存活率的相關性 研究所名稱:台北醫學大學醫學檢驗生物技術暨研究所 研究生姓名:湯惠斐 畢業時間:九十五學年度第二學期 指導教授:何元順 博士 (台北醫學大學醫學檢驗生物技術暨研究所 教授). 人類白血球抗原（Human Leukocyte Antigen）HLA組織相容基因檢 測及抗體篩選是移植手術前實驗室重要的工作。器官移植研究中證實， 在移植後HLA抗體的發展是反覆而持續的，有許多報告已經建議 HLA 抗 體的存在與移植後器官存活有密切關係。而且，在移植前群組反應性抗 體 Panel Reactive Antibody（PRA）的存在；與手術後產生排斥的機率 及發生移植失敗結果有相關。這項研究將檢測群組反應性抗體，調查於 移植手術前及術後持續反應預測異體器官移植失敗之間的相互關係。材 料和方法︰持續追蹤從2004年10月到2007年4月，所有的器官移植接受 者。於術前及術後每隔一個月連續收集血清冷凍保存。所有血清使用 ELISA固相免疫分析法檢測 PRA，使用chi square 或Fisher exact test精 確的比較差別變項。當 P值<0.05表示具統計顯著差異。結果︰44位移 植病患中有27位男性和17個女性，43.6 (19-66歲)的平均的年齡。所有患 者一年存活率81.1%。手術前PRA陽性檢測率(16.2%)，失敗率為57.1% (4/7)，相對於術前PRA陰性患者術後失敗率13.3% (4/30)。統計 II.
(4) p=0.024(p<0.05)。移植手術後PRA陽性共6位，失敗率為83.3% (5/6)，手 術後PRA陰性患者器官失敗率為9.7% (3/31)，統計其p=0.0007(p<0.05) 討論：實驗結果顯示器官（心臟、腎臟）異體移植之失敗與PRA的存在 之間有重要的相互關係(p<0.05)。各移植中心於移植手術前篩檢PRA陽 性病患，移植後定期監測PRA反應及生化指標性檢查之變化，可以早期 預測移植後排斥反應，是監控穩定的器官移植演化的一種有用的方法。 因受限於時間有限及個案數量太少涉及長期的器官異體移植失敗很多 免疫學和非免疫學元素，及各種免疫抑制之使用，都可能導致排除PRA 反應預測移植失敗的協定，需要更多移植個案和更長時間的後續行動證 明。. III.
(5) Abstract . Title of Thesis: Correlation of rejection and survival rate on organ post-transplantation in Taiwan by panel reactive antibody detection Author: Hui-Fei Tang Thesis advised by: Yuan-Soon Ho, Ph.D (Professor, School of Medical Laboratory Science and Biotechnology, College of Medicine, Taipei Medical University). The development of antibodies to human leukocyte antigens (HLA) after transplantation verified ongoing reactivity against the transplant, the presence of HLA antibodies correlates with poor graft survival. The presence of HLA antibodies prior to transplantation has been linked to worse post-transplant outcomes in many solid organ transplants. This study was to investigate the relationship between organ allograft failure and pre-transplantation panel reactive antibody (PRA) reactivity. METHODS: From October 2004 to Aril 2007, a total of 44subjects were enrolled. There were 27 males and 17 females, with a mean age of 43.6 years (range 19 -66). Organ allograft recipients were enrolled. PRA was determined in batch using a commercially available kit. Categorical variables were compared using chi square or Fisher exact test as appropriate. A p value less than 0.05 was considered statistically significant. RESULTS: Of all, one-year graft survival rate was 81.1%, and 7 (16.2%) had positive PRA tests before transplantation. One-year graft failure rate was 57.1% (4/7) for those with IV.
(6) pre-transplantation PRA positivity and 13.3% (4/30) for those having pre-transplantation PRA negativity, p value was 0.024 (p<0.05). Graft failure rate was 83.3% (1/6) for those with post-transplantation PRA positivity and 9.7% (3/31) for those having post-transplantation PRA negativity, p value was 0.0007 (p<0.05). There was a significant correlation between renal allograft failure and the presence of PRA. CONCLUSIONS: PRA reactivity was significantly associated with one-year graft failure (p<0.05). Our results suggest that a routine post-transplant AHG-PRA test offers an early risk assessment of rejection episodes and may be a useful method for monitoring the solid organ transplant evolution. The limited case numbers and time of follow-up precludes confirming the association of pre-transplantation PRA and allograft failure. Furthermore, many immunologic and nonimmunologic factors, other than PRA, are involved in long-term kidney allograft failure. To enroll more case and longer follow-up are needed.. V.
(7) 目錄 致. 謝 ........................................................................................... I . 中文摘要 ........................................................................................II Abstract ......................................................................................... IV 目錄 .............................................................................................. VI 圖表目錄 ...................................................................................... IX 縮寫表 ........................................................................................... X 第一章. 緒論 .............................................................................. 1 . 壹、概說 ................................................................................................ 1 貳、抗 HLA 抗體篩選在器官移植中的意義： .................................... 4 . 第二章 文獻探討 ........................................................................ 7 壹、器官移植 Organ transplant ............................................................ 7 貳、移植的種類： ................................................................................ 7 叁、主要受移植的器官及組織（Major organs and tissues transplanted） ....................................................................................... 8 肆、捐贈者種類： ................................................................................ 8 伍、移植之重要里程碑： .................................................................... 9 陸、HLA 的臨床意義(人類白血球抗原 Human Leukocyte Antigen) . 10 柒、排斥反應 ...................................................................................... 17 VI.
(8) 捌：排斥反應的種類： ...................................................................... 22 玖：免疫抑制藥物： .......................................................................... 26 拾：移植免疫學的檢查 ...................................................................... 27 拾壹；研究目的 .................................................................................. 37 . 第三章. 研究方法 .................................................................... 39 . 壹、病患收集 ...................................................................................... 39 貳、檢體採集保存 .............................................................................. 40 叁、檢測方法 ...................................................................................... 41 肆、統計分析 ...................................................................................... 49 . 第四章. 分析與結果 ................................................................ 50 . 壹、樣本資料分析： .......................................................................... 50 貳、HLA 抗原分型檢查 ..................................................................... 51 叁、交叉試驗 Cytotoxic donor crossmatches .................................... 51 肆、HLA 抗體篩檢 ............................................................................. 52 伍、病理切片結果 .............................................................................. 53 陸、血清 creatinine 濃度分析 ............................................................ 55 . 第五章. 討論 ............................................................................ 56 . 壹、PRA 檢測與移植器官存活相關性 ............................................... 56 貳、PRA 與細胞性排斥 ...................................................................... 57 叁、HLA 抗原分佈頻率與抗體產生 ................................................... 59 肆、HLA 配對檢驗 .............................................................................. 59 . 第六章. 結論與建議 ................................................................ 66 . 參考文獻 ...................................................................................... 87 VII.
(9) 附錄 ............................................................................................ 102 壹、心臟移植分配原則： ................................................................ 102 貳、腎臟移植分配原則： ................................................................ 105 叁、HLA 組織抗原符合配對定義表(HLA Mismatch Definitions) ..... 109 肆、研究受試者說明同意書 ............................................................ 110 . VIII.
(10) 圖表目錄 圖：3-1 研究方法與流程 .......................................................................................... 71 圖：3‐2 ASHI 的判分標準 .......................................................................................... 72 圖：4‐1 比較器官移植前男女性別間 PRA 陽性率之差異 ......................... 76 圖：4‐2 Graft survival of transplantation organ type ................................... 77 圖：4‐3 Correlations of 1 year survival with CDC crossmatch .................. 79 圖：4-4 PRA predictate survival rate .................................................................. 80 圖：4‐5 移植器官接受者（A 群功能失敗）病理切片結果與血清 creatinine、PRA 之變化 ................................................................ 83 圖：4‐6 C4d 染色應用於體液性排斥之診斷： ................................................ 84 圖：4‐7 器官移植接受者（B 群功能正常）病理切片結果與血清 creatinine、PRA 之變化 ................................................................ 85 表：3‐1 HLA 分型結果判讀表 ................................................................................ 73 表：3‐2 T cell 與 B cell 在淋巴球磁珠盤稀釋圖例 ...................................... 74 表：4‐1 器官移植基本資料 ..................................................................................... 75 表：4‐2 接受者年齡與捐贈者種類及組織配對之一年存活比較 ............ 78 表：4‐3 PRA 預測移植器官存活之比較 .............................................................. 81 表：4‐4 檢測 PRA 百分比及 HLA 抗體分佈 .................................................... 82 表：4‐5 血清 creatinine 濃度與器官功能之差異性 ..................................... 86 . IX.
(11) 縮寫表 ACR. Acute cellular Rejection. AHR. Acute humal rejection. AMR. Antibody-mediated rejection. Anti-HBs B. Hepatitis B surface antibody. Anti- HBc. Hepatitis B core antibody. Anti-HCV. Anti hepatitis C antibody. ASHI. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics. AVR. Acute vascular rejection. C4d. Complement 4 deposition. CABG. Coronary artery bypass grafting surgery. CDC. Complement- dependent cytotoxicity. DGF. Delayed graft function. DSA. Donor-specific antibodies. ELISA. Enzyme linked immunoassay. HBV. Hepatitis B virus X.
(12) HBsAg. Hepatitis B surface antigen. HCV. Hepatitis C virus. HGR. Hyperacute graft rejection. MHC. Major histocompatibility system. HLA. Human leukocyte antigen. IVIg. Intravenous immunoglobulin. PRA. Panel reactive antibody. PCR-SSP. Polymerase chain reaction Sequence-specific Primer. PCR-SSOP. Polymerase chain reaction Sequence-specific oligonucleotide probe. RD FC PRA. Randomly selected donors flowcytometry panel reactive antibody. SBT. Sequence-based typing. TGF-β. Transforming growth factor-β. TCR. T cell receptor. UNOS. United Network of Organ Sharing. XI.
(13) 第一章 緒論 壹、概說 在中國的外科史上西元前300 年列子『湯問篇』就記載扁鵲的 心臟移植。本世紀初，由於血管吻合術的進步，開啟了外科醫生對 器官移植的興趣。就腎臟移植而言，西元1902年3月1日，奧國人 Ullman首次成功將一隻狗的一枚腎臟移植到頸部，並且順利排出尿 液；之後，他又將狗的腎臟移植到羊的身上，意外地，也排出少許 的尿液，可惜他沒有再繼續這方面的研究。 在(Akerman 1987)回顧移植歷史文獻中提到1905年法國醫生 Carrel突破血管吻合技術的瓶頸，在1912年因為對於血管以及器官 移植的研究，獲得諾貝爾生理學或醫學獎。1906年Jaboulay將猪或 羊的腎臟移植到尿毒症病人手臂的異種移植，但腎臟只發揮一小時 的功能。這些經驗因為一直無法克服失敗的命運，使得實驗的腎臟 移植漸漸沈寂下來。(Stefoni et al. 2004)的腎臟醫學文中說明西元 1933年烏克蘭的醫生Voronoy已利用輸血的血清定型方法首次完成 同種人體間腎臟移植，可惜沒有成功。 西元1953年法國醫生Michon(Michon et al. 1953)等則首次完成 活體親屬間腎臟移植,這枚腎臟發揮功能達二十二天之久。1954年哈 佛大學Murray等 (Murray et al. 2001)為首的移植小組則首次成功的 完成同卵雙生子間的腎臟移植，醫學界始認識到異體移植間可能牽 涉到器官彼此的「排斥」（rejection）現象，而「器官移植免疫學」 1.
(14) （transplantation immunology）概念始焉萌芽。由於爾後免疫學的發 展，目前已知人體有一套很完整的免疫辨識系統，存在於所有組織 的 細 胞 表 面 。 這 一 套 系 統 稱 為 「 主 要 組 織 相 容 系 統 」（ major histocompatibility system），用以辨別所有外來異物。移植的成功與 否，就決定於捐贈器官組織與受體間的主要組織相容系就是否相 配。負責這一組織符合系統的是細胞表面上的一系列蛋白質，「人 類白血球抗原」 （human leukocyte antigen，HLA） ，現已知其基因位 於第六對染色體上。這些基因在人與人間彼此互異，也成了免疫系 統辨識你我的標記，就像每人的身分証一樣。人體中負責執行這一 排斥任務的是T細胞淋巴球，當T細胞淋巴球發現外來的人類淋巴球 抗原蛋白，馬上就會受到激化，進而破壞移植體（graft）。同卵雙 生的攣生子因承襲相同的染色體，因此，人類淋巴球抗原系統也相 同，故彼此間的器官移植不會排斥。證實了組織適合性的重要， Murray也於1990年獲得諾貝爾醫學獎的榮譽。雖然腎臟衰竭謀末期 病患可能透過其他血液透析治療，但腎臟移植後生活品質的提升及 改善是一般最為接受的根本治療處理方法，因此，腎臟移植是除眼 角膜外，全球最經常進行的器官移植手術(Smith et al. 2006),腎臟移 植的進展也帶動了人體其他器官移植的進展，如第一次人類心臟移 植的技術自1964年James Hardy開始(Hardy et al. 1964)） ；肝、胰、肺 臟、骨髓等，其成功率也日益改善。 在國內臺灣是亞洲地區最早實施器官捐贈的國家，早在民國五 十七年，臺大李俊仁教授就完成臺灣第一例腎臟移植。1987年臺大 朱樹勳 (Chu et al. 1998)教授完成臺灣第一例心臟移植。如今技術更 2.
(15) 為成熟但移植後所產生的後遺症如器官排斥現象仍然存在。 尋找一個適合的器官作移植手術並不簡單，選擇一個適合的器 官使病患在移植後產生較少的排斥反應甚至能良好的恢復，對於整 個醫療團隊以及病患是一個極大的挑戰。捐贈者和受贈者必須血型 相容，無C型肝炎或C型肝炎相符合、無B型肝炎並進行HLA配對的 評估，才能達到良好移植術後恢復的目的。器官捐贈者及接受者之 組織分型：根據統計，組織型之配對與移植腎之存活率有相關性。 其吻合度越高者排斥之機會越小。其中以DR之吻合度最重要。其 次是B之吻合度。若A、B、DR共6個抗原完全吻合，則存活率最佳。 由於排斥反應是移植器官失敗的另一個主要原因，HLA抗原為 MHC中除了負責自體抗原呈現之外，並可與異體抗體起反應形成 HLA抗體。目前的研究結果顯示，HLA抗體產生的主要原因可歸納 為術前輸血、妊娠史和移植史三大類。鑑於術前輸血的整體致敏性 遠遠高於未輸血的受者。因此，無特殊情況，等腎受者目前是不主 張術前輸血的。妊娠是導致HLA抗體產生的原因之一，尤其對多產 婦，移植前檢測抗HLA抗體具有重要的臨床意義。 2002年ASHI Quarterly文獻中Alexender G等指出HLA抗體篩檢 可追縱病患器官移植後所產生的排斥反應情形。在心臟移植中， 15%-54%會產生HLA抗體，其中32%-55%會產生急性排斥反應， 22%-65%其移植物會被破壞而喪失功能。2006年R. N. Smith ((Smith et al. 2006))等,也強調檢測受者體內是否存在HLA抗體以及該抗體 的致敏程度，對於是否發生移植排斥、移植存活率的高低以及移植 3.
(16) 後的器官功能都有著不可忽視的重要性。由於抗體的波動性，應定 期檢測，一般每月檢測一次。尤其是對於首次移植失功、術前有輸 血史和妊娠史的受者，更應密切監測。因此，移植前除儘可能選擇 HLA相配好的捐贈者外接受者HLA抗體的篩檢也是不可或缺的檢 測。. 有鑑於器官移植以及移植後的排斥反應有高度的相關，因此 1997 Harmer,(Harmer et al. 1997)等提出說明：篩檢HLA抗體對移植 患者是重要且不可忽視的檢驗項目。2003年Crespo M (Crespo et al. 2003),等建議群組反應性抗體Panel reactive antibody（PRA）百分比 評估以及HLA配對為器官移植前的首要工作。而如何使病患術後適 應良好延長器官功能則必須要有完善的追蹤系統方能達到提高病 患生活品質的目的。. 貳、抗 HLA 抗體篩選在器官移植中的意義： 移植物體內含有高水準循環抗HLA抗體稱為：致敏。檢測抗體 的技術稱為PRA。根據抗體檢測程度的高低，分為未致敏 （PRA0~10%） 、輕度致敏（PRA>10~50%） 、中度致敏（PRA>50~80%） 和高度致敏（PRA>80%） 。近年來開展的PRA檢測為臨床提供了一 種可靠的預測排斥（特別是體液性排斥）反應的指標，雖然在器官 移植方面要在移植之前尋求合適的器官並做好HLA配對工作或PRA 百分比檢測似乎受到較多的限制，但手術後仍建議檢測患者的PRA 百分比以追蹤移植狀況並提供排斥反應的適當醫療。臨床上評估 PRA可利用complement- dependent cytotoxicity（CDC） 、使用流式細 4.
(17) 胞儀（Flow cytometric analysis）或是利用酵素連結免疫法（ELISA） 的模式得知。近來新增的檢驗還包括將附有HLA抗原的微珠與抗體 結合後用 (Luminex)分析法及DSA(Donor specific antibody)偵測法。. 移植後HLA抗體反應的監測及生化指標性檢查，有助於判斷機 體的免疫狀態，幫助調整免疫治療方案及指導免疫抑制劑的應用。 PRA為器官移植後追蹤的指標，Sureshkumar, K. K 等(Sureshkumar et al. 2007).2007建議器官移植後約有30%將發生抗體調節性排斥 (AMR)（Antibody-mediated rejection），其可由病患PRA反應程度 或DSA的產生配合組織切片C4d沈澱結果，可提高診斷抗體性排斥 的準確度。對發生抗體排斥情況時，可給予加強免疫抑制藥物的調 整如tacrolimus/mycophenolate的合併使用、IVIg（intravenous immunoglobulin） 、免疫吸附術（immunoadsorption）或血漿置換 術（plasmapheresis）降低血清creatinine濃度或降低HLA反應，避免 可能導致的移植器官的損害或功能障礙的情形發生。. 另外器官移植要獲得長期存活，慢性排斥是一大障礙。換言之， 解決了慢性排斥問題移植的長存活將會有一個飛躍。因此，積極預 防和及時處理慢性排斥反應至關重要。對病人來說，定期複查和隨 訪十分重要，這樣便於醫生能及時發現問題，觀察檢驗數據的變 化，重新審視免疫抑制藥方案是否合理，從而迅速處理慢性排斥。 也可使一部分病人移植器官功能不可逆轉的惡化變為可以逆轉，或 將慢性排斥的病理損害控制在最低限度，使病人存活時間延長。每 5.
(18) 一個器官移植成功是來之不易的；對病患而定期複查，才能確保移 植器官功能的持久、正常，而提供一個準確的診斷數據，維持器官 功能正常，善盡醫療資源是醫療人員努力的目標。. 由於預測器官移植之急性或慢性排斥之診斷及檢測並無本土性 的相關資料，本研究將利用設備較為簡單，成本較低但反應快速且 靈敏度高的ELISA方法定期檢測PRA反應，PRA陽性檢體再以PRA 之ID檢測，定量HLA抗體百分比，分析特異型HLA抗體，比對是否 有DSA的發生，追蹤PRA與移植病患存活率的關聯性並提供台灣器 官移植界參考依據。同時統計國人在器官移植手術前捐贈者與接受 者HLA抗原配對程度與移植後產生急性或慢性排斥的相關性。藉由 非侵入性方法監測血清中HLA抗體的產生，提供醫師早期術後排斥 反應之診斷，作為更改藥物或治療方法之依據，並提升PRA檢測於 臨床上的應用。. 6.
(19) 第二章 文獻探討 壹、器官移植 Organ transplant 移植手術是只由一處的細胞、組織或器官轉移到另一處。二十 世紀以來，隨著外科技術的轉變與改進，科學家開始嘗試將一個體 的器官或組織移植到另一個體上。移植手術可幫助器官衰竭的病患 因他人的器官捐贈而獲得新生命。器官捐贈人可能是活體捐贈或死 屍(cadaveric)捐贈。. 貳、移植的種類： 根據2005年國際組織器官捐贈概論（ National Survey of Organ and Tissue Donation Attitudes and Behaviors）移植可分為： 一、自體移植(autograft)： 指器官從一個體種入同一個體另個部位。（可能是被處理過的 過剩組織、再生組織、更多來自另一個體的組織如植皮skin grafts、靜脈摘錄vein extraction for CABG等） 二、isogenic/ syngenic graft： 指器官從同卵雙生之一植入另一個體。 三、同種移植(allograft)： 指器官由同種之間的移植如人跟人，猪跟猪。 四、異種移植(xenograft)： 指器官由異種之間的移植如人跟猪。 7.
(20) 五、分享移植（Split transplants） ： 指器官可分別移植給兩個接受者，但須特別注意年齡差異之影 響。 六、骨牌移植（Domino transplants） ： 當兩個肺為囊性纖維變性需要被進行替換時,通常同時替換心 臟和肺是在技術上是較容易的。若接受者當時的心臟是健康, 可將他自己的心臟移植給某個需要進行移植的接受者。這個條 件也用于一個肝的特殊形式移植,接受者受肝( 緩慢)地生產損 壞其他器官的蛋白質家族的amyloidotic polyneuropathy 之苦; 在一個問題出現之前,他們的肝可能被移植進很可能死于其他 原因的一位更老的病患。. 叁、主要受移植的器官及組織（Major organs and tissues transplanted） 一、胸腔內器官：心臟、肺臟 二、其他器官：手、眼角膜、皮膚、陰莖、肝臟、腎臟 三、組織、細胞、體液：胰島細胞（胰腺胰島細胞） 、骨髓/成人的 骨髓幹細胞、血液/部分血液成分、血管、心臟辦膜、骨骼、植 皮。. 肆、捐贈者種類： 一、已故,屍體捐贈（Deceased, cadaveric donation)- 捐贈者已經被 宣佈腦死其器官以通風設備或者其他機械機製保存， 直到被 8.
(21) 用于接受者之移植。 二、活體捐贈(Living donation) ：捐贈可完全更新組織, 並且保持 活著或者流動( 例如血，皮)的細胞； 或者捐贈一個器官，剩 下的器官能再生或者呈現其餘器官的工作量的一個器官或者 部分 (主要單個的腎捐贈，肝，小的腸或者胰的部分捐贈)。 三、配偶交換（Paired-Exchange） ：也是一種活體捐贈的技術。配 偶將一個腎臟捐贈給另一半。配對交換的普及化程序在1997 年由L.F. Ross 於新英格蘭醫學期刊中訂定「配偶腎臟交換計畫 之道德學」(Reinsmoen et al. 2004)提出例如：一個配偶可能非 常願意捐贈一個腎臟給他的另一半，但是並無法有完全的組織 配對。自願配偶捐贈的腎臟可以給一個與他有組織配對之接受 者，而他的配偶也自願捐贈腎臟。對接受者而言第二位捐贈者 的組織配對需比其配偶的組織配型更適合。可透過一外科手術 計畫書在捐贈者沒有後悔程序下，將匿名捐贈者之腎臟直接移 植至接受者體內，直到手術完成。. 伍、移植之重要里程碑： 1905年Eduard Zirm首度成功完成角膜移植 1954年Joseph Murray (Boston) 首度成功完成腎臟移植 1966年Richard Lillehei and William Kelly (Minnesota) 首度完成胰 臟移植 1967年Thomas Starzl (Pittsburgh) 首度完成肝臟移植. 9.
(22) 1967年Christiaan Barnard (Cape Town, South Africa) 首度完成心臟 移植 1970年Robert White (Cleveland, U.S.A.) 首度完成猴子心臟移植 1981年Bruce Reitz (Stanford) 首度完成心臟/肺臟之移植 1983年Joel Cooper (Toronto) 首度完成肺葉之移植 1986年Joel Cooper (Toronto) 首度完成雙肺之移植 1987年Joel Cooper (St. Louis) 首度完成全肺之移植 1995年Lloyd Ratner and Louis Kavoussi (Baltimore) 首度成功以內 視鏡對活體捐贈者作腎臟切除之移植 1998年David Sutherland (Minnesota)首度以活體捐贈者部分之胰腺 移植。 1998年首度完成手部移植(France) 2005年首度完成部分臉部移植(France) 2006年首度完成陰莖移植(China). 陸、HLA 的臨床意義(人類白血球抗原 Human Leukocyte Antigen) 一、HLA的發現: 由於組織移植，個體產生程度不同之排斥現象，推論及確定 了組織相容抗原(histocompatibility antigen)的存在，為一種位於 細胞膜表面的醣化蛋白(glycoprotein)組織相容抗原依引發排斥 10.
(23) 反應之強弱，可分為: (一)、主要組織相容複合體(major histocompatibility complex, MHC):人類之MHC首先於1954年Dausset (Dausset 1981)於 白血球之細胞膜上發現，遂定名為人類淋巴球組織抗原 (HLA)。其基因複合體(基因及其產物之合稱)於1965年發 現，稱為人類淋巴球組織抗原複合體(HLA complex)，位於 第六對染色體的短臂上。器官移植時，此HLA愈相符，移 植成功率愈高。 (二)、次要組織相容複合體(minor histocompatibility antigen)： 其基因散佈在整個基因圖(genome)之中，所造成的排斥反 應較弱，可以免疫抑制藥物適當控制。 二、HLA之基因群(locus)之分類(Snell 1981)： (一)、第一類抗原(Class I antigen)： 包括：HLA-A; HLA-B; HLA-C。 分佈：為位於細胞膜表面的醣蛋白，體內有核的細胞均 有，但濃度不一，其中以淋巴球表面濃度最高。 成份：為非共價鍵組合之44,000-Da 之α鏈及12,000-Daβ 鏈2 微球蛋白(microglobulin)。其中抗原決定位是在 α鏈上，而β2-microglobulin為結構性蛋白，基因位 於染色體15 上，不具抗原簇的性質。 功能：外來物質與class Ι相關的抗原結合，會由CD8+T淋巴 11.
(24) 細胞辨識。並將之呈現給細胞毒性T淋巴球 (cytotoxic T cell)，促動其反應，所以在移植排斥， 以及受病毒感染細胞的毒殺作用上，扮演了很重要 的角色。 遺傳：α 鏈即由HLA-A,B,C 之基因而來，且為等顯性， 亦即每個個體均有6個第一類抗原，父母雙方各提 供3個，均表現在細胞膜上。 (二)、第二類抗原(Class II antigen)： 包括：HLA-DR; HLA-DQ; HLA-DP 分佈：分佈範圍比第一類抗原小，主要是表現在B細胞， 吞噬細胞，單核細胞淋巴器官的樹突細胞（dendritic cell） ，腎臟間質細胞（mesangial cell） ，肝臟Kupffer’s 細胞，肺部第二型肺泡細胞，..及活化T細胞等細胞 的細胞膜上。 成分：非共價鍵組合而成的34,000-Daα鏈以及 29,000-Da 的β(β-chain)兩者共同為抗原簇。 功能：class Π分子在啟動移植抗原的免疫反應佔有重要角 色。當辨識外來的class Π分子會活化幫助性CD4+T 淋巴細胞，刺激淋巴細胞增殖，另方面會刺激細胞 激素。腎臟移植組織配對以HLA-A,B,DR最重要， 而人類染色體是成對的，所以每個人分別有兩個 HLA-A,B,DR。如果捐贈者與受贈者的組織抗原六 12.
(25) 個都相合最適合配對，其餘依次遞減。 (三)、第三類抗原(Class-III antigen)： 包括：補體部位(complement region)。補體系統為抗原抗體 反應的重要體液性介質。 分佈：基因群位於HLA-B及 HLA-DR之間，決定了C2,C4， 及Bf(B factor)，均與補體系統有關。 成分：至少包含了20 種以上的血漿蛋白。它們可互相作用 或與抗體、細胞膜等作用。 功能：可直接殺死不同的細胞、細菌、及病毒，參與發炎反 應作為調理素 ，或加強其他體液性或細胞性系統的參 與反應。 三、HLA的基因表現 HLA是目前人體內已知 最俱多態性(polymorphism) 的系統 (Moalic and Ferec 2005)。如 HLA-A及HLA-B的基因型，已知的便 超過80種，而已確定的HLA-C基因型，也有 10 種以上。此外DR 有24 種；DQ 有9 種；DP 亦有6 種之多。而一條染色體上連鎖 的一套HLA對偶基因組合稱為haplotype，如a1b2c3dr4dq5dp6。由 於HLA-A,B,C,D 四個locus 非常接近，可共同視為一個locus，形 成一個單位，遺傳給下一代。每個人的HLA 基因，又自父母雙方 而來，且此兩個同源染色體呈等顯性( codiminant)，並無顯隱之分； 除了MHC 之外，細胞內尚有大量的次要組織相容複合體，因此可 能產生的組織親和性抗原種類相當多。 13.
(26) 四、HLA配型對排斥反應的影響 移植物排斥反應的本質是一種免疫反應，其根本原因是移 植物中含有受者體內所缺乏的抗原。從免疫學角度來說，選擇 適合的供體和合理應用強有力的免疫抑制劑是目前控制排斥 反應的主要措施。Taylor CJ 等於1997(Taylor et al. 1997)對心臟 移植建議良好的HLA相容可減少移植物排斥反應和激素衝擊 次數，由於減少慢性排斥反應，提升移植器官的存活率，在CyA 應用數十年的今天仍具有重要的價值。綜合國外學人的研究結 果表明，HLA配型對移植物排斥反應的影響具有重要價值。. 五、HLA配型對早期腎功能的影響 HLA的錯配可以誘發受者體內抗原移植物的免疫反應，導 致移植物早期功能的損害，HLA錯配對腎移植早期功能的影響 更是明顯，主要包括移植物功能延遲恢復（DGF）術后第1天無 尿和術后需要繼續透析治療等(Shoskes et al. 1990) (Shoskes and Cecka 1998)］ 。同時移植腎缺血灌注損傷可以引起HLA抗原表 達的增強(Hirata and Terasaki 1994)，從而增強腎移植的免疫反 應。HLA相容程度，尤其是HLA-DR、HLA-B＋DR相容對早期 腎功能有顯著的影響。Kobayashi (Kobayashi et al. 1992)報道， 160例首次屍腎移植中，HLA配型對急性排斥（Acute rejection） 反應的影響，1/2單一配對者0 %，HLA-A、B、DR無錯配組有 18％，無AR、DR無錯配組有33％，一個DR錯配組為48%；另 外DRB1*無錯配組7％，一個以上DRB1*錯配組77％（P 14.
(27) <0.01） 。顯示HLA配對可預測移植初期急性排斥的發生。. 六、HLA配型對移植物存活率的影響 目前，提升移植物長期存活的研究主要集中在三個方面。 第一、免疫耐受的研究；第二、免疫抑制劑的研究；第三、移 植受供者 HLA 配型相容選擇。HLA-ClassⅠ、Ⅱ抗原是導致移 植物排斥反應的主要移植抗原。回顧文獻：Ichikawa Y(Ichikawa et al. 1993)在分析日本 511 例腎移植 5 年移植物存活時發現， DRB1*相配組排斥率僅為 4％，而不配組為 27％兩組間差異非 常顯著（P<0.05） 。因此，HLA 配型對長期排斥反應的影響更 顯重要。另外 Opelz 等分別於 1993 年 (Opelz et al. 1991) (Opelz 1993)對 306 個移植中心 4 萬例首次腎移植的採訪證實，HLA 配型對短期存活或是長期存活都具有顯著性差異，HLA-A、B、 DR 相配組 1 年器官存活率 87％，不相配組 59％（P<0.02） ； 而隨 HLA-A、B、DR 六位點不配數目的增加，其器官存活率 明顯下降，均具有極其顯著性差異(P<0.0001)。同時對移植腎 功能的比較，雖然第一年都具有良好的腎功能，但血清肌酐酸 <130μmol/L 的患者無錯配組佔 52％，六抗原錯配組僅 37％； 隨著時間延長，五年間錯配組慢性排斥導致的失腎率顯著提 升；10 年的採訪結果顯示，無錯配組 GS 為 76％，錯配組 30 ％～50％，10 年預測半壽期兩組相差 1 倍。就腎移植的臨床回 顧性分析顯示，CsA 時代的屍腎移植，HLA 相配仍然是影響移 植物長期存活主要原素之一。 15.
(28) 七、HLA配型對再次腎移植病患的移植物存活的影響 根據Opelz G,於1989 (Opelz 1989)及1993(Opelz et al. 1993) 報導，HLA配型對第二次腎移植者GS的影響比首次移植者更加 明顯，0～1個錯配組可提升1年GS 10％以上，3～10年GS 20％ 以上。其中HLA-A、B抗原錯配對首次腎移植影響較小，但對 再次腎移植影響很大，2 年GS無錯配組高于錯配組21 ％。 HLA-B、DR抗原對首次腎移植和再次腎移植的影響很大，2年 GS均相差20％。綜合分析，HLA-A、B、DR相配組再次移植受 者2年GS為82％，而錯配組僅為49％。經統計學處理，上述配 型的影響均具有極其顯著性差異（P〈0.0001)。由此指出︰對 于再次腎移植受者，應儘可能尋找HLA相合的供腎者。. 八、HLA配型對屍腎移植輸血效果的影響 van Twuyver等於1991 (van Twuyver et al. 1991)透過對腎 移植受者在輸血後產生特異性的供者同種抗原的細胞毒性T 淋巴細胞的功能進行分析，結果顯示︰只有那些供受者之間 有共同的1個單倍型或至少1個HLA-B、DR抗原的輸血才能 降低反應性，產生對供者抗原的特異性耐受。(Hiesse et al. 2001)研究發現，1個HLA-DR抗原相合的輸血可使移植腎存 活率提升35％，急性排斥反應率降低30％。由此可見，1個 HLA-DR抗原相合的輸血較HLA-DR抗原不合的隨機輸血受 者的致敏率明顯降低，明顯提升腎移植的存活率，減少排斥 反應的發生。 16.
(29) 柒、排斥反應 一、排斥的機制 人體的免疫系統可以保護機體免受細菌和病毒的侵害，但 卻無法區別移植器官和病源體，並將它當作細菌或病毒一起進 行攻擊和破壞，這就是排斥反應。主要是宿主的T, B淋巴球對 抗捐贈者的免疫反應。一般而言，宿主的抵抗系統包括(1)抗原 特異性接受體如T, B細胞接受體，(2)可溶解因子接受體，如細 胞激素、生長因子、發炎媒介物，(3)黏附及訊息傳遞分子可作 為細胞及組織的接受體，,藉由刺激這些細胞膜接受體可引發細 胞膜轉運、細胞運動(movement) 、特定基因轉錄 (transcription) 、細胞有絲分裂(mitosis)或凋亡(apoptosis) (100)。淋巴細胞經由其抗原特異性接受體媒介免疫反應，而表 現出耐受性、記憶性、自我辨識(Sayegh and Turka 1998)。以下 簡要敘述之： (一)、異體間辨識（allogenic recognition） ： 外來抗原會受到宿主T細胞的辨識，稱為異體辨識 （allorecognition） 。大約2﹪的宿主週邊血液淋巴球 可辨識外來MHC分子並作出反應。目前已知至少有 兩類異體辨識的途徑主導移植後的排斥反應(101)。 1、直接途徑（direct pathway） ： 抗原會表現在捐贈者的MHC溝槽內，然後呈現 給受贈者的細胞辨識，其在急性慢性排斥中均 17.
(30) 重要。 2、間接途徑（indirect pathway） ： 抗原經受贈者的吞噬細胞或樹突細胞處理過 後，呈現在受贈者本身的MHC溝槽內，再呈現 給自己的CD4T細胞辨識，其與慢性排斥或移植 耐受性(tolerance)有關。細胞接受訊號後產生訊 息傳遞，刺激細胞激素產生，導致細胞增殖， 攻擊植入的器官。 (二)、T細胞接受器－CD3複合體 (TCR-CD3 complex) 當排斥發生，T細胞表現蛋白接受器會特定地結合到胜 肽－主要組織相容複合體，雖然TCR允許T細胞辨識抗 原-MHC 複合體，但要啟動細胞內訊號則要靠CD3複合 體。由抗原呈現細胞來的主要訊號包括： 1、抗原呈現細胞的表面分子，如CD-80(又稱B7-1) 、 B7-2、CD-40、巨噬細胞 (macrophage) 或軸突細 胞 (dendritic cell) 2、細胞膜具有的細胞激素，如IL-1、TNF-α 3、可溶性細胞激素如IL-1、IL-12、TNF-α。 當T細胞接受器與抗原結合，會造成CD3的結構改變， 而啟動細胞內訊號傳遞，包括酪氨酸激活脢 ( tyrosine kinase)；因此將活化訊號傳遞到T細胞的細胞質，而 18.
(31) TCR－CD3複合體又稱為”訊號1”（signal 1） ，要完 全啟動T細胞需要兩種加成訊號，而訊號2（signal 2） 則指與抗原無關的訊號，其需要透過所謂副分子 （accessory molecules）作用。 CD4及CD8分子為T 細胞表面蛋白質，為促進TCR及APCs之間作用的副分 子。CD4分子與MHC class II結合後，會促進TCR－CD3 複合體媒介之訊號傳遞。相同地，CD8分子結合到MHC class Ι分子上，而促進其訊號傳遞。目前己知利用 單株抗體對抗CD4或CD8分子來抑制T細胞活化，因此 在免疫抑制角色上相當重要。還有許多T細胞膜表面 蛋白質，包括CD2、CD28、LFA－1（Lymphocyte function-associated antigen-1） ，VLA （Very-late-activation molecules）等，對於T細 胞活化也有影嚮。這些蛋白質則屬於細胞黏附分子 ( adhesion molecule) 家族。例如CD2-LFA3結合後， 可作為T細胞活化增殖的共同刺激訊號 （costimulatory signal）。CD28-B7-1及CD28-B7-2 形成訊號2 (signal 2)，而活化T細胞。CD40－CD40 ligand結合亦是B細胞及T細胞活化的重要途徑。 (三) T細胞活化 T細胞活化至少需要兩種不同訊號。訊號1為藉結合異體 抗原或藉自體MHC呈現給TCR-CD3複合體。訊號2為藉副分 子鍵結APC與T細胞而活化T細胞，例如B7- CD28。這些訊 19.
(32) 號會刺激CD4-T細胞，活化IL-2及IL-2接受器的基因表 現，進而刺激其他細胞激素的表現。利用細胞激素的作 用，傳遞訊號3（signal 3） ，來完成整個T細胞活化的過 程，致使細胞分裂。一旦TCR被激活但沒有訊號2的作用， 則不會持續下去。當T細胞受到刺激後，數分鐘內便會脫 離G0期（細胞靜止期） 。而在細胞循環第一期（G1a） ，T 細胞開始轉錄且表現細胞腫瘤基因如c-myc、c-myb、 c-fos、c-jun及IL-2基因及其接受器等。目前認為 c-fos、c-jun的功能在細胞核調節細胞生長，包括IL-2 基因的轉錄作用。而c-myc、c-myb則調節DNA合成，以便 有絲分裂及細胞分化。當IL-2與其接受器結合則促使細 胞進入G1b期，在此期可分泌許多前發炎細胞激素及增加 細胞表面接受器的合成，如transferrin。當細胞循環進 入S期，DNA含量會加倍，進行有絲分裂，稱為＂抗原後 分化＂（postantigenic differentiation） ，因此導致 +. +. 細胞株擴張（clonal expansion） 。而CD4 、CD8 T細胞株 擴張的結果，是增加細胞毒殺T淋巴球，引發排斥反應。 (四) 細胞激素在排斥反應的角色 細胞激素為可溶解，抗原非特異性蛋白。其合成乃是許 多不同細胞對抗原刺激所作反應，包括單核細胞、T細 +. 胞，特別是CD4 T淋巴細胞。其藉由結合到目標細胞表面 的特殊接受器而啟動作用。分泌細胞激素的方式，包括 自體分泌（autocrine） ，旁體分泌（paracrine）內分泌 20.
(33) （endocrine） 。細胞激素有體液性及細胞性反應，其藉 與目標細胞接受器結合 ( 包括T細胞、B細胞、巨噬細 胞、造血細胞) 引發其活化，增殖及分化。細胞激素會 增加MHC表現，目標細胞損傷及發炎反應。其同時加強細 胞黏附分子在移植器官的內皮及上皮細胞的表現，促進 自然殺手細胞（NK cell）及巨噬細胞媒介的細胞毒性。 另一方面細胞激素會抑制其他細胞激素的作用，而壓制 免疫反應，當抗原進入體內就由細胞激素的刺激與抑制 作用取得平衡。當免疫反應啟動時，許多細胞激素包括 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor）及r-干擾素， 會指引淋巴細胞偏向TH1，而製造IL-2，INF-r，IL-12。 至於抗發炎細胞激素，如TGF-β（transforming growth factor-β）則指引淋巴細胞偏向TH2，而製造IL-4、IL-10 以減少對液體抗原的反應。當排斥反應，所有這些細胞 激素均可見於移植器官，但在耐受狀態（tolerance）則 TH2細胞激素增加，而TH1細胞激素減少。IL-2在調節T細 胞活化佔有重要角色，其在T細胞活化過程作為第三訊 號，而且是DNA合成及細胞株擴張所需的腫瘤基因 (protooncogene) 。而且IL-2、TNF、IL-6亦導致發燒、 肌肉痛、關節痛及血管滲漏症候群（capillary leak syndrome） ，表現出水腫、移植器官腫脹的現象。. 21.
(34) 捌：排斥反應的種類： 器官移植手術，若選擇組織相容性接近的供者，並在強效免疫 抑制劑的應用下，移植可以成功。儘管這樣，往往臨床上還會出現 排斥反應。捐贈人和MHC均會導致排斥的免疫的反應。捐贈人的MHC 在移植器官內，血型及HLA抗原是天生的移植因素。 另外，微生物 和其他非MHC抗原可能經過刺激的抗體與起MHC抗原反應。根據臨床 徵狀及發生時間之差異和組織病理學的特性大致可將排斥反應分 為四類(Smith 2002)：超急性排斥反應、加速性排斥反應、急性排斥 反應及慢性排斥反應。 一、超急性排斥反應（Hyperacute Graft Rejection）： 超急排斥確實可以稱為是一種“超級”排斥。它來勢凶猛， 大多數於吻合血管開放後幾分鐘至幾小時發生，並且引起體液 性免疫的反應。也有人稱之為“手術台上的排斥反應＂。 Hyperacute 排斥是一種抗體調節cytotoxic 反應，其誘發因 素可能與接受移植者體內預先存有HLA抗體反應，將抗體固定 在血管的內皮細胞上的HLA抗原上，隨後在毛細血管內形成刺 激血液凝固因子而形成血液凝塊，刺激補體活化，形成血管內 栓塞，導致組織缺血和壞死。主要的病理形態改變， Hyperacute 排斥導致移植物的立即幸血栓形成和器官損失。 為血管纖維素樣壞死，大量中性白細胞浸潤和血栓形成等；引 起器官皮質的壞死，而導玫移直器官功能喪失。進一步活化血 液凝固機轉，發生血栓，進而導致壞死。以及某些細胞、病毒 22.
(35) 感染等致敏因素有關。血型不相容如O型血型接受者接受A型血 型捐贈者之腎臟，超急排斥一旦發生，目前尚無良好的治療辦 法。最初，hyperacute 排斥被認為只在移植的腎裡發生。但 目前證實全部固體的器官易受影響。. 二、加速性排斥反應： 加速性排斥反應是指術後3-5天內發生的排斥反應。病人表 現為體溫升高、血壓升高、移植器官腫脹壓痛、病情進行性發 展。腎臟移植者血肌酐迅速上升，病人需透析。治療上應儘早 應用抗淋巴細胞球蛋白（ALG）或OKT3可使約80%以上的病人能 “幸免於難”。加速排斥反應也是臨床醫生感到比較棘手的一類 排斥反應。. 三、急性排斥反應： 急性排斥反應是臨床上最多見的一種排斥反應。發生於移 植後第6天至術後3-6個月內；特別好發於移植後3個月內，以第 5周發生率最高。依發病機制可分為急性體液排斥反應（急性 血管性排斥反應）和急性細胞性排斥反應。急性排斥與 mononuclear，cytotoxic和Th 細胞，monokines 和lymphokines 的細胞免疫反應有關。當抗原被接受者巨噬細胞（macrophage） 困住並且不能被內皮系統清理時，即發生急性排斥。在移植器 官上偶而會出現非活性 Th 細胞或特定的HLA class II抗原。 非活性 Th 細胞遇到具體class II抗原顯示在捐贈人器官上， 23.
(36) 變得活化，並且合成lymphokines的感受器從monocytes釋放。 活化的monocytes 釋放lymphokine IL-1，啟動Th細胞的活化 擴大。 Monocytes也釋放lymphokine IL-2，啟動並且引起CTLs 的活性擴大。 排斥的臨床的跡象是非特異性的並且變化取決 于移植的器官。使用環孢素、硫唑嘌呤和強的鬆的腎移植受者 中，急性排斥反應的發生率為40%～50%，近年來隨著免疫抑 制治療的進展，當早期發現急性排斥反應，可用的包括大劑量 甲基強的松龍衝擊，抗淋巴細胞球蛋白（ALG）或抗胸腺細胞 球蛋白（ATG）及專門特異性地針對排斥有關的Ｔ細胞的單克 隆抗體（OKT3及OKT4） 。特別是FK506和MMF的應用已經使 急性排斥反應的發生率有所降低，但仍有近25%的發生率，並 且多數急性排斥反應的臨床表現已不典型，這些不出現腎功能 改變，既是所謂的亞臨床排斥反應，更容易為患者忽視，危害 卻同樣嚴重。 “急排”的治療成功率在90%以上。急性的排斥有 短期和長期之分。 短期的急性排斥症狀明顯，增加免疫抑制 劑劑量可降低排斥症狀，但它的的結果也為長期的急性排斥造 成不利的影響。而且急性排斥的病史是慢性移植器官機能失調 的最重要的免疫學的預言者。在4種排斥現象中，護士的照護 對急性的排斥有最大的臨床的意義，因為它可能透過護士的照 護及監控而防止藥理學的介入。移植接受者在治療排斥期間照 顧移植器官的態度，完全配合免疫抑制劑的使用，細心於排斥 反應的管理與病患的臨床評估有密切關系。. 24.
(37) 四、慢性排斥反應： 在腎移植出院後發生的排斥反應中最常見的就是移植腎急 性排斥反應和移植腎慢性排斥反應。體液性之免疫機轉也可能 在個體長期受到移植物所釋放抗原之刺激而逐漸發展出來。這 些後天被誘導所產生之抗體逐步破壞移植物之血管內皮細 胞，使血管因修補而導致狹宰。最後移植物因慢性缺血而衰 竭。慢性排斥反應是指排斥反應發生在手術6個月以後。組織 病理學改變為輕重不等的閉塞性血管炎、腎小球炎及間質性腎 炎、間質性纖維化或散佈性動脈病變（arteriopathy）等。T cell 和B cell有導致慢性排斥損害的特性。 cytokines的生產過剩， 包括TGF-β和血小板的增生，而導致於纖維變性。 透過B cell 的alloantibody的持續產生及T cell的影響導致arteriopathy。以前 認為捐贈者因素包括：整個腎臟功能，延長冷藏局部缺血時間， 捐贈者高年齡和高血壓。最近的證據建議對allograft的接受者 免疫的反應也有助于捐贈者移植器官功能衰竭DGF的發展。其 他如：白細胞血型（HLA配型）配合不理想者；腎移植後早期 發生多次的急性排斥；免疫抑制劑劑量長期不足；高脂血症 等。尤其是劑量的長期相對不足，可能意味著這些移植病人經 常處於一種免疫抑制不佳的狀態，致使慢性排斥的病理損害已 潛在的發生。慢性排斥是一個延長的排斥allograft 功能的過 程。 因此，難怪移植接受者經常發展慢性排斥，根據經驗大 多數的接受者相同的健康問題是主要器官故障。 另外，還包 括普遍性的如：免疫抑制劑的多年的累積使用產生錯綜複雜的 25.
(38) 作用和抗藥性。對感染的敏感性，皮膚癌的發展，心血管的疾 病，骨質疏松，和情緒變化。一旦發生慢性排斥反應，其臨床 主要表現為，移植器官功能逐漸退。如腎臟移植者有不同程度 的蛋白尿，高血壓和移植腎有縮小趨勢。腎功能進行性減退， 表現為內生肌酐清除率下降，以及多尿和低相對密度尿，甚至 無尿。. 玖：免疫抑制藥物： 一、作用在第一訊號者可抑制抗原之辨識。如單株抗體OKT3，其可 對抗CD3分子，致使TCR失去功能，多株抗體（如ATG、ALG） 會對抗CD3分子及其他細胞表面標記，至於環孢靈 （Cyclosporin-A）及普樂可復(FK506)會抑制calcineurin磷酸脢活 性，稱為calcineurin inhibitor，可抑制T細胞製造 IL-2。 二、作用於第二訊號者為CTLA-4－Ig及抗CD154抗體，其阻斷共同 刺激分子（costimulatory moleculs） ，目前市面上尚無此類藥物。 三、作用於第三訊號者為Basiliximab(Simulet)及 Daclizumab( Zenapax)，直接對抗IL-2接受器(又稱CD25)。 四、斥消靈 (Sirolimus) 則作用於TOR( target of rapamycin)蛋白，進 而抑制IL-2或協同刺激途徑( CD28/B7 costimulatory pathway) 所 引發的一連串反應，故DNA及蛋白質的製造受到抑制，細胞循 環停至於G1後期。目前有些證據支持rapamycin可以減少慢性排 斥但仍待進依步證實。 伍、山喜多（MMF，mycophenolate mofetyl）及移護寧（imuran）則 26.
(39) 阻斷核酸合成，抑制細胞的增植。 由於同樣的這些藥物在不同的病人身上或由於不同醫生的處理方 案會出現不同的結果，器官移植要獲得長期存活，慢性排斥是一大 障礙。換言之，解決了慢性排斥問題腎移植的長存活將會有一個飛 躍。因此，積極預防和及時處理慢性排斥反應至關重要。對移植患 者定期複查HLA抗體及相關指標性檢查，觀察數據的變化，當藥物 有效的治療排斥反應逆轉病情，使组織C4d的沉積及HLA抗體随之消 失的同時(Theruvath TP 2001)，應重新審視免疫抑制藥方案是否 合理，迅速處理慢性排斥將可使部分移植功能不可逆轉的惡化變為 可以逆轉，或許可將慢性排斥的病理損害控制在最低限度，使病人 存活時間延長。. 拾：移植免疫學的檢查 免疫學檢查包括血型配對、組織型判別(tissue typing)、組 織抗原配對(antigen matching)、交叉試驗(cross matching)、毒 殺細胞抗體(cytotoxic antibody)之篩選。 一、ABO血型 ABO血型抗原是很重要的移植抗原，因此在捐贈者和腎移植病 人的血型須要相符，避免引起超急性排斥。但是近年來，ABO 血型不相符的活體換腎治療也可經術前的血漿置換、脾臟切 除、免疫抑制藥物的使用來完成，也有不錯的移植腎存活率 (Helming et al. 2006) (Kumlien et al. 2006) (Malfuson et al. 2007)]。 27.
(40) 二、HLA抗原分型檢查 組織抗原分型(HLA-typing)又稱為組織型鑑定(tissue typing)， 在移植中，人類白血球抗原中以HLAA,HLA-B, HLA-DR6個抗 原為最重要的主要MHC，如果捐贈者與接受者HL6個抗原都配 對，則移植後腎臟的存活率最佳，相符配對越多者其移植腎的 存活率也越高。傳統的微量淋巴球毒殺試驗由於敏感度、專一 性、再現性與準確度不足、分析時間長等缺點。目前已有分子 生物學方法，可獲得明確且解析度較高的分型結果，目前多使 用的分子生物學方法有： (一)、序列特異引子聚合酶連鎖反應（sequence-specific primer， PCR-SSP）法： 為小體積PCR反應，對於單一或一群基因座具有高度的特 異性，混和SSP引子的特異性源自於引子黏接點的特異 性，依使用的引子組合不同可獲得低到高解析度的分型結 果，缺點必須進行大量的瓊脂凝膠電泳操作費時。 (二)、序列特異寡核苷酸探針法（Sequence-Specific Oligonucleotide Probe，PCR-SSOP）法： HLA系統中絕大多數之變異性，主要是源自於一對基因之 間互相對應之序列彼此之間的互換而形成。因此很多等 位基因再互相對應的位置有某種程度上的相似，這些序 列不會只存在於一個等位基因上。PCR-SSOP是以探針反 應的型態來辨別HLA的等位基因，探針一般固定於試紙條 28.
(41) (strip)或微珠（bead）上。呈色酵素或螢光物質則在PCR 步驟被標定在HLA的DNA片段上，當DNA與探針結合，便會 呈色或產生螢光，而分辨探針是否反應。搭配電腦軟體 幫助分析，可減少許多人力。缺點是無法得到高解析度 的分型結果。 (三)、定序分型法（Sequence-Based Typing， SBT）法： 直接將HLA基因進行定序，可得到最高解析度的結果， 多應用於對HLA 配對要求甚高的造血幹細胞移植。其可 鑑定出特定基因座上不同的等位基因，此外PCR產物之 核苷酸系列，只要具有未知的多樣性，即可鑑定出新的 等位基因。除需有較高品質的全自動核苷酸定序儀器、 專業HLA定序分析軟體及特異性PCR引子外，一旦發現新 等位基因，必須同時對探針及引字作修正。 三、HLA抗體檢查 HLA抗體的產生可能由於懷孕、接受輸血、自體免疫 （alloimmunization）因素所致或者透過移植後因接觸外來HLA 而致敏，也可能產生新的抗體。通常自體免疫疾病患者大約有 33%(Glenn 2000)的個人產生HLA抗體。HLA抗體與血小板輸注 無療效（platelet refractoriness）(Zeigler et al. 1991))及移植失敗 (Zeevi et al. 2006))有關。移植前為了評估病患是否適合接受移 植，必須進行PRA檢測，以細胞組成或HLA抗原組偵測病患血 液中HLA抗體，以防發生急性排斥反應，而抗體對HLA的反應 29.
(42) 性越強則表示病患越不適合接受移植。移植後根據(Terasaki PI 2003 (Terasaki 2003))HLA抗體引起移植器官排斥的理論，有關 抗體的證明包括︰(1)引起急性排斥，(2)組織切片中C4D的沈澱 與早期移植失敗有關，(3)對早期診斷急性排斥是一個好指標， (4)在826位腎臟移植病患中有96%出現陽性反應，(5)在33項腎， 心，肺和肝移植的研究與慢性排斥有關，(6)在預期的1629位病 患的24合作的中心研究證明：抗體的出現預言隨后的6個月時間 內將出現移植器官失敗(p= 0.05)。顯示HLA抗體檢測對移植病患 之重要性。 臨床上對HLA抗體檢測方法有：利用補體依賴細胞毒殺試驗 (complement-dependent cytotoxicity，CDC) (Leech et al. 2003))， 流式細胞儀（flow cytometric analysis）(Tambur et al. 2000)，或 是酵素連結免疫免疫吸附分析法(ELISA) (Zachary et al. 2001)， 微珠分析法（Luminex analysis）。為了偵測病患對移植物產生 的捐贈者特異性抗體（donor-specific antibodies）DSA，可以利 用捐贈者細胞表面的HLA抗原分子，在移植後定期監測病患的 抗體產生情形(Marta Crespo and 2006)，提早發現潛在的排斥現 象，預先開始進行抗排斥措施。這個檢測方法同樣可以用在移 植前的配型試驗，利用固相免疫分析高專一性、靈敏度的特性， 又同時兼具細胞毒殺試驗直接偵測捐贈者SDA的功能。 (一)、細胞毒殺試驗與交叉試驗(cross matching)： 以CDC偵測HLA抗體是利用微孔盤中的T及B細胞組，與病患 血清一起培養，洗滌後加入兔子補體與染劑，若血清中抗 30.
(43) 體與細胞結合，補體活化作用的結果將使染劑得以進入細 胞，透過鏡檢計算死亡細胞數目可以計算抗體效價，計算 陽性反應孔數可以得到病人的PRA百分比。相同原理，若將 反應盤中 T及B細胞組分別以捐贈者純化之T及B細胞組取 代，與接受者之血清培養後加入補體與染劑，透過鏡檢計 算死亡細胞數目可以檢測接受者體內是否含有捐贈者之 HLA抗體。若陽性反應表示接受者體內含有捐贈者之HLA抗 體，不適合接受移植手術。是一種快速又簡易的HLA抗體篩 檢方法。 (二)、ELISA固相免疫分析法： 將病患血清中的HLA抗體與反應盤中的HLA抗原結合，再利 用酵素標定之抗人類IgG抗體偵測HLA抗體。由酵素受質的 呈色反應來判斷檢結果。HLA抗體偵測試劑可分為三種等 級： 1、HLA抗體篩檢試劑：含有混的HLA抗原，用來檢測病 患是否帶有HLA抗體。 2、PRA檢測試劑：通常含有來自30~40人的HLA抗原，每 個人的HLA抗原分別被固定於獨立的反應孔中。由最 終陽性反應孔所佔比例代表病患HLA抗體的PRA百分 比。可以藉由評比病患抗體專一性分佈的廣泛度、決 定是否適合移植。此外，也可由電腦軟體分析得知抗 體的專一性。 31.
(44) 3、與異性HLA抗體鑑別試劑：含有純化之單一HLA抗原， 可以精確的鑑別出HLA抗體之專一性，此類產品為最昂 貴的試劑。 綜觀ELISA固相免疫分析法為成本低、反應快速且靈敏度 高的檢測技術，不需使用兔子補體，其敏感度、專一性皆 高於細胞毒殺試驗。 (三)、流式細胞分析儀法： 將純化的HLA抗原結合到一種乳膠至的微珠. 上，一. 種微珠與單一細胞之抗原結合，混和多種微珠可得一包含 大多數HLA抗原之混和物，再使用有螢光標記之特異性抗 體與標的物結合，形成一個”抗原-抗體-螢光”複合物，以雷 射光激發螢光物質。藉此可偵測病人檢體是否含HLA抗 體，亦可計算出PRA百分比。與細胞毒殺試驗相較，流式 細胞技術較敏感，而且可以偵測某些無法被補體固定住的 抗體。另一方面，乳膠微珠是與純化的抗原結合而非細胞， 可避免非HLA抗體之結合。操作上是將與HLA抗原結合之 乳膠微珠與血清反應，清洗後再加上FITC標記的抗人體 IgG抗體，抗體反應完清洗後即可由流式細胞儀分析結果。 (四)、luminex分析法： 將粘附有HLA抗原的微珠與待測的小量檢體一起培育，之 後將致敏化的微珠經由清洗的步驟，移除未結合的抗體， 再加入結合phycoerythrin的抗人類IgG抗體再次培育，待 32.
(45) 測的檢體由luminex來進行取樣與分析。每個微珠的訊息 強度，會與一個含在微珠懸浮混合液中的陰性對照微珠比 較，判定結合上異體抗體的微珠是陽性還是陰性。 (五)、DSA偵測法： 捐贈者的組織抗原可以從血液或脾臟組織取得，一旦從 破碎的細胞表面萃取出來，純化的抗原可冷凍保存數年 供後續檢測使用，不僅不需定期召回捐贈者收集檢體， 對於屍體捐贈之案例也可確保日後捐贈者抗原的來源。 其檢測方法系將接受者血清分別與捐贈者之ClassI、I抗 原培育結合，洗清後再加入抗人類IgG抗體培育，清洗3 次後，加入受質緩衝液PNPP(p-nitrophenyl phosphate)，可以ELISA、流式細胞分析儀、或luminex 分析法檢測是否有DSA抗體的產生。 四、生化標誌（Biomarkers）檢查 臨床上腎臟移植病患，血肌酐和尿素氮也是每次門診複診 必須檢查的內容。但是要注意血肌酐和尿素氮不是腎功能改變 早期表現，也不是急性排斥反應的特異性指標，部分患者在發 生急性排斥反應時，二者仍可正常。單次升高的意義不如連續 動態測定，因而患者有必要將每次檢查結果均記錄下來，便於 觀察。尿素氮受蛋白質代謝影響較大，當攝入大量蛋白食品， 或者採用激素衝擊治療，蛋白質分解增加，尿素氮也會明顯升 高，此時則不能準確反映移植腎功能。定期監測鈣神經蛋白抑 33.
(46) 製劑（環孢素、他克莫斯）的血藥濃度，既防止血藥濃度偏低 導致急性排斥反應，又要防止血藥濃度偏高損害移植腎功能 (Racusen LC 1998)。. 五、組織切片檢查 過去十年由於引用CCTT和Banff 97的判讀規則，對急性及慢性 排斥的組織細胞型態清楚描述且標準化，尤其在C4d之免疫組 織化學染色技術（immunohistochemical）之普遍應用，對可 能於移植後引起立即性的體液排斥有特異性診斷特性後。在臨 床上組織切片細胞學檢查結果，成為診斷排斥反應的黃金標準 (Colvin RB 1998)。 (一)、免疫組織化學染色(急性體液性排斥診斷)： 體液性排斥在固型器官移植中較為常見，這些抗體 與移植器官的血管反應，並引起內皮細胞受損，伴有補 體活化，血管痙攣和血栓形成，最終導致移植器官的壞 死。組織內出現不同程度的嗜中性細胞浸潤和小膽管增 生、血管血栓形成、血管內膜增生或壞死性動脈炎的改 變。在抗體誘導的體液性排斥中，補體具有協助和加強 免疫的調節作用.體液性排斥反應發生時，補體的經典 途徑即被激活，被激活的CI蛋白水解為C4d，C4d與周遭 血管的內皮細胞共價結合。當排斥反應時可看到補体 C4、C3、C5b-9、IgM沿血管内皮细胞分布，其沈澱程度 與排斥反應程度成正比。由於C4d性能较稳定，能夠比 34.
(47) 較持久存在，因此可作為排斥時存在體液成分激活的標 誌。在心臟及腎臟移植時心臟血管內皮及腎小管周遭的 毛細血管壁C4d沈積是排斥反應的一項較特異免疫組織 化學指標。但在最近的研究中對急性排斥反應時可能出 現純T細胞性排斥(‘Pure,’ T cell-poor antibody-mediated rejection (AMR))也有純細胞性排斥（acute cellular rejection），也有能能出現兩種混和的排斥反應（Mixed acute cellular and antibody-mediated rejection）(mixed ACR–AMR) (Nickeleit and Andreoni 2007) ，在以C4d診 斷體液性排斥時，仍可能出現假陰性（false negative） 或假陽性(false positive)反應。因此在診斷急性排斥時應 同時紀錄C4d反應程度（titer）或與前次切片結果比較， 是否同時有細胞及體液性排斥反應，提供正確使用免疫 抑制劑之參考。 (二)、急性細胞性排斥診斷 急性排斥的組織病理學診斷以三個主要的病理特徵為 基礎： 1、血管區發炎細胞浸潤: 包括淋巴母細胞或活化的淋巴細胞，中性粒細胞和 嗜酸性粒細胞增加。 2、靜脈及毛細血管內皮細胞炎症。 3、組織的炎症和損傷。 35.
(48) 診斷急性排斥至少具備上述二點，並伴有器官功能受損 的生化指標。如果有＞50%的受損或者靜脈明顯有內皮 細胞下炎細胞浸潤，診斷為急性排斥(Colvin et al. 1997)。 (三)、慢性細胞排斥 慢性排斥診斷因使用免疫抑制劑治療通常難以控制，根 據Banff classification (Baltzan and George 1999)在血管 內皮的緊縮、腎小管和血管的炎症、血管區發炎細胞浸 潤，淋巴母細胞或活化的淋巴細胞，中性粒細胞和嗜酸 性粒細胞增加及腎絲球或動脈或者血栓的纖維壞死等 程度較輕者，則診斷為慢性細胞排斥。 雖然在39年前Morris (Morris et al. 1968)等就已發現於腎 臟移植後會出現HLA抗體的現象，並推測可能與移植後器官功 能失敗有關。一直至2002年Lee PC(Lee et al. 2002)等，第一次 長期有系統的追蹤HLA抗體與移植失敗相關的研究報告。於8 年期間追蹤腎臟移植病患HLA抗體的產生，發現雖然使用某些 免疫抑制劑如：Cyclosporine CsA-MMF (9.8%)可能比使用 CsA-Aza (18.1%)較不易產生HLA抗體。但也證明移植失敗前均 會產生HLA抗體。因此HLA組織相容基因檢測及抗體篩選是移 植手術前實驗室重要的工作。 在1999年，Collins 和Colvin (Collins et al. 1999)首先證明 在腎臟移植排斥病患，移植後血清內產生的HLA抗體與腎小管 或腎絲球组織內產生C4d的沉澱，有具體的相關性。在隨後的 36.
(49) 移植後C4d染色與HLA抗體的許多研究中顯示，血清HLA抗體 的產生在C4d陽性病患中佔(78–95%) 2001 (Lederer et al. 2001) (Crespo et al. 2001) (Bohmig et al. 2002)，相對於（0–50%）的 C4d 陰性病患有明顯的差異。大部分C4d與HLA抗體陽性的病 患對捐贈者的MHC Class I,II都有錯誤配對現象。在Racusen LC2003 (Racusen et al. 2003)的報告中對，先前可能出現C4d陽 性結果但血清內未出現HLA抗體，或出現HLA抗體但C4d為陰性 結果之現象，推薦結合DSA檢測及C4d染色檢查，將可精確的診 斷抗體調節性排斥（antibody-mediated rejection）。 在其他研究1996 (Reed et al. 1996)2002 (Lee et al. 2002)中 也支持手術後HLA抗體的產生與長期的心臟和腎臟的移植失 敗的危險相關。2005年Qiuheng Zhang(Zhang et al. 2005)等建 議：在移植手術後第一週、及3,6,12個月定期監測血清內HLA 抗體的產生，是一非侵入性診斷急性排斥並早期鑑定移植功能 障礙高危險病患的鑑定工具。. 拾壹；研究目的 由於預測器官移植之急性或慢性排斥之診斷及檢測並無本土性的 相關資料，本研究將利用設備較為簡單，成本較低但反應快速且靈敏度 高的ELISA方法定期檢測PRA，陽性PRA檢體再以PRA之ID檢測，定量 HLA抗體百分比，比對是否有DSA的發生，追蹤PRA與移植病患存活率 的關聯性並提供台灣器官移植界參考依據。同時統計國人在器官移植手 術前捐贈者與接受者HLA抗原配對程度與移植後產生急性或慢性排斥的 37.
(50) 相關性。藉由非侵入性方法監測血清中HLA抗體的產生，提供醫師早期 術後排斥反應之診斷，作為更改藥物或治療方法之依據，並提升PRA檢 測於臨床上的應用。. 38.
(51) 第三章 研究方法 壹、病患收集 本研究收集2004年10月至2007年4月間，於台北縣亞東紀念醫 院所有進行器官移植手術病患，期間移植接受者包括男性、女性、 該院及他院病患。器官捐贈者包括：來自器官捐贈中心分配或該院 器官勸募而來的屍體捐贈移植，活體親屬移植（父子、兄弟、母女 等），和活體非親屬（配偶）的捐贈。於手術前分別檢驗器官捐贈 者及接受者之血型、HLA基因型分型、交叉試驗及血清B型肝炎表 面抗原（HBsAg）、表面抗體(Anti-HBs)核心抗體(Anti- HBc)、C型 肝炎(Anti-HCV)等檢查。各種器官分配原則如附錄1:心臟移植器官 分配原則，2:腎臟移植器官分配原則。移植手術後定期檢查器官功 能：病情穩定的移植患者，在移植術後第1個月內至少每週檢驗2 次，第二個月每週1次，第3、4個月每兩週1次，此後至術後1年每 月1次，第2年每兩個月1次，以後每３～４個月１次，除檢驗常規 項目如：BUN、cretinine、免疫抑制劑（Tacolimas、Sirolimas、 Cyclesporine）等，另增加PRA之檢測。所有檢體均經過人體試驗同 意書(如附錄2)簽核。並於臨床上懷疑排斥反應如： 一、體溫升高38℃以上（多在凌晨4－5點鐘體溫上升）。 二、尿量明顯減少，體重每天增加一公斤以上或一周內增加2公 斤以上。 三、移植區腫脹、疼痛、壓痛或伸直下肢感覺牽引痛。. 39.
(52) 四、血壓升高30mmHg以上。 五、不明原因的乏力、腹脹、頭痛、食慾減退、酸痛、心動過 速、情緒不穩定、煩燥等。 六、血肌酐、尿素氮升高時， 經皮穿刺活檢，是認移植術後最為切實可靠的排斥反應的診斷 方法，可以準確區分體液性排斥反應、細胞性排斥反應、慢性 移植病變。進行心、腎臟超音波及病理切片檢查。 本研究將收集所有移植病患之HLA基因配型、交叉試驗、血清生化 標誌檢查、組織切片檢查及PRA檢測等臨床檢驗數據，統計其與移 植器官排斥現象及存活率之相關性。. 貳、檢體採集保存 HLA抗原分型檢查： 捐贈者及接受者抽取10 ml血液檢體置於含acid citrate dextrose (ACD)之真空採血管（Becton Dicknson） 。採集後的血液應避免 處理時間過久或是放置在高溫、低溫下。 HLA抗體交叉試驗： 捐贈者抽取50 ml血液檢體置於含 Heparin之真空採血管（Becton Dicknson） 。以室溫方式保存當天處理。接受者收集10 ml血液檢 體置於不含抗凝劑SST試管（Becton Dicknson） 。 PRA及生化指標檢測： 所有血液檢體採集時間均依照本計畫採檢程序進行。接受者需 40.
(53) 於空腹採檢時檢體，以不含抗凝劑SST試管（Becton Dicknson） 收集10 ml血液檢體。使用KUBOTA KN1000機型離心機以3500g 離心10分鐘後，隨即進行生化指標檢驗，將剩餘血清檢體以康 氏管分裝冷凍保存於-80℃冰箱。 切片檢體： 當臨床出現creatinine指數上升、發燒、疲憊或移植部位局部 疼痛等排斥反應時，先以心臟或腎臟超音波掃瞄懷疑排斥反應 時，依外科手術技術之心臟或腎臟組織切片標準檢體採集程序 進行組織切片檢查。 本研究進行之方法及流程如圖3-1。. 叁、檢測方法 一、HLA A,B,C 抗原分型： 利用補體依賴細胞毒殺試驗法(CDC)，採用Special Monoclonal Tray-Asian HLA Class I試劑，先以Fluoro Beads T 磁珠上結合抗CD2抗體與T細胞表面抗原CD2結合分離T細 胞，置入內含HLA class I之磁珠盤（HLA Class I Lambda Monoclonal Typing Tray） （SMT72R）後，使在測試盤上72個反 應槽中各加入1μl T細胞懸浮液（用Hank′s液調至淋巴細胞懸 液濃度為1500～2000個/μl，並檢測細胞活性。） ，加入新鮮冷 凍的兔血清(作為補體的來源)起反應。經60分鐘後在測試盤上 72個反應槽中各加入5μl螢光染劑（Quench AO/EB）終止反應 及對細胞染色。由於損傷的細胞能吸取染料或螢光物質，所以 41.
(54) 能在顯微鏡下識別出細胞損傷的結果。於倒立螢光顯微鏡下觀 察每一個反應槽的反應，紀錄於人類白血球抗原第I型分型盤 的工作表中。判讀方法：在螢光顯微鏡下觀察活細胞為綠色， 死細胞為橘紅色。以死細胞佔整個細胞的百分比以0、1、2、4、 6、8為判分標準。陽性反應：死的淋巴球，呈橘紅色。陰性反 應：活的淋巴球為綠色。依照ASHI之判讀標準如圖3-2. 二、HLA DR, DQ 抗原分型： TM. 使用 ONE LamBDA INC.USA.的 Micro SSP 試劑，以序列特 異引子聚合酶連鎖反應（sequence-specific primer，PCR-SSP） 法，先以 Viogen DNA extraction kit 從血球中純化 DNA。將 DNA 回溶於無菌水或 10mM Tris-HCl, pH8.0~9.0 中，測量 DNA 樣 品純度，25~200 ng/μl , A260/A280 比例必須在 1.65~1.80。將 2.0μl recombinant taq polymerase 加入至 360μl D-mix tube 中(按照 Micro SSPTM Product Reference Table for amount)，vortex 5 秒， 混合均勻。加入 10μl D-mix、taq polymerase 混合液到 negative control reaction tube 中。加入 39μl DNA sample 到 D-mix、taq polymerase 混合液，vortex 5 秒，混合均勻。再從 D-mix tube 中取出 10μl 的混合液，加到 primer set tray 上的 reaction tube (除 了 negative control reaction tube)，用封口膜將管口密封。再將 primer set tray 放入至 Perkin-Elmer 9600 儀器進行 PCR (program 5)。反應 1 小時 16 分鐘後。取出 10μl 反應產物，放 置於 Micro SSP Gel System 中，進行 2.5% agarose gel，150Volt， 42.
相關文件
the larger dataset: 90 samples (libraries) x i , each with 27679 features (counts of SAGE tags) (x i ) d.. labels y i : 59 cancerous samples, and 31
Center for Faculty Development, Department of medical education, Taichung Veterans General hospital 1 School of Medicine, National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan 2.
臺大機構典藏NTUR (National Taiwan University 二 Repository, http://ntur.lib.ntu.edu.tw) 經驗與協助推 動臺灣學術機構典藏TAIR (Taiwan Academic Institutional Repository,
In this talk, we introduce a general iterative scheme for finding a common element of the set of solutions of variational inequality problem for an inverse-strongly monotone mapping
From these results, we study fixed point problems for nonlinear mappings, contractive type mappings, Caritsti type mappings, graph contractive type mappings with the Bregman distance
From the existence theorems of solution for variational relation prob- lems, we study equivalent forms of generalized Fan-Browder fixed point theorem, exis- tence theorems of
Using a one-factor higher-order item response theory (HO-IRT) model formulation, it is pos- ited that an examinee’s performance in each domain is accounted for by a
The purpose of this talk is to analyze new hybrid proximal point algorithms and solve the constrained minimization problem involving a convex functional in a uni- formly convex
