液相層析
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質譜儀的基質效應與因應之道
陳家揚
國立臺灣大學 環境衛生研究所 摘要：樣本中的基質成分可能改變游離源離子化的效率，尤其是抑制離子的形成，造成偵測靈敏度的下 降，以及影響分析的準確度與精密度。由於質譜儀，特別是串連式質譜儀，具有高靈敏度和高選擇性， 加以造成干擾的基質常常未被離子化而未出現於質譜圖，往往造成分析者對於基質效應的忽略。本文簡 介基質效應對於定量的影響，如何加以評估，並探討各種常用來降低或移除基質效應的方法其優缺點和 適用性。 關鍵字：基質效應、離子抑制、電灑游離、大氣壓化學游離、同位素稀釋技術。 隨著游離源（ion source）技術的進展，近年來液 相層析/質譜儀（LC/MS）或液相層析串連式質譜儀 （LC/MS/MS）的應用日漸廣泛。因為質譜儀係偵測 分子離子化之後的質荷比（m/z ratio），因此無法形成 離子或是任何會干擾離子形成的因素，乃成為質譜儀 的罩門。由於 MS/MS 優異的專一性，起初許多使用 者認為樣本不需要太多的樣本前處理，配合短的液相 層析管柱稍做分離即可。但是自從 1996 年 Buhrmann 等人 1發現不同的樣本前處理方式會影響 LC/MS/MS 定 量 的 準 確 度 和 精 密 度 ， 而 且 是 起 因 於 電 灑 游 離 （electrospray ionization, ESI）的離子化受到抑制，基 質效應（matrix effect）的問題開始逐漸受到重視。何謂基質效應與其評估方式
目前小分子於 LC/MS(/MS)的分析，大部分利用
電灑游離將其離子化，其次為使用大氣壓化學游離 （atmospheric pressure chemical ionization, APCI）。 ESI 游離源類似一個液相的電化學反應槽，藉由高速氣體 以及施以高電壓的幫助下，將層析動相（mobile phase） 霧化為小液滴；小液滴經由電荷集中互斥進一步分散
縮小，逐步氣化。APCI 則先以霧化氣體（nebulizer gas）
使層析動相形成小液滴之後，再以加熱方式揮發，並 利用放電針（Corona discharge needle）產生的電子來 啟動游離化的化學反應。基質效應乃指層析過程中同 時間進入質譜儀的其他物質，尤其是一些揮發性較低 的分子，造成待測物（analyte）於上述游離源中離子 化效率不預期地產生變動，進而影響定量的結果2；大 多數情形以游離化被抑制（ion suppression）為多，少 數情形會增強游離化的效率（enhancement）。基質效 應主要改變液相化學過程，例如競爭電荷或質子、改 變液滴分散、降低待測物分佈至液滴表面等2，因此ESI 所受到的影響通常遠大於 APCI3,4。許多造成基質效應 的分子未必會形成離子，所以欲鑑定何種基質成分造 成影響並非易事。再者，基質效應通常隨著待測物與 基質的不同而變，甚至同類型的樣本其基質效應也未 必相同。例如 Matuszewski 等人的研究指出，同一批 次的血漿樣本，分析的再現性為可接受之範圍，但是 將五個不同批次的血清樣本一併觀察時，則分析變異 大幅增加5。 欲評估基質效應，目前較常見用有兩種方式。第 一種為管柱後灌流（post-column infusion），便於評估 不同之樣本前處理所產生之基質效應 2,6：於液相層析 管柱流析後利用 T 型接頭（Tee）連接另一注射器 （syringe pump），連續注射待測物，並將基質萃取物 打入液相層析管柱，可觀察不同層析時間點待測物訊 號變化。若於待測物之滯留時間（retention time）附近 訊號下降，表示基質中之成分會抑制待測物之離子形 成；訊號上升則可能產生增強待測物離子訊號的情形。 第二種方式為將已知量之待測物標準品加入基質萃取 專題報導
物（post-extraction spike），比較其和等量純待測物標 準品的訊號（例如波峰面積（peak area）），可以定量 地描述特定樣本前處理與層析方法時之基質效應5。例 如陳氏等人以第二種方式評估分析類固醇類雌激素受 到 飲 用 水 原 水 基 質 離 子 抑 制 之 效 應 ， 發 現 雌 素 酮 （estrone）和天然動情激素（estradiol）在實際水樣萃 取物時之波峰面積為標準品之 90−95%，基質效應不 大；乙炔動情激素（ethinylestradiol）及雌素醇（estriol） 雖然具有類似結構，但是波峰面積僅剩標準品的67%， 相對上離子抑制效應較大7。Annesley 的研究顯示，不 論使用固相萃取（solid-phase extraction）、液液萃取 （solvent extraction ）、 或 是 蛋白質 沈澱法 （ protein precipitation）處理血漿，基質對於咖啡因（caffeine） 的訊號抑制皆達90%以上8。 若基質效應在樣本間相當一致，基本上對於定量 的再現性影響不大；但是若基質效應變動頗大，將可 能嚴重影響測量結果的再現性與準確性。另一方面， 即使基質效應對於各個分析樣本影響雷同，若其嚴重 抑制離子化，亦會大幅降低質譜儀的偵測靈敏度，因 此仍須盡量降低基質可能的影響。
基質效應因應之道
對付基質效應的首要方式，為盡可能降低隨著待 測物同時進入質譜儀的成分，例如利用較具選擇性的 萃取方法或是進一步淨化樣本，減少萃取出之雜質。 另一方面，可設法抵消基質效應對於定量的影響，例 如使用適當的內標準品（internal standard）。 近年來新型的限制性接觸物質（restricted access material, RAM）逐漸引人注目。該吸附劑所填充之層 析管柱能去除大分子的干擾，只吸附小分子，可進行 線上樣本萃取或淨化；RAM 同時具有膠體滲透（gel permeation）層析和逆相（reversed-phase）層析雙重作 用，因此大分子將被排除，適用於多種複雜基質9。RAM 曾被用於分析血液、尿液、牛乳、食品等樣本中的藥 物或殘留物 10 ，也已成功地運用於分析底泥中的壬基 苯酚類化合物且淨化效果優於 SPE 11。相反地，也有 研究指出，廢水中主要造成基質效應的化合物主要為 分子量小於1000 者，因此 RAM 對於降低廢水樣本的 基質效應作用不大12。 管柱後分流（post-column split）可降低進入質譜 儀之基質成分，可能減低 ESI 的基質效應。ESI 的偵 測主要為濃度相關（concentration dependent），管柱後 分流不會改變待測物的濃度，且因流速的降低使得霧 化的液滴變小，表面積增加，有利於液滴的氣化以及 待測物由液滴表面脫離，提升離子化效率 13。Kloepfer 的團隊發現，以管柱後分流的方式將進入質譜儀的流 量降至 20−50 µL/min 可降低分析廢水時 45−60%的基 質效應 12。不過該研究也指出，管柱後分流的效果隨 待測物而變，且流速過低時反而可能造成傳統的 ESI （即並非特別為低流量設計的 nanospray）霧化過程不 穩定、層析波峰過寬、滯留時間改變等問題。 理想的液相層析條件可降低其他分子一併流析進 入質譜的機會，對於減輕或移除基質效應扮演了舉足 輕重的角色。以大部分分析所使用的逆向層析管柱而 言，因極性較高之分子滯留時間較短，通常較易受到 基質之影響 14。陳氏分析環境水體中的四個類固醇雌 激素，最早流析出之雌素醇，其基質效應約為滯留時 間較長的其他三者的兩倍7；陳氏等的另一研究顯示， 以 C18 固相萃取牛奶中黃麴毒素 M1 並以多功能淨化管柱（multifunctional cleanup column）淨化之後，若
將層析管柱由100 mm 縮短為 50 mm，離子抑制的情
形增為原來之三倍15。Matuszewski 等人分析人類血漿
中之柔沛(finasteride)，將液相層析由兩分鐘延長至六
分鐘時，可大幅降低基質效應16。
良好的樣本淨化，例如使用專一性極高的免疫親 合管柱（immunoaffinity columns, IAC），可移除基質
之干擾。陳氏的團隊指出，以IAC 淨化後的牛乳樣本， 對於黃麴毒素 M1 的分析已幾無基質效應；不論使用 較短的層析管柱或將樣本稀釋，其回收率皆與原有分 析條件時非常接近 15。改用較不受基質干擾的離子源 （例如 APCI），亦可能大幅減輕基質的影響。陳氏的 團隊指出，對於越複雜的基質，APCI 與 ESI 的基質效 應差異越大；以類固醇類雌激素為例，廢水廠放流水 對ESI 的基質效應為 APCI 的 3−40 倍之多，於較髒的 河水其差異更明顯，可達4−90 倍；雖然標準品的訊號 於 ESI 時較強，但是在實際水樣 APCI 反而是較好的 選擇 4。另一方面，APCI 未必能游離非常極性之化合 物，因此將 ESI 換用 APCI 的作法必需視待測物的特 性而定。
使用穩定同位素標定的內標準品（ isotopically-labelled internal standards）是消除基質影響定量準確度
和精密度的利器12,17。穩定同位素標定內標準品基本上 和待測物的理化性質完全相同，於樣本前處理、液相 層析、質譜游離化等過程其反應與行為皆一致，以之 定量將可消去因基質效應對於游離源離子化所產生的 改變。缺點是，穩定同位素標定內標準品通常價格不 斐，而且未必有市售品；此外，其同位素的純度必需 足夠，否則可能有形成偽陽性或高估待測物濃度之虞。 使用結構近似的化合物來擔任內標品為退而求其次的 選擇；因每個液相層析的時間點所一併流析出的成分 不會相同，自然可能的基質效應會有所差異，所以該 內標品的滯留時間必需與待測物相差不遠18,19。陳氏等 人的研究嘗試利用化學結構與待測物黃麴毒素 M1 極 為相似的黃麴毒素 B1 做為內標準品；兩者層析的滯 留時間雖相差僅兩分鐘，但是以內標定量的準確度和 精密度反而不及外標 15。因此除了結構相近的考量之 外，層析滯留時間是否與待測物相近亦非常重要。 在無適當內標準品可用而需使用外標定量的情形 下 ， 利 用 相 同 基 質 添 加 標 準 品 （matrix-matched standards）建立檢量線進行定量，或可大幅降低基質 效應對定量的影響 17，不過是否找得到相同基質而且 不含待測物（blank matrix）不無問題；若使用其他類 似的基質替代，是否基質效應能與原有基質一致？另 一可行的外標定量方式為利用標準品添加（standard addition），但是此分析程序通常繁瑣耗時20。
結 論
質譜儀（尤其是串連式質譜儀）可分辨不同質荷 比之離子，即使液相層析無法完全將所有成分分離， 大部分的情況下在質譜儀亦能將其分開定量，因此近 年來 LC/MS/MS 的方法開發趨向於一次分析多種不同 之化合物（multiresidue analysis），以節省人力與分析 時間、成本。不過這樣的分析方法在處理基質效應議 題時將益形複雜。如前所述，整個層析過程所遇到的 基質效應隨著不同化合物以及滯留時間而變；多化合 物分析時於樣本前處理可能因待測物理化性質不同， 無法進行專一性較好的萃取或淨化以降低基質成分， 良好的液相層析相形之下可能更為重要。若欲以內標 定量，同位素標定的標準品將不易找齊，而光靠少數 幾個內標準品來定量多種待測物恐將很難去除基質效 應的影響。再者，以基質添加標準品外標定量時，要 找到完全不含待測物的空白基質，其困難度將隨著欲 測量的化合物之增多而增加。未來如何能一次分析多 種化合物，但是又能將基質效應對於定量的影響控制 於可接受的範圍，將是發展多化合物分析方法的一大 挑戰。另一方面，同位素稀釋技術（isotope dilution technique）能夠彌補基質效應對定量上的影響，卻無 法以此改善偵測極限，因此盡可能減少基質對於離子 抑制才是正本清源之道。參考文獻
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Matrix Effects on Liquid Chromatography/Mass
Spectrometry and How to Tackle the Problems
Chia-Yang Chen
Institute of Environmental Health, College of Public Health, National Taiwan University
ABSTRACT
Matrix components in the extract may influence the ionization efficiency of an analyte, and in most cases, suppress the formation of ions. This will deteriorate the sensitivity, accuracy, and precision of the analysis using liquid chromatography/mass spectrometry. Because a mass spectrometer, especially a tandem mass spectrometer, possesses unparalleled sensitivity and selectivity, and many of the matrix components are unseen because of not ionized, the issue of matrix effects is usually overlooked. This article introduces the aspects of matrix effects, the methods for evaluating them, and the solutions to the relating analytical problems.
