飲食炸油之畸胎性

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飲食炸油之畸胎性

江宗謙、林毓舜、黃勤方、趙蓓敏 中國醫藥大學營養所

摘要

孕期攝食氧化炸油(oxidized frying oil, OFO)會增加母鼠難產與子代畸形發

生，本實驗假設炸油的畸胎性與活化PPARα干擾維生素A代謝有關。實驗一首先 探討孕期母鼠攝取OFO造成畸胎現象，將母鼠分為SO與OFO組，懷孕全程分別 給予含10%新鮮油(SO)或炸油(OFO)飲食，孕期第18天犧牲，結果OFO組胚胎外 觀畸形與骨骼異常顯著增加，病理切片顯示肺及視網膜發育不全，肝臟維生素A 濃度也顯著降低。實驗二探討炸油的畸胎性與PPARα活化及維生素A代謝干擾之 關係，將炸油區分為極性(PO)與非極性物(NP)，母鼠分三組，懷孕全程分別給予 含10%新鮮油(SO)、炸油極性(PO)或非極性物(NP)飲食。從母親與胚胎肝臟 PPARα下游基因表現可知PPARα活化力為SO<NP<PO，畸胎與骨骼發育不良機 率與PPARα活化一致，且PO組發生率更高於實驗一的OFO組，不論母親或胚胎 均發現PO組維生素A酸(RA)合成與分解相關酵素基因表現偏離正常對照組 (SO)。已知胚胎發育期間需要RA精確的時空 (Spatial-temporal) 調節，本研究 證實炸油具有畸胎性，除造成胎兒維生素A缺乏，也會干擾母親與胎兒的RA合 成與分解，至於畸胎性是否與PPARα活化有關則有待進一步研究證實。

關鍵字： Oxidized frying oil; Peroxisome proliferator-activated receptor α;

Retinoic acid; Developmental toxicity

前言

油炸食物是常見的烹調方式，於 1960 年至今，有許多研究探討攝食氧化炸

油(Oxidized frying oil, OFO)的安全性及其影響機制，包括炸油飲食在鼠類造成 生長不良、誘發肝臟 cytochrome P450 解毒系統、加速維生素 E 耗損及增加過氧

化壓力、改變脂質代謝等。PPARα 是調控脂肪恆定的轉錄因子(1)，趙等人利用

動物實驗證實炸油可誘發肝臟 PPARα 下游基因包括 acyl-CoA oxidase (ACO)及

cytochrome P450 family4A (CYP4A)表現，促使肝脂質走向異化分解(2)，為尋找

炸油PPARα 活化物，將炸油區分為極性與非極性物，利用報導基因測試轉錄活

化，結果證實炸油PPARα 活化物存在極性區分物，推測可能為氧化脂肪酸 (3)。

最近本實驗室發現懷孕母鼠攝取 OFO 容易有難產與吃仔行為，補充維生素 E 不能克服(4)，仔細觀察發現與胚胎畸形有關，已知維生素 A 缺乏或過多均會

造成畸胎(5,6)，且維生素 A 酸(retinoic acid, RA)透過與轉錄因子 retinoic acid

receptor (RAR)及 retinoid X receptor (RXR)作用，扮演型態原(morphogen)角

色，因此我們假設炸油可能干擾維生素 A 代謝。維生素 A 有多種 vitamers，包 括視網酯(retinyl ester)、視網醇(retinol)、視網醛(retinal)及視網酸(retinoic acid,

RA)，retinol 與 retinal 藉氧化還原互相轉換，而 retinal 氧化為 RA 為不可逆反

應，由 RALDH (RALDH1, RALDH2 及 RALDH3)負責，而 RA 則透過 CYP26

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從文獻中發現 C57BL6J 小鼠投予 PPARα activator 如 clofibrate，發現肝臟

RRD 及 RALDH 基因表現增加(7,8)，在細胞模式中給予 HepG2 cell line 不同濃

度 clofibrate，則呈劑量反應性降低 CYP26A1 與 CYP26B1mRNA 量(9)。此外 環境汙染物如塑化劑[di(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP] 和鐵弗龍成分全氟辛

Perfluorooctanoic acid (PFOA)，與炸油一樣都是 PPARα activators (2,10,11)，已

有報導暴露於這些環境汙染物會造成子代的發育毒性，利用PPARα 基因剔除鼠 已證明部份環境汙染物的胚胎毒性與 PPARα 活化有關(10,11)，因此我們假設炸 油的畸胎性與活化PPARα 干擾維生素 A 代謝有關。實驗一與二分別探討: 1. 孕 期母鼠攝取 OFO 造成畸胎現象, 2. 炸油的畸胎性與 PPARα 活化及維生素 A 代 謝干擾之關係。 圖 1 維生素 A 代謝相關酵素

材料與方法

臟測定PPARα 下游基因(CYP4A10 及 ACO)及維生素 A 代謝相關酵素(RDH10、 RRD、Raldh、CYP26 等)基因表現。 二、氧化炸油製備 新鮮黃豆沙拉油(統一食品公司)於鐵鍋以 205 ± 5 ℃油炸麵片，每日加熱 6 小時，連續 4 日，此為 OFO。測定酸價和共軛雙烯指標顯示本實驗所用炸油酸 敗程度與先前研究相近(4)。 三、炸油區分

矽膠管柱事先以 n-hexane 流洗，管柱頂端加入炸油後以 petroleum ether :

ether=87:13 流洗，非極性區分物(NP)會先流洗出，以薄層層析(TLC)確認流洗

3 NP=46.22%、PO=51.12%，TLC 結果如圖 2，值得注意的是 NP 汙染到少量 PO。 圖 2 自炸油分離非極性與極性區分物之 TLC 結果 四、 動物飼養 6 週齡 C57BL/6J(購自國家動物中心)適應一週後，母鼠與公鼠進行交配，隔日 觀察母鼠陰栓確定交配並視為懷孕第 1 天(d1)，將懷孕母鼠依實驗需求分組，懷 孕全程分別給予飼料，本實驗使用四種實驗飼料(SO、OFO、NP and PO diet)， 基本組成是依據 AIN-93 M 配方修改而成，只有油脂種類不同，脂肪配方皆為

10%。本實驗經中國醫藥大學實驗動物照護及使用委員會審查同意。

五、胚胎骨骼染色

胎胚浸泡 70%酒精，去除內臟後，改浸泡 0.5% KOH(含 Alizarin Red S) 1 天、

0.25% KOH 1 天、0.125% KOH 1 天、50% glycerol 至澄清、70% ethanol 1

天，最後保存於 100% glycerol，於解剖顯微鏡下行細部骨骼檢查。 六、維生素 A 定量

肝臟以 PBS 均質後，加入絕對酒精(含 1% pyrogallo)，水浴 70℃1min。加入 60%

KOH 進行皂化(水浴 70℃，30min)。最後以 n-Hexane (含 0.00125% BHT)萃取。 HPLC 條件:管柱 RP18，移動相為 methanol 含 8%H2O，流速 1.5 mL/min，利

用 UV 偵測 340nm，對照維生素 A 標準品(all trans retinol, Sigma)定量。 七、RNA 抽取與 qRT-PCR

組織加入適量 TRIzol 均質，再以市售 RNA 抽取套組(Qiagen)純化 RNA。 mRNA 含量以 Taqman one step RT-PCR Master Mix 試劑套組(ABI)及市售 probe & primer (ABI)偵測，於 Bio-Rad Miniopticon Real time PCR 進行反應。

八、統計分析

實驗結果以 Mean ± SD 表示。組間差異以 One-Way ANOVA 分析(所有數據

均事先檢定為常態分布，若非常態則轉對數值)，SO 與 OFO 兩組以 t test 比較，

SO、NP 與 PO 三組以 duncan 比較；發生率以 chi-square test 倆倆相互比較，

p<0.05 判定為顯著差異。

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結果與討論

一、攝食 OFO 的畸胎現象 (一)胚胎存活率與外觀

表一可見 OFO 組胎仔有顯著較高的死亡率(包括半成形或成形但無心跳)， 成形胎兒之外觀異常方面，OFO 組可見臟器外露(Visceral anomalies)、內出血或 瘀青(Haematoma)、水腫(Edema)、眼畸型(包含無眼及小眼)( Eye defect)及無腦

(Anencephaly) (圖 3 A)，相對於 SO 對照僅偶爾發生眼睛異常。統計結果炸油顯 著增加內臟外露(4.76%)及水腫(3.16%)，全部畸型發生率 OFO 組顯著大於SO 組(P<0.05)，是對照的 16 倍(表一)。 (二)胚胎骨骼發育 如圖3 B 所示，骨骼異常包含頭骨異常(枕骨鈣化不全)、胸骨<6、沒有胸骨、 胸椎骨<13、薦尾椎斷裂、脊椎側彎等，OFO 組的頭骨異常、胸骨<6 及 total 骨 骼異常數顯著高於 SO 組(表二)，部分 SO 胚胎也觀察到胸骨<6 是因為我們取的 是 d18 的胚胎，胸骨數尚未發育完全。 (三)胚胎組織病理 組織病理診斷如圖 3 C，以 SO 為正常對照，相較下 OFO 組胚胎有肺臟發育 不全 (Hypoplasia)、眼睛視網膜發育不全(retinal hypoplasia)、及腹壁結構異常 因而使肝胃腸外露，其他臟器沒有明顯異常。 (四) 維生素 A 營養狀況 雖然兩組母親飲食維生素 A 供應相當，但我們懷疑炸油可能干擾體內維生素 A 代謝，定量母鼠及胚胎肝臟維生素 A (包括 RE 與 retinol)含量發現母親肝臟維生 素 A 兩組無差異，但胚胎肝臟維生素 A 含量 OFO 組顯著低於 SO 組 (如圖 4)。 表一 母鼠懷孕期間攝取炸油之 d18 胚胎存活率與外觀異常 Observation SO OFO No of fetus 137 189 Mortality 0% (0/137) 13.23% (25/189)* External anomalies Visceral anomalies 0% (0/137) 4.76% (9/189)* Edema 0% (0/137) 3.17% (6/189)* Haematoma 0% (0/137) 1.59% (3/189) Eye defect 0.73% (1/137) 1.59% (3/189) Anencephaly 0% (0/137) 0.53% (1/189) Total 0.73% (1/137) 11.6% (22/189)*

The difference between SO and OFO groups was analyzed by χ2

5 表二 母鼠懷孕期間攝取炸油之 d18 胚胎骨骼發育 Observation SO OFO No of fetus 15 36 頭骨異常 0% (0/15) 33.33% (12/36)* 胸骨<6 26.67% (4/15) 66.67%(24/36)* 沒有胸骨 0% (0/15) 8.33%(3/36) 胸椎骨<13 0% (0/15) 2.78%(1/36) 胸椎骨斷裂 0% (0/15) 2.78%(1/36) 薦尾椎斷裂 0% (0/15) 5.56%(2/36) 脊椎側彎 0% (0/15) 2.78%(1/36) Total 26.67% (4/15) 80.56%(29/36)* The difference between SO and OFO groups was analyzed by chi-square test, * P＜0.05

(A) (B) (C) 圖 3 母鼠懷孕期間攝取炸油之 d18 胚胎外觀(A)、骨骼(B)及組織病理(C)異常 OFO 組 Normal Visceral anomalies Edema

Haematoma Eye defect Anencephaly

沒有胸骨

SO 組

胸骨<6 胸椎骨<13 薦尾椎斷裂 脊椎側彎

OFO 組

頭骨異常

SO 組: Lung OFO 組: Lung Hypoplasia (retardation of lung branching)

SO 組: Eye OFO 組: Eye Retinal hypoplasia

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(A) (B)

圖 4 母鼠懷孕期間攝取炸油於 d18 母親(A)與胚胎(B)肝臟維生素 A 含量 The difference between SO and OFO groups was analyzed by student’s t test. *P<0.05.

二、OFO 的畸胎性與 PPARα活化及維生素 A 代謝干擾關係

(一)肝臟 PPARα 活化效應

已知炸油的 PPARα 活化物存在極性區分物，由於 NP 帶少量汙染 PO，推測

攝取 SO、NP 與 PO 飲食小鼠肝臟 PPARα 活化效應應為 SO<NP<PO，在懷孕 d18 母鼠測定肝臟 CYP4A10 mRNA (圖 5 A)，其胚胎測定 CYP4A10 及 ACO (圖 5

B)，PPARα 下游基因表現均呈現 SO<NP<PO，符合預期。 (二)畸胎效應 表三所示 PO 組 d18 胚胎與 SO 和 NP 組相比有顯著較高的死亡率(24.39%)， 比之前的 OFO 組死亡率(13.23%)來的更高。成形胎兒之外觀異常方面，也與 PPARα 活化一致，呈現 SO<NP<PO，PO 組總畸胎率高達 31.71%，顯著高於 SO 與 NP 組，也比之前 OFO 組(12.17%)來的更高，似乎孕期胚胎PPARα 活化程 度越高，胚胎死亡及畸胎率越高。 骨骼異常可以看到有頭骨異常、胸骨<6、胸椎骨<13、薦尾椎斷裂等(表四)， 其中 PO 組頭骨異常(枕骨鈣化不全)顯著高於 SO 與 NP 組，PO 組骨骼異常機率 顯著高於 SO 組，NP 組則介於 PO 與 SO 間。 (三)維生素 A 代謝干擾效應 母鼠肝臟 retinoids 代謝相關基因中負責 RA 生成的 Raldh2 表現 PO 組顯著低 於 SO 組，NP 居中；清除 RA 的 CYP26A1 與 CYP26C1 基因表現 PO 與 NP 組 顯著低於 SO 組，但 CYP2C39(在小鼠參與 RA 代謝)與 CYP26B1 則是 PO 組顯 著高於 SO 與 NP 組(圖 6 A)。胚胎方面，RDH10、Raldh1、CYP2C39 與 CYP26A1 mRNA 以 PO 組顯著高於 SO 與 NP 組，Raldh3 則是 PO 顯著低於 NP(圖 6B)。 炸油影響母親與胚胎 retinoids 代謝基因表現之變化並不一致，目前無法斷定炸 油的畸胎性肇因於胚胎 RA 過多或缺乏，但可肯定炸油的確干擾 RA 合成與分解。 0 400 800 1200 1600 SO OFO μg/ L iv er

7 (A) (B)

圖 5母鼠懷孕期間攝取炸油區分物於 d18 對母親(A)及胚胎(B)肝臟 PPARα 下游

基因表現影響 Labeled means without a common letter differ, P<0.05.

表三 母鼠懷孕期間攝取炸油區分物之 d18 胚胎存活率與外觀異常 Observation SO NP PO No of fetus 40 44 41 Mortality 0% (0/40) 2.27%(1/44) 24.39%(10/41)#* External anomalies Visceral anomalies 0% (0/40) 0% (0/44) 7.31% (3/41) Edema 0% (0/40) 2.27% (1/44) 4.87% (2/41) Haematoma 2.5% (1/40) 2.27% (1/44) 12.2% (5/41) Eye defect 0% (0/40) 0% (0/44) 4.87% (2/41) Anencephaly 0% (0/40) 0% (0/44) 2.44% (1/41) Tail bending 0% (0/40) 2.27% (1/44) 0% (0/41) Total 2.5% (1/40) 6.82% (3/44) 31.71%(13/41)#* The difference between groups was analyzed by chi-square test, # p＜0.05, PO vs. SO; * p＜0.05, PO vs. NP.

表四 母鼠懷孕期間攝取炸油區分物之 d18 胚胎骨骼發育 Observation SO NP PO No of fetus 8 10 10 頭骨異常 0% (0/8) 10%(1/10) 60%(6/10) *# 胸骨<6 50% (4/8) 80%(8/10) 90%(9/10) 胸椎骨<13 0% (0/8) 20%(2/10) 30%(3/10) 薦尾椎斷裂 0% (0/8) 10%(1/10) 20%(2/10) Total 50% (4/8) 80%(8/10) 100%(10/10)# The difference between groups was analyzed by chi-square test, # p＜0.05, PO vs. SO; * p＜0.05, PO vs. NP.

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(B)

圖 6 母鼠懷孕期間攝取炸油區分物於 d18 對母親(A)及胚胎(B)肝臟維生素 A 代 謝相關基因表現影響 Labeled means without a common letter differ, P<0.05.

結論: 母鼠懷孕期間攝取炸油飲食增加胎兒外觀畸形、骨骼與組織發育不良，炸 油除造成胎兒維生素 A 缺乏，也會干擾母親與胎兒的 RA 合成與分解，至於炸 油對 retinoids 代謝干擾是否與 PPARα有關，未來將藉助 PPARα基因剔除鼠進 一步證實。

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