利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測活細胞釋放之神經傳導物

碩士論文

Department of Chemistry College of Science National Taiwan University

Master Thesis

利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測活細胞釋放之 神經傳導物

An ultra-sensitive nanowire-transistor biosensor for detecting neurotransmitters release from living cells under stimulation

謝映竹 Ying-Jhu Hsieh

指導教授： 陳逸聰 博士 Dr. Yit-Tsong Chen

中華民國 一零四年 一月

Jan. 2015

口 試 委 員 會 審 定 書

利 用 超 靈 敏 矽 奈 米 線 場 效 應 電 晶 體 偵 測 活 細 胞 釋 放 之 神 經傳導物

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本論文係謝映竹君（學號！^^)〗^^^^^。在國立臺灣大學化學系完 成 之 碩 士 學 位 論 文 ， 於 民 國 1 0 4 年 0 1 月 2 9 日 承 下 列 考 試 委 員 審 查 通 過 及 口 試 及 格 ， 特 此 證 明 。

口試委

( 指 導 教 授 ）

誌謝

兩年碩士生涯要在此刻畫下句點，因為身旁許多人的幫助，讓我能夠順利取 得碩士學位。首先，我要感謝我的指導教授─陳逸聰博士，在我大學畢業後，聘 請我為研究助理，協助我成功申請上研究所。謝謝老師在這兩年半來提供我豐富 的資源，教導我做研究應具備的態度，不厭其煩督促我努力學習。感謝潘建源教 授與戴桓青教授在百忙之中，願意抽空擔任我的碩士學位口試委員。謝謝潘教授 提供我們在生物研究上的想法，指導我進行細胞實驗。謝謝戴教授對於我的研究 給予許多具有建設性的建議。

謝謝李博仁學長教會我許多實驗與技巧，即使在離開實驗室後，也總是耐心 地為我解答研究上的疑問。謝謝楊婉鈴學姐，在我剛來到實驗室時，教導我許多 實驗。謝謝劉佳融學長提供我場效應電晶體晶片，也經常出現一些驚人之舉，帶 給我們歡笑。謝謝葉乃馨同學幫我培養細胞，一起經歷了很多失敗的實驗過程，

仍然熱心積極地協助我。謝謝廖均達學長介紹家教給我，讓我有緣認識到為人慷 慨又貼心的學生家長。謝謝盧怡穎學姊，在我陷入困境時，給予鼓勵與支持，與 我分享撫慰人心的音樂。謝謝蔡田畯學長給予我許多實驗上的建議，指引我找出 研究問題的答案。謝謝陳彥溪學長教我使用研究所需的軟體。謝謝和我同時間入 學的郭嘉，總是熱心幫忙我解決問題，而你對研究的熱情也感染了我。謝謝巧貞 學姊，妳對科學研究嚴謹的態度，是我們的好榜樣。謝謝 Subhasree 在我口試的 前幾個月，幫助我做實驗和修改論文摘要。謝謝子庭、祈昂、欽富、旭正、郭嘉 以及佳融，你們是我的好夥伴，和你們聊天、吃飯和哈哈大笑時，讓我暫時忘了 所有的煩惱。

謝謝我的朋友 Tracy、姿蒨和幽嵐找我聚餐聊天，把我拉出枯燥乏味的生活。

謝謝一打、小曼曼、丁丁、雅雅、米樂，未來的每一年我們都要繼續相約一起旅 行。謝謝我現在的室友阿鄧，出國旅行總是不忘買美味的小點心給我。謝謝我的

摯友陳小柚，我們一起經歷了高中、大學和研究所的成長過程，不論我做什麼，

妳總是最挺我的那個人，陪伴我哭，陪伴我笑，陪伴我度過人生中的低潮，謝謝 妳這九年多來對我的照顧與關心。

最後，我要謝謝我親愛的家人們，謝謝我的爸媽用心養育我，你們是我最棒 的後盾，給予我最大的自由，讓我選擇我想做的事。謝謝從我小時候就對我疼愛 有加的大姑姑。謝謝我的爺爺與奶奶，總是給予我許多關愛。謝謝身邊所有關心 我、照顧我以及陪伴我的所有家人和朋友，沒有你們就沒有現在的我。

摘要

過去十年來，由於矽奈米線場效應電晶體 (silicon nanowire field-effect transistor , SiNW-FET) 具有可調控的導電性與生物相容性，其作為生物感測器，

在生物學研究的應用上廣受矚目。將矽奈米線表面修飾受體，SiNW-FET 即可即 時性並且選擇性偵測特定的目標分析物，同時 SiNW-FET 亦具有高靈敏度與免 標記等特性。到目前為止，SiNW-FET 已經成功地被應用於偵測蛋白質、DNA、

癌症標記物、病毒以及其他生化分子。

本論文中有兩個研究主題，第一個研究主題是以超靈敏奈米線電晶體生物感 測器偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放的多巴胺。多巴胺 (dopamine, DA) 是重 要的神經傳導物，負責神經細胞的訊號傳遞，並且與許多疾病有關。然而，在這 些病患血液或尿液中的 DA 濃度非常低，而現有的電化學感測器對 DA 的偵測 極限約為 10^-9 M，要用於檢測這些疾病是非常困難的。在此研究中，我們藉由 在網路式(multiple-parallel-connected, MPC) 矽奈米線場效應電晶體上修飾去氧 核醣核酸適體 (DNA-aptamer) ，建構出一個具有高靈敏度與選擇性 DA 感測器，

稱之為 (MPC DA-specific aptamer/SiNW-FET)。實驗結果證明 MPC DA-specific aptamer/SiNW-FET 對 DA 的偵測極限可低於 10^-11 M 且其可區分開其他化學 相似物 (包含抗壞血酸、鄰苯二酚、苯乙胺、酪胺酸、腎上腺素和正腎上腺素)，

選擇性地偵測 DA。MPC DA-specific aptamer/SiNW-FET 更進一步應用於即時偵 測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放的 DA，實驗結果顯示以缺氧刺激使 PC12 細 胞釋放 DA 的機制中，細胞內鈣離子的上升主要是細胞外的鈣離子經由鈣離子 通道運送到細胞內而所導致的，而並非儲存在細胞內胞器的鈣離子釋放出來所引 起。

第二個研究主題是以修飾 DNA-aptamer 之矽奈米線場效應電晶體偵測神 經肽 Y。神經肽 Y (neuropeptide Y, NPY) 是重要的神經傳導物，負責神經細胞

的訊號傳遞且與許多疾病有關。目前常用於偵測與定量多巴胺的方法有酵素結合 免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 與液相層析質譜儀 (Liquid chromatography–mass spectrometry, LC-MS/MS)，然而這兩種方法皆無法 進行即時偵測，因此在細胞釋放神經傳導物研究的應用上有其限制。在本研究中，

我們藉由在 SiNW-FET 上修飾 DNA-aptamer 作為受體，建構出一個可即時性 與選擇性偵測 NPY 的生物感測器，稱之為 NPY-specific aptamer/SiNW-FET。

實驗結果顯示 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 偵測 NPY 的線性工作範圍為 10^-7~10^-5 M且偵測極限為 24 nM，且其亦成功地被應用於即時偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之多巴胺。

在本研究中，本實驗室的李博仁博士與劉佳融研究助理負責製作 MPC SiNW-FET；陳彥溪研究助理與潘建源教授實驗室的葉乃馨同學負責培養 PC12 細胞；我負責量測 MPC SiNW-FET 的電性，確認其品質，並且將其應用於偵測 多巴胺和神經肽Y等生化分子。

關鍵字：矽奈米線場效電晶體、多巴胺、神經肽Y、適體、生物感測器

Abstract

Over the past decade, silicon nanowire field-effect transistors (SiNW-FETs) with their tunable conductivity and biocompatibility have become significant biosensors.

Moreover, the thin silicon oxide sheathes on SiNW-FETs are easily functionalized with selected receptors prior to bio-detections, providing strong and specific binding affinity for biomolecules. Because of strong interaction between the receptors and biomolecules, modified SiNW-FETs have been employed for the detections of protein, DNA, cancer markers, viruses, and other biochemical species.

The first part of this thesis focuses on the detection of dopamine (DA) released from living PC12 cells under hypoxic stimulation using an ultrasensitive SiNW-FET biosensor. DA is an important neurotransmitter which plays crucial roles in neuronal signal transduction and causes several critical illnesses. However, it is difficult to detect the extremely low DA content in patients using existing electrochemical biosensors with detection limits typically around nanomolar levels (∼10⁻⁹ M). This thesis describes a DNA-aptamer modified multiple-parallel-connected (MPC) SiNW-FET (referred as MPC DA-specific aptamer/SiNW-FET) device for ultrasensitive and selective DA detection. The MPC DA-specific aptamer/SiNW-FET has been employed to improve the detection limit of DA to <10⁻¹¹ M and the

specifically distinguishing ability from other chemical analogues, such as ascorbic acid, catechol, phenethylamine, tyrosine, epinephrine, and norepinephrine. The MPC DA-specific aptamer/SiNW-FET was also employed to monitor DA release under hypoxic stimulation from living PC12 cells in real time. The experimental results revealed that the increase in intracellular Ca²⁺ that is required to trigger DA secretion is dominated by an extracellular Ca²⁺ influx, rather than the release of intracellular Ca²⁺ stores.

The second project of the thesis focuses on the detection of neuropeptide Y (NPY) using a DNA-aptamer modified SiNW-FET. NPY is an important neurotransmitter and is related with several critical diseases. Two most common detection and quantification techniques for NPY are enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/MS).

However, both techniques lack the real-time detection ability for NPY and are not suitable for cellular investigation. Herein, we report a DNA-aptamer modified SiNW-FET (referred to as NPY-specific aptamer/SiNW-FET) applicable for the real-time and selective detection for NPY. The linear working range of the NPY-specific aptamer/SiNW-FET for NPY detection spanned from 10^-7 to 10^-5 M and the limit of NPY detection is 24 nM. The NPY-specific aptamer/SiNW-FET has shown a detection specificity that is able to distinguish NPY from other

neurotransmitters, such as dopamine. Furthermore, this NPY-specific aptamer/SiNW-FET has been successfully applied for real-time monitoring DA release from living PC12 cells under hypoxic stimulation.

Key words：SiNW-FET; dopamine; neuropeptide Y; aptamer; biosensor

目錄

誌謝 ... ii

摘要 ... iv

Abstract ... vi

目錄 ... ix

圖目錄 ... xii

表目錄 ... xv

簡稱用語對照表 ... xvi

第一章 序論 ... 1

1.1 文獻回顧 ... 1

1.1.1 生物感測器 ... 1

1.1.2 矽奈米線場效電晶體生物感測器 ... 3

1.1.3 矽奈米線場效應電晶體的製備 ... 6

1.2 研究動機與目的 ... 10

1.2.1 利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測 PC12 細胞釋放之多巴胺 ... 10

1.2.2 利用修飾去氧核醣核酸適體之矽奈米線場效應電晶體偵測神經肽 Y 15 第二章 實驗方法 ... 18

2.1 網絡式矽奈米線場效應電晶體的製作 ... 18

2.1.1 金奈米粒子的合成 ... 18

2.1.2 硼參雜矽奈米線的合成 ... 20

2.1.3 晶片製程 ... 23

2.1.4 元件電性量測 ... 27

2.1.5 感測溶液槽的製備 ... 30

2.2 利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之 多巴胺 ... 31

2.2.1 矽奈米線表面修飾 ... 31

2.2.2 多巴胺與其他分子之偵測 ... 34

2.2.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之多巴胺 ... 37

2.2.4 朗謬耳吸附方程式 ... 38

2.3 利用修飾去氧核醣核酸適體之矽奈米線場效應電晶體偵測神經肽 Y ... 40

2.3.1 矽奈米線表面修飾 ... 40

2.3.2 神經肽 Y 與其他分子之偵測 ... 42

2.3.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之神經肽 Y ... 43

第三章 實驗結果與討論 ... 44

3.1 網絡式矽奈米線場效應電晶體的製作 ... 44

3.1.1 矽奈米線合成結果 ... 44

3.1.2 元件電性分析 ... 46

3.2 利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之 多巴胺 ... 48

3.2.1 表面修飾證明 ... 48

3.2.2 多巴胺與其他分子之偵測 ... 49

3.2.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之多巴胺 ... 54

3.3 利用修飾去氧核醣核酸適體之矽奈米線場效應電晶體偵測神經肽 Y ... 57

3.3.1 表面修飾證明 ... 57

3.3.2 神經肽 Y 與其他分子之偵測 ... 58

3.3.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之神經肽 Y ... 65

參考文獻 ... 69 附錄 ... 73 

圖目錄

圖 1- 1 場效應電晶體奈米感測器之結構 ... 5

圖 1- 2 p 型奈米線場效應電晶體之工作原理 ... 5

圖 1- 3 以 ”top-down” 方法製作 SiNW-FET 之流程圖 ... 7

圖 1- 4 以 ”bottom-up” 方法製作 SiNW-FET 之流程圖 ... 9

圖 1- 5 多巴胺之化學結構。 ... 10

圖 1- 6 DA-specific aptamer 的結構示意圖 ... 14

圖 1- 7 在缺氧刺激下細胞釋放多巴胺之機制示意圖 ... 14

圖 1- 8 神經肽 Y 之結構 ... 17

圖 2- 1 (A) 以 VLS 機制合成矽奈米線示意圖。(B) 矽與金的二元相圖 ... 20

圖 2- 2 CVD 合成系統示意圖 ... 22

圖 2- 3 MPC SiNW-FET 之外層電極光罩設計圖 ... 24

圖 2- 4 接觸轉印矽奈米線之流程圖。 ... 25

圖 2- 5 MPC SiNW-FET 之內層電極之光罩設計圖 ... 26

圖 2- 6 (A) Isd-Vsd量測系統 (B) 晶片與探針台 ... 27

圖 2- 7 Isd-Vsd量測系統示意圖 ... 27

圖 2- 8 (A) 打線機 (B) 感測溶液槽實驗裝置 ... 28

圖 2- 9 Isd–Vg 量測系統示意圖 ... 29

圖 2- 10 (A) PDMS 化學結構式 (B) 感測溶液槽 ... 30

圖 2- 11 DA-specific aptamer 固定化之流程圖 ... 32

圖 2- 12 NPY-specific aptamer 固定化之流程圖 ... 41

圖 3- 1 硼摻雜矽奈米線之光學影像圖 ... 44

圖 3- 2 硼摻雜矽奈米線之 SEM 影像圖 ... 45

圖 3- 3 硼摻雜矽奈米線之 HR-TEM 與 ED 影像圖 ... 45

圖 3- 4 MPC SiNW-FET 之光學影像圖 ... 46

圖 3- 5 p-type SiNW-FET 的 Isd-Vsd 圖 ... 47

圖 3- 6 p-type SiNW-FET 的 Isd-Vg 圖 ... 47

圖 3- 7 二氧化矽基板/矽基底表面修飾 FITC-aptamer 之螢光影像圖 ... 48

圖 3- 8 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 與 PTMS-modified SiNW-FET 量測50 圖 3- 9 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的多巴胺 (DA) 之實驗 結果 ... 52

圖 3- 10 CDA 和

ΔV

/V

圖 3- 11 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測 10 pM DA 之電訊號變化 圖 ... 53

圖 3- 12 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的腎上腺素 (EP) 與正 腎上腺素 (NE) 之實驗結果 ... 53

圖 3- 13 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞 釋放 DA 之電訊號變化圖 ... 55

圖 3- 14 以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測不同缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放 DA 之電訊號變化圖 ... 56

圖 3- 15 在二氧化矽基板/矽基底上修飾 FITC-aptamer 後之螢光影像圖 ... 57

圖 3- 16 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 與 PTMS-modified SiNW-FET 量測 NPY 等分子之實驗結果 ... 59

圖 3- 17 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果 (Device 1) ... 61

圖 3- 18 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果 (Device 2) ... 61

圖 3- 19 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果 (Device 3) ... 62 圖 3- 20 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測不同濃度的 NPY 之實驗結果

(Device 4) ... 63 圖 3- 21 CNPY 和

ΔV

/V

釋放 NPY 之電訊號變化圖 ... 66 圖 3- 23 以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測不同缺氧刺激下的 PC12

細胞釋放 NPY 之電訊號變化圖 ... 67 

表目錄

表 1- 1 比較不同的電化學多巴胺感測器之偵測極限 ... 13 表 1- 2 比較不同分析方法量測 NPY 之偵測極限 ... 17  

表 2-

1 不同濃度磷酸鹽緩衝溶液的 Debye length 和離子強度 ... 35 

表 3-

1

簡稱用語對照表

AA — ascorbic acid, 抗壞血酸

APTMS — 3-aminopropyl trimethoxysilane Au NPs — gold nanoparticles, 金奈米粒子 BOE — buffer of oxide etching, 氫氟酸

CFS — chronic fatigue syndrome, 慢性疲勞症候群

CNT-FET — carbon nanotube field-effect transistor, 奈米碳管場效應電晶體 CT — catechol, 鄰苯二酚

CVD — chemical vapor deposition, 化學氣相沉積法 D — drain electrode, 汲極

DA — dopamine, 多巴胺 DTT — dithiothreitol

ED — electron diffraction, 電子繞射儀

ELISA — Enzyme-linked immunosorbent assay, 酵素結合免疫吸附法 EP — epinephrine, 腎上腺素

ER — endoplasmic reticulum, 內質網 FITC — Fluorescein isothiocyanate G — conductance, 電導

HR-TEM — high-resolution transmission electron microscopy, 高解析度穿透式電 子顯微鏡

Isd — source-drain current, 源-汲極電流 ITO — indium tin oxide

Kd — dissociation constant, 解離常數

LC-MS/MS — liquid chromatography–mass spectrometry, 液相層析質譜儀 MBS —

3-maleimidobenzoic acid N-hydroxy succinimide ester MC — mitochondria, 粒線體

MFC — mass flow controller, 質量流量控制器

MPC SiNW-FET — multiple-parallel-connected silicon nanowire field-effect transistor, 網絡式矽奈米線場效應電晶體

MPTMS — 3-Mercaptopropyl trimethoxysilane NE — norepinephrine, 正腎上腺素

NPY — neuropeptide Y, 神經肽 Y PBS — phosphate buffer saline PDMS — polydimethylsiloxane PEA — phenethylamine, 苯乙胺 PET — polyethylene terephthalate PTMS — propyl trimethoxysilane

PTSD — posttraumatic stress disorder, 創傷後壓力症候群 RIE — reactive ion etching, 反應性離子蝕刻

S — source electrode, 源極

SAMs —self-assembled monolayers, 自組裝單分子膜

SELEX — systematic evolution of ligands by exponential enrichment SEM — scanning electron microscopy, 電子顯微鏡

SiNW-FET — silicon nanowire field-effect transistor, 矽奈米線場效應電晶體 T — thymine, 胸腺嘧啶

TNT — titanate nanotubes TR — tyrosine, 酪胺酸 U — uracil, 尿嘧啶

VLS — vapor-liquid-solid, 氣-液-固 λD — debye length

第一章 序論

1.1 文獻回顧

1.1.1 生物感測器

生物感測器 (biosensor) 是一種用於定性與定量分析生化分子的重要工具，

由具特異性的的生物辨識元件 (bioreceptor)、轉換元件 (transducer) 以及電子系 統所組成的分析裝置，可以將待測分子之生化性訊號轉變成電子訊號。生物辨識 元件可依其特性分為兩大類，第一類是催化型生物辨識元件，如酵素、微生物和 組織等可選擇性地催化待測分子，所產生之代謝產物經由轉換元件將生化性訊號 轉變成電子訊號；第二類為親和型生物辨識元件，如抗體、受體與核酸等對特定 的待測分子具有親和力，當這類生物辨識元件與待測分子結合時，所成產生之電 化學、光、熱或質量變化由轉換元件偵測而轉換成電子訊號，電子訊號再經由後 端的電子系統放大與處理後，呈現為具有意義的物理量[1]。依照轉換元件的不 同，可將生物感測器分類為電化學生物感測器、半導體場效應電晶體感測器、光 纖生物感測器與壓電晶體生物感測器。與傳統分析方法比較，生物感測器具有高 靈敏度 (high sensitivity)、高選擇性 (excellent selectivity)、免標記 (label-free) 和 即時偵測 (real-time detection) 等特性，且其所需樣品量少、方便、快速、體積 小。

生物感測器的研究至今已超過半個世紀，被廣泛地應用在臨床檢驗[2]、毒 性測試[3]、生物分析[4]、食品產業[5]與環境監測[6]等領域，由於這些領域應用 上的需求，新穎的生物感測技術仍持續發展中。若要應用於生物系統的研究中，

一個功能良好的生物感測器需具備堅固、超靈敏度、選擇性、快速反應與即時偵 測等基本特性。由於矽奈米線場效應電晶體 (silicon nanowire field-effect transistor, SiNW-FET) 具有上述等優點，且其具有可調控的導電性、生物相容性和表面容 易進行生物辨識元件的固定化等特性，近十年來，SiNW-FET 被廣泛地應用於偵

測蛋白質、DNA、癌症標記物、病毒等生化分子，顯示出 SiNW-FET 提供一個 實用且具有潛力的偵測平台，將來可在推廣至更多生物學的研究上。

1.1.2 矽奈米線場效電晶體生物感測器

過去二十年來，科學家們致力於研究奈米材料，了解到當物質縮小到奈米尺 度時，表面積對體積比 (surface-to-volume ratio) 會大幅增加，使得奈米材料擁有 獨特的物理、化學以及電子性質[7]。而過去十五年來，科學家們更進一步將各 種不同的奈米材料 (例如：量子點、奈米粒子、奈米管[8]、奈米線[9]等) 作為感 測元件，設計出多種的感測器裝置，其中以一維半導體材料奈米管/奈米線場效 應電晶體 (nanowire/nanotube field-effect transistors, NW/NT-FETs) 應用在生物研 究上受到很大的矚目，這類一維半導體材料包含矽奈米線 (silicon nanowires, SiNWs)、奈米碳管 (carbon nanotubes, CNTs) 等，奈米管/奈米線場效應電晶體的 最大特色是擁有很高的靈敏度 (high sensitivity)，主要是因為一維奈米材料的尺 寸和生化分子 (例如：蛋白質、核酸、細胞以及病毒等等) 的尺寸大小相當[7]，

生化分子與奈米管/奈米線的交互作用可以導致 NW/NT-FETs 表面物理化學性 質 的 顯 著 改 變 ， 除 此 之 外 ， 奈 米 管/ 奈 米 線 擁 有 很 高 的 表 面 積 對 體 積 比 (surface-to-volume ratio)，使得 NW/NT-FETs 表面電位的微小改變就可以造成顯 著的電訊號變化。基於上述兩個因素，生化分子所施加的電場較能夠影響整個 NW 或 NT 內部的載子密度，而不像對二維平面 FET 的影響只侷限在表面的區 域，使NW/NT-FETs 具有高靈敏度的特性。

場效應電晶體 (field-effect transistor, FET) 是一種藉由電場效應，以控制半 導體內部電流的電子元件。一般而言，場效應電晶體為三電極系統，此三電極分 別是源極 (source, S)、汲極 (drain, D) 以及閘極 (gate, G)，其中源極和汲極以 p 型或是 n 型半導體通道作為連接，透過閘極施加不同強度的電場以調控半導體 通道的電導 (conductance，以 G 符號表之，為電阻之倒數)，故名場效應電晶體。

以 p 型半導體為例，當在閘極施加一負電壓時，將導致主要電荷載子 (電洞) 的 累積，使得電導上升；而在閘極施加一正電壓時，會導致電洞載子的減少，使電 導下降。

矽奈米線場效應電晶體 (silicon nanowire field-effect transistor, SiNW-FET) 生物感測器是以共價鍵 (covalent bond) 或是靜電作用力 (electrostatic force) 將 受體 (receptor) 修飾在矽奈米表面上，受體對於待測分子 (target molecule) 有高 度的選擇性與親和力 (affinity)，當受體與待測分子結合於矽奈米線之表面時，待 測分子所帶的電荷產生之電場類似閘極提供一電壓於矽奈米線場效應電晶體 (圖 1-1)。以 p 型矽奈米線場效應電晶體為例，說明其工作原理 (圖 1- 2)，當具 有正電荷的待測分子與固定於矽奈米線表面之受體分子結合時，具有正電荷的待 測分子所施加之電場，會導致矽奈米線內部的電洞載子的減少，使電導下降；反 之，若是具有負電荷的待測分子，其所施加之電場，則會導致矽奈米線內部的電 洞載子的增加，使電導上升。

與奈米碳管相較之下，矽奈米線具備許多的優勢，首先，矽奈米線的表面有 自然生成的二氧化矽作為絕緣層，當 SiNW-FET 在生理緩衝溶液下使用時，此 絕緣層可以避免漏電流的發生，且矽奈米線與常用的鎳或鈦金屬電極之間的接觸 為歐姆接觸，因此 SiNW-FET 的工作原理是單純的場效應。而奈米碳管的表面 缺乏絕緣層，且其與鎳或鈦金屬電極之間的接觸非歐姆接觸[10, 11]，使得 CNT-FET 的工作原理較為複雜，其電訊號改變同時由場效應[12]、電子轉移 (electron transfer)[12] 和蕭特基能障變化 (schottky barrier variation)[13] 所貢獻。

此外，矽奈米線通道內的載子特性可藉由摻雜 (doping) 不同的元素 (例如：磷 或硼) 來決定通道的載子種類，且可容易地調控任意摻雜濃度[14, 15]。

由於 SiNW-FET 具有免標記 (lable-free)、高選擇性 (excellent selectivity)、

高靈敏度 (high sensitivity) 與即時偵測 (real-time detection) 等特性[9]。近幾年 來，SiNW-FET 被廣泛地應用於生物醫學檢測上，成功建立出蛋白質[9, 16, 17]、

DNA[18]、腫瘤標誌物[19]與病毒[20, 21]的偵測方法，顯示出 SiNW-FET 提供 了一個實用且具有潛力的偵測平台[22]。

  圖 1-1 場效應電晶體奈米感測器之結構[23]。

  圖 1- 2 p 型奈米線場效應電晶體之工作原理[23]。

1.1.3 矽奈米線場效應電晶體的製備

製作 SiNW-FET 的方法主要分為兩種，第一種製作方法稱為 ”top-down”

(由上而下)，”top-down” 方法是結合微影製程與電子束技術在單晶矽晶片上進行 物理性蝕刻，以定義出 SiNW-FET 的圖形。第二種製作方法稱為 ”bottom-up”，

一般來說，此方法會先以化學氣相沉積法 (chemical vapor deposition, CVD) 合成 矽奈米線，接著將矽奈米線組裝於矽晶片上，並以光微影技術製作電極。

“Top-down” SiNW-FET

“Top-down” 方法是以各種技術在絕緣層覆矽 (silicon-on-insulator, SOI) 晶 圓上加工製作出 SiNW-FET。如圖 1- 3 所示，SOI 晶圓的結構包含三個部分：

矽晶圓基底、二氧化矽夾層 (厚度約 200-400 nm)、頂部矽層 (厚度約 50-100 nm)。

藉由反應性離子蝕刻 (reactive ion etching, RIE)、離子植入 (ion implantation)、電 子束微影製程 (electron-beam lithography) 和熱蒸鍍 (thermal evaporation) 等技 術在 SOI 晶圓上定義矽奈米線與電極，以製作出 SiNW-FET 裝置。在典型 的 ”Top-down” 製程中，第一步 (圖 1- 3 (i)) 是以離子植入法將頂部矽層低密度 摻雜硼或磷，決定矽奈米線為 p 型或 n 型半導體屬性；第二步 (圖 1- 3 (ii)) 以 光罩設計圖案定義出特定區域，並高密度摻雜此區域，製作出高導電度的源/汲 極區域；第三步 (圖 1- 3 (iii)) 為利用 RIE 法刻劃出微米尺寸的源/汲極；第四 歩 (圖 1- 3 (iv)) 是利用電子束微影製程和 RIE 法刻劃出奈米尺寸的矽奈米線；

最後，以熱蒸鍍法製作背向閘極 (back-gate)，並於 SiNW-FET 裝置上覆蓋一絕 緣層 (例如：Al2O3、SiO2或Si3N4)。

相較於 ”bottom-up” 方法，由於 ”top-down” 方法需仰賴高解析度的微影技 術來製作 SiNW-FET，使其製程較為複雜且需要更多昂貴的儀器。而其優點是使 用工業上標準的半導體技術來製作所需的 SiNW-FET 樣式，可任意控制矽奈米 線排列的位置，並且有效率地製作出高品質的 SiNW-FET。

  圖 1- 3 以 ”top-down” 方法製作 SiNW-FET 之流程圖[22]。

“Bottom-up” SiNW-FET

在以 ”bottom-up” 方法製作 SiNW-FET 的過程中，首先會以 CVD 方法合 成矽奈米線，接著可藉由各種不同的技術將所合成的矽奈米線排列於矽晶片上，

最後利用光微影製程 (photolithography) 與熱蒸鍍法完成 SiNW-FET 的製作。

圖 1- 4 描述 ”bottom-up” 方法製作 SiNW-FET 之流程，第一步 (圖 1- 4 (i)) 以 CVD 方法合成矽奈米線，是依據氣-液-固 (vapor-liquid-solid，簡稱 VLS) 之 生長機制，其中金奈米粒子作為生長矽奈米線的催化劑，合成出的矽奈米線直徑 大小取決於金奈米粒徑大小[24]，在生成矽奈米線的過程中通入 B2H6 或 PH3

以摻雜硼或磷，決定矽奈米線之半導體特性；第二步 (圖 1- 4 (ii)) 是以接觸轉印 法 (contact printing) 或其他技術使矽奈米線排列於矽基底上；第三步 (圖 1- 4 (iii)) 是先以旋轉塗佈法將兩層光阻 (分別為 LOR3A 和 S1805) 被覆於矽基底 上，藉由特定的光罩圖形曝光、除去照光後之光阻，定義出源/汲極圖案;第四步 (圖 1- 4 (iv)) 是以熱蒸鍍法鍍上金屬作為源/汲極；最後一步 (圖 1- 4 (v)) 是使 用去光阻液 (remover PG) 清除殘餘的光阻層，便完成 SiNW-FET 之製作。

相較於 ”top-down” 方法，”bottom-up” 方法只需花費較少的成本便可以合 成具有高結晶度、可隨意指定摻雜密度與容易調控直徑大小之矽奈米線。雖然 以 ”bottom-up” 方法可製作出高品質的 SiNW-FET，然而，由於無法有效控制排 列於矽基底上的矽奈米線之位置，使 SiNW-FET 的產率下降，導致此方法在產 業應用上受到限制。

圖 1- 4 以 ”bottom-up” 方法製作 SiNW-FET 之流程圖[22]。

1.2 研究動機與目的

1.2.1 利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測 PC12 細胞釋放之多

巴胺

多巴胺 (Dopamine，簡稱 DA)，全名為 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethylamine 是 一種結構簡單的有機化學分子，屬於單胺類 (monoamine) 物質中的兒茶酚胺類 (catecholamine)，其化學結構為一個胺基 (amine group) 藉由碳鏈連接到兒茶酚 (catechol) 分子上 (圖 1- 5)。

  圖 1- 5 多巴胺之化學結構。

DA 是一種神經傳遞物 (neurotransmitter)，在神經、心血管以及泌尿系統中 扮演許多重要的角色，調控著多種的生理活動。當哺乳動物缺氧時，頸動脈體中 的 glomus cell 會釋放多巴胺，藉由 DA 活化傳入神經纖維，將缺氧的訊息傳遞 給大腦，以加快呼吸的速率與血液循環，使身體裡的器官可以再度獲得氧氣[25]。

除了調控生理活動，DA 也與許多重要的疾病有關，位於大腦底部的基底核 (basal ganglia) 神經細胞主要分泌多巴胺，負責命令大腦指揮肌肉的運動，這類 神 經 細 胞 的 退 化 使 多 巴 胺 分 泌 量 不 足 而 導 致 帕 金 森 氏 症 (Parkinson’s disease)[26]。而腦內多巴胺分泌過量則會導致思覺失調症 (Schizophrenia)，此疾 病之患者具有幻聽、妄想以及思想紊亂等症狀[27]。在臨床檢驗上，檢測血液或 尿液中的多巴胺濃度可以用於診斷嗜鉻細胞瘤 (pheochromocytomas) 與副神經 節瘤 (paragangliomas)，這類癌症患者的血液或尿液中的 DA 濃度比正常人要高 出許多倍[28, 29]。因此，對於細胞的研究以及生物醫學診斷而言，能夠快速地 偵測並且準確定量 DA 是相當重要的課題。

在目前用以偵測 DA 的工具中，以具有快速與便利性等優勢的電化學方法

為主，然而 DA 的氧化電位與存在於尿液、血液以及中樞神經系統中的其他物 質之氧化電位有重疊，會造成偵測上的干擾，例如抗壞血酸 (ascorbic acid，簡稱 AA，亦稱為維生素 C)。另一方面，不論是帕金森氏患者的細胞外液，或是嗜鉻 細胞瘤或副神經節瘤患者之尿液/血液樣品中，其 DA 濃度皆低於 10^-10 M [30]。

然而，目前電化學方法所能達到的偵測極限為 10^-9 M (表 1- 1)，要以電化學方法 偵測到如此低的多巴胺濃度是相當困難的。因此，我們希望能以 SiNW-FET 為 基礎，設計出一個具有高偵測靈敏度和選擇性的 DA 感測器。

SiNW-FET 已成功應用在許多生化分子的偵測上，但大多數的偵測都是以帶 有大量電荷的蛋白質、DNA 等大分子，這些大分子具有較強的電場，因此容易 被 SiNW-FET 所偵測[31, 32]。而要以 SiNW-FET 偵測像 DA 這類帶電荷少的 小 分 子 相 對 上 較 為 困 難 ， 截 至 今 日 ， 只 有 少 數 的 小 分 子 已 被 成 功 由 SiNW/CNT-FET 所偵測，例如三磷酸腺苷 (adenosine-5’-triphosphate)[33]與麩胺 酸 (glutamate)[34] 。 在 本 研 究 中 ， 為 了 偵 測 DA ， 我 們 建 立 了 網 絡 式 (multiple-parallel-connected) 矽奈米線場效應電晶體，簡稱為 MPC SiNW-FET，

相較於單一通道之 SiNW-FET，MPC SiNW-FET 具有較高的靈敏度和較好的訊 雜比 (signal-to-noise ratio)，有助於偵測帶電荷少的小分子。

我們從文獻中，挑選出一個可選擇性與 DA 結合之去氧核醣核酸適體 (DNA-aptamer)[35, 36]，我們簡稱之 DA-specific aptamer (圖 1- 6)。以共價鍵將 其 固 定 在 MPC SiNW-FET 的 SiNW 表 面 上 ( 簡 稱 為 DA-specific aptamer/SiNW-FET)。DA-specific aptamer 為單股的 DNA，由 57 個核苷酸所 組成，序列為 5’-GTCTCTGTGTGCGCCAGAGAACACTGGGGCAGATATGGGC CAGCACAGAATGAGGCCC-3’，此序列一開始為 Mannironi 等人利用 SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 技術從一個大量、隨機 序列的 RNA 母體 (10¹⁴~10¹⁵) 中篩選而出[36]，後來 Walsh 與 DeRosa 將 RNA aptamer 轉換成 DNA 的形式，也就是以胸腺嘧啶 (Thymine, T) 取代尿嘧

啶 (Uracil, U)，並且證明轉換後的 DNA aptamer 亦同樣具有與 DA 選擇性結 合的功能[35]。被篩選出來的 DNA aptamer 會形成特定的結構，具有高度親合 力 (affinity) 與選擇性 (selectivity)，能與目標分子結合形成複合物 (complex)，

其與 DA 之間主要的作用力為氫鍵。相較於常被使用作為受體的蛋白質 (例如：

抗體或酵素)，DNA aptamer 具有許多的優點，例如其尺寸較小，當 DA 與之結 合時，可更靠近 SiNW 的表面，使 SiNW 感受到較強的電場，而產生較大的電 訊號改變。除此之外，DNA aptamer 具有較好的化學與熱穩定性，在變性 (denaturation) 之後，仍然能夠摺疊回特定的結構，恢復其與目標分子結合的能 力。

除了偵測 DA，我們將以 DA-specific aptamer/SiNW-FET 測試 DA-specific aptamer 與其他分子的結合能力，探討此 aptamer 對於 DA 的選擇性如何。這 些分子具有與 DA 相似的化學性質或是結構，包含抗壞血酸 (ascorbic acid, AA)，

其氧化還原電位與 DA 非常接近，為存在於血液與細胞外液中最主要的干擾物；

鄰苯二酚 (catechol, CT) 和苯乙胺 (phenethylamine, PEA) 的結構與 DA 相似；

酪 胺 酸 (tyrosine, TR) 為生物體合成 DA 的前驅物 (precursor)；腎上腺素 (epinephrine, EP) 以及正腎上腺素 (norepinephrine, NE) 與 DA 同屬於兒茶酚胺 類，兩者皆是人體中重要的神經傳導物質。我們期望建立一個具有高偵測靈敏度 和選擇性佳的多巴胺感測器，並進一步應用在細胞釋放 DA 之研究上。

對哺乳動物的細胞而言，足夠的氧氣是生存的必要條件，當環境中的氧氣不 足時，細胞為了能夠忍受缺氧 (hypoxia) 的環境而產生反應，例如神經細胞會釋 放神經傳導物質。PC12 細胞株來源於大鼠腎上腺髓質 (rat adrenal medulla) 的嗜 鉻細胞瘤 (pheochromocytoma)，其主要合成 DA 和 NE，在一些藥物的刺激下 會釋放出它們，其可經由神經生長因子 (nerve growth factor) 誘導分化為類神經 細胞，是常用於神經科學相關研究的體外模型。PC12 細胞在缺氧刺激下，會經 由胞吐作用 (exocytosis) 釋放出 DA，在這過程中牽涉到細胞內鈣離子濃度的上

升[37]。然而，在缺氧刺激使 PC12 細胞釋放 DA 的機制中 (圖 1- 7)，細胞內 鈣離子濃度的上升究竟是由於細胞外的鈣離子流入細胞內[38]，還是儲存在細胞 內胞器的鈣離子釋放出來所造成[39]，這部分的說法仍然是具有爭議性的。因此，

我們將利用 DA-specific aptamer/SiNW-FET 即時偵測缺氧刺激後的 PC12 細胞 釋放之 DA，並且試著去解答細胞內鈣離子的濃度上升是由哪個途徑所造成的。

Material Surface modification

Linear working range (M)

Detection limit (M)

Ref.

Glassy carbon

PET

Carbon fiber

ITO

Graphene

表 1- 1 比較不同的電化學多巴胺感測器之偵測極限。TNT：titanate nanotubes；

PET：polyethylene terephthalate；ITO：indium tin oxide；CNT：carbon nanotube。

圖 1- 6 DA-specific aptamer 的結構示意圖。DA-specific aptamer 的結構包含兩個 主要的stem-loop domains (Domain A 與 Domain B)，有 5 個核苷酸是與多巴胺結 合的位置，其中2 個核苷酸在 Domain A，3 個在 Domain B。兩個 loop 因為鹼基 配對而有交互作用，以藍色虛線表示。

圖 1- 7 在缺氧刺激下細胞釋放多巴胺之機制示意圖。在細胞釋放多巴胺的機制中，

細胞內鈣離子濃度的上升的原因，被推論為是由細胞外鈣離子流入 (實線箭頭)，

或是收集儲存於胞器內的鈣離子 (虛線箭頭)。MC: 粒線體; ER: 內質網。

1.2.2 利用修飾去氧核醣核酸適體之矽奈米線場效應電晶體偵測神經

肽 Y

神經肽Y (neuropeptide Y，簡稱 NPY) 是一種由 36 個胺基酸所組成的神經 胜肽，1982 年，Tatemoto 和 Mutt 從猪的大腦分離出 NPY，並且解開其序列 (Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg -Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2)[45, 46]。在 NPY 的結構中 (圖 1- 8)，N 端有 polyproline helix，C 端有 α-helix，

polyproline helix 會朝著 C 端的 α-helix 彎曲，形成髮夾狀結構，使之能與細胞 膜上特定的受體結合[47]。

NPY 在哺乳類動物體內扮演著神經傳遞物的角色，廣泛地表現在中樞與周 邊神經系統中，調控著各種的生理活動，例如：食物攝取、血壓、生理時鐘 (circadian rhythm)、焦慮與壓力反應。除此之外，NPY 也與許多疾病息息相關，

例如：創傷後壓力症候群 (posttraumatic stress disorder，簡稱 PTSD)，其是指人 在遭遇重大創傷後，其心理狀態產生焦慮性失調之病症，可能會造成此病症之經 驗包含身體或心靈上遭到威脅、嚴重物理性傷害 (例如：經歷嚴重的車禍、天然 災害、遭受暴力虐待或目睹親人的突然死亡)，根據研究指出當大腦中的 NPY 濃 度較低時，遭受創傷後的人們發展出 PTSD 的可能性會增加[48]。在臨床診斷方 面，NPY 可作為慢性疲勞症候群 (chronic fatigue syndrome，簡稱 CFS) 的生物 標記 (biomarker)，CFS 的病因複雜，非單一因素所引起，絕大部分的患者都與 工作緊張、壓力過大以及長期生活作息不正常等有關，其症狀有長期 (連續六個 月以上) 原因不明的疲勞、身體虛弱、肌肉疼痛、喉嚨痛與頭痛，且病患即使在 經過適當的睡眠後，仍無法改善這些症狀。相較於健康的人們，CFS 患者的血 液中被發現存在著較高濃度的 NPY[49]。因此，能夠快速地偵測並且準確定量 NPY，對於神經細胞的基礎研究以及生物醫學診斷是相當重要的課題。

immunosorbent assay，簡稱 ELISA) 與液相層析質譜儀 (Liquid chromatography–

mass spectrometry，簡稱 LC-MS/MS)，雖然 ELISA 與 LC-MS/MS 對於 NPY 都 有極佳的偵測靈敏度 (表 1- 2)，但兩者皆無法即時性地偵測 NPY，使得其在神 經細胞研究的應用上受到限制。因此，我們希望能以 SiNW-FET 為基礎，設計 出一個具有高偵測靈敏度、選擇性與可即時偵測的 NPY 感測器，並將其應用於 即時偵測細胞釋放神經傳遞物質 NPY。

為了使 SiNW-FET 可以選擇性地偵測 NPY，我們從文獻中[50]，挑選出一 個對 NPY 有適當的結合親和力與選擇性的 DNA-aptamer，稱之為 NPY-specific aptamer ， 其 為 單 股 DNA ， 由 80 個 核 苷 酸 所 組 成 ， 序 列 為 5’- AGCAGCACAGAGGTCAGATGCAAACCACAGCCTGAGTGGTTAGCGTATGT CATTTACGGACCTATGCGTGCTACCGTGAA -3’，是藉由 SELEX 技術所篩選 出來。根據文獻，此 NPY-specific aptamer 與 NPY 的解離常數為 300 ± 200 nM。

我們以共價鍵的方式將 NPY-specific aptamer 固定在 SiNW 的表面上，修飾後 的 SiNW-FET，簡稱之為 NPY-specific aptamer/SiNW-FET。

我們希望將 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 應用於即時偵測細胞釋放 NPY。我們使用 PC12 細胞株作為研究的模型，其來源於大鼠腎上腺髓質 (rat adrenal medulla) 的嗜鉻細胞瘤 (pheochromocytoma)，PC12 細胞會合成 DA 與 NPY 等神經傳遞物，在特定的刺激下，會經由胞吐作用 (exocytosis) 釋放出神 經傳遞物。我們將以 NPY-specific aptamer/SiNW-FET 量測 NPY 與 DA，測試 NPY-specific aptamer 對於 NPY 的選擇性，並且進一步即時偵測經缺氧刺激的 PC12 細胞所釋放之 NPY。

  圖 1- 8 神經肽 Y 之結構[51]

表 1- 2 比較不同分析方法量測 NPY 之偵測極限

Method Linear working 

range

Detection limit Ref.

ELISA

10^‐11‐10^‐8 M 17 pM [52]

LC‐MS/MS N.A. < 30 pM [53]

第二章 實驗方法

2.1 網絡式矽奈米線場效應電晶體的製作

我 們 利 用 “bottom-up” 製 程 方 法 製 作 網 絡 式 矽 奈 米 線 場 效 應 電 晶 體 (multiple-parallel-connected silicon nanowire field-effect transistor, 簡稱為 MPC SiNW-FET ) 晶片，製作程序包含金奈米粒子的合成、硼摻雜矽奈米線的合成以 及晶片電極的製作。我們將合成的金奈米粒子作為催化劑，以化學氣相沉積法合 成 SiNW，利用光學顯微鏡觀察奈米線合成的結果，接著以接觸轉印的方式將 SiNW 轉移到已製作外層電極的晶片上，再製作內層電極與進行熱退火 (thermal anealing) 處理，即完成晶片的製作，最後對 MPC SiNW-FET 元件進行電性量測 與分析，挑選出品質好的晶片進行實驗。

2.1.1 金奈米粒子的合成

金奈米粒子 (gold nanoparticles, Au NPs) 是合成 SiNW 所需的催化劑，其粒 徑大小會直接影響 SiNW 的直徑大小，因此我們希望合成直徑 20 nm 的 Au NPs，合成直徑小於 20 nm 之 SiNWs。我們以氧化還原法合成 Au NPs，其反應 式及部分產物如下所式：

HAuCl4(aq) + Na3C6H5O7(aq) → Au NPs (s) + CO2 (g) + HCOOH (aq) + … 其中四氯金酸 (HAuCl4) 是作為金的來源，而檸檬酸鈉 (Na3C6H5O7) 在反應中 扮演還原劑與分散劑的角色，反應時，檸檬酸根將四氯金酸 (三價金離子) 還原 成金原子，金原子便開始聚集成 Au NPs，而具負電荷的檸檬酸根離子 (C6H5O73-) 會吸附於 Au NPs 的表面，其表面因為具有負電性，故粒子間會產生負負相斥 的作用力，使其能穩定於溶液中。反應時，檸檬酸納的濃度會影響合成出的 Au NPs 粒徑大小，當檸檬酸納的濃度高時，因檸檬酸根離子的吸附，原子聚集成 粒子的時間變短，因此所得的粒徑較小，反之，檸檬酸納濃度低時，可以有較長

的時間聚集成粒徑較大的粒子。

金奈米粒子合成流程：

1. 藥品配製

3 mM 四氯金酸溶液：秤取0.51 g 四氯金酸溶解於 50 mL 去離子水中。

38.8 mM 檸檬酸鈉溶液: 秤取0.2 g 檸檬酸鈉溶解於 20 mL 去離子水中。

2. 取 5 mL 的 3 mM 四氯金酸溶液和 10 mL 去離子水加至 20 mL 樣品瓶中，

放入磁石攪拌子，放置加熱板上，一邊攪拌一邊加熱至沸騰。

3. 溶液沸騰後，加入 0.75 mL 檸檬酸鈉溶液，反應時間為 10 min。可觀察到溶 液顏色由透明黃色轉變為黑色，最後轉變為酒紅色。

4. 靜置冷卻後，放入4 ℃冰箱保存。

2.1.2 硼參雜矽奈米線的合成

我們是以化學氣相沉積 (chemical vapor deposition, CVD) 的方式，並以金奈 米粒子作為催化劑，經由氣相-液相-固相 (vapor-liquid-solid, VLS) 的生長機制合 成矽奈米線，VLS 生長機制最早在 1964 年由 Wagner 所提出[54]。

VLS 生長機制分為三個階段 (圖 2- 1)，首先 ，將金奈米粒子加熱到金與矽 的共熔溫度 (363 ℃) 以上，通入反應氣體 SiH4 後，SiH4 會吸附到金的表面，

並且受到金的催化而分解成矽原子和氫氣，此時矽原子溶入金奈米粒子形成液態 合金 (liquid alloy)。在第二階段中，持續通入反應氣體，矽原子繼續溶入金粒子 中，當達到過飽和 (supersaturation) 狀態，便有矽原子開始析出，此為成核 (nucleation) 的過程。成核後，持續通入 SiH4，會使得矽原子繼續溶入金粒子中，

接著在成核的固/液介面便會持續生長出單晶矽奈米線。在 CVD-VLS 生長過程 中，矽奈米線的直徑取決於金奈米粒子的直經大小。

合成矽奈米線時，我們會同時通入 diboran (B2H6) 氣體，以得到硼摻雜的矽 奈米線，並且藉由調整通入 B2H6 的流量，改變摻雜的密度，使矽奈米線的性質 達到最佳化。

圖 2- 1 (A) 以 VLS 機制合成矽奈米線示意圖。(B) 矽與金的二元相圖[55]。

硼參雜矽奈米線之合成步驟 (圖 2- 2)：

1. 將四吋矽晶圓切割成適當大小 (大約 3 cm x 1.5 cm) 的破片，依序以丙酮-異 丙醇-去離子水沖洗破片，再以氮氣吹乾。

2. 利用氧氣電漿 (100 W, 200 s) 清除破片表面的有機雜質。

3. 以微量吸管吸取 0.1% poly-L-lysine (w/v, Sigma) 滴在破片上，使溶液能完全 覆蓋表面，靜置 2 min，以去離子水清洗破片後，用氮氣吹乾表面。此時破片 表面因 poly-L-lysine 而為正電性。

4. 以微量吸管吸取自行合成之金奈米粒子水溶液，將其滴上並且完全覆蓋於破 片表面，靜置 10 s 後，以去離子水沖洗破片，再以氮氣吹乾表面。此時，以 靜電作用力將具有負電性的金奈米粒子吸附在表面有 poly-L-lysine 的破片 上。

5. 以氧氣電漿 (100 W, 5 min) 清潔修飾金奈米粒子的破片表面。

6. 將破片送入石英管，放置於高溫爐中心。

7. 開啟 dry pump 抽真空，將管內的氣體抽除乾淨，待壓力值下降到 0.02 torr 後，切換以 diffusion pump 抽真空 1 hr。

8. 流入 20 sccm 的高純度 Ar 氣體，設定 15 min 升溫至 460 ℃。

9. 當溫度達到穩定的 460 ℃ 時，通入 SiH4 (6 sccm) 和 B2H6 (12 sccm)，並調 整電動閥門，設定總壓為 25 torr。

10. 當所有氣體流量與石英管內壓力值穩定後，開始計時，合成時間約 15 min。

11. 合成時間完畢後，關閉 SiH4 和 B2H6 的閥門，持續通入 Ar 氣體，並以 pump 抽去管內的反應氣體，關閉高溫爐使石英管降溫。

12. 待溫度下降 70 ℃ 以下，以 Ar 氣體破真空並取出破片。

13. 以光學顯微鏡檢查矽奈米線的生長結果。

圖 2- 2 CVD 合成系統示意圖。使用 Ar、SiH4 和 B2H6 等三種氣體，以質量流 量控制器 (mass flow controller, MFC) 控制氣體流量，反應氣體流入置於高溫爐 (furnace) 中的石英管 (quarz tube) 進行反應，pump 抽除管內氣體。

2.1.3 晶片製程

晶片的製程依序可分為外層電極、矽奈米線的接觸轉印、內層電極以及熱退 火。首先，我們以黃光微影技術 (photolithography) 在矽晶片上製作好外層電極，

接著利用接觸轉印的方式將矽奈米線轉移到欲製作內層電極處，轉印後，以光學 顯微鏡觀察矽奈米線數量，達一定數量便可進行內層電極的製作。同樣以黃光微 影技術完成內層電極，為了使內層電極與矽奈米線接觸的更好，會以氫氟酸除去 奈米線表面的二氧化矽，再鍍上電極。最後將晶片進行熱退火處理，使電極與奈 米線形成化合物，而達到歐姆接觸 (Ohmic contact)。

外層電極製作流程：

1. 以氧氣電漿 (100 W, 200 s) 清潔四吋矽晶圓表面，去除表面的有機物。

2. 以旋轉塗佈機將 LOR5B 光阻塗佈於晶圓表面，並以加熱板 185 ℃ 烘烤 5 min，待冷卻後，再塗佈 S1813 光阻，並以 115 ℃ 烘烤 1.5 min。徒步完成 後，光阻 LOR5B 和 S1813 的厚度各約為 300 nm 和 500 nm。

3. 以光罩對準機 (mask aligner) 將外層電極的光罩 (圖 2- 3) 對準於晶圓上後，

以波長範圍 350 ~ 430 nm 的光曝光 8.5 s。

4. 將晶圓浸泡到顯影液 (MF-319, Shipley) 中，待約 1 min 後，圖案顯現，以去 離子水清洗並用氮氣吹乾。

5. 以氧氣電漿 (30 W, 1 min) 清潔晶圓表面殘留的光阻。

6. 將晶圓放入蒸鍍機 (evaporator) 的腔體中，抽真空至 10^-7 torr 以下後，開始 蒸鍍金屬電極，第一層為鉻金屬 (膜厚約 5 nm)，第二層鍍上金金屬 (膜厚約 60 nm)。

7. 將鍍上金屬的晶圓浸泡到 PG remover 中將光阻徹底清除，若清除不夠乾淨，

將溶液加熱到 60 ℃。最後以丙酮和乙醇清洗表面並用氮氣吹乾。

8. 最後將晶圓塗佈一層 S1805 光阻作為保護層，並使用晶圓切割機，將晶圓上 的電極陣列切割成 14 mm x 14 mm 的晶片，即完成外層電極的製作。

  圖 2- 3 MPC SiNW-FET 之外層電極光罩設計圖。其尺寸為 14 mm x 14 mm，中 間的兩個長方形 (300 μm x 240 μm) 為 liquid gate，外部的 12 個長方形 (1.5 mm x 1.3 mm) 為六組源-汲極電極的外部電極，兩個正方形 (1.5 mm x 1.5 mm) 為 liquid gate 的外部電極，十字形的圖案用來當作光罩對準的標記。

矽奈米線的接觸轉印 (圖 2- 4)：

1. 將含有矽奈米線的破片切割成適當大小後，以氮氣槍輕吹表面，去除因切割 表面所產生的碎屑。

2. 將破片黏貼於工具上，將含有奈米線的那一面與已製作好外層電極的晶片接 觸，並以適當力道移動工具，使矽奈米線得以轉印到晶片表面的欲製作內層電 極處。

3. 移開破片與工具，即完成接觸轉印步驟。

  圖 2- 4 接觸轉印矽奈米線之流程圖。

內層電極製作流程：

1. 利用旋轉塗佈機將 LOR5B 光阻塗佈到晶片上，以 185 ℃ 烘烤 5 min，接     著塗佈 S1813 光阻，並以 115 ℃ 烘烤 1.5 min。

2. 以光罩對準機 (mask aligner) 將內層電極的光罩 (圖 2- 5) 對準於晶片上後，

以波長範圍 350 ~ 430 nm 的光曝光 8.5 s。

3. 將晶片浸泡到顯影液 (MF-319, Shipley) 中，待約 1 min 後，圖案顯現，以去 離子水清洗並用氮氣吹乾。

4. 以氧氣電漿 (30 W, 1 min) 清潔晶片表面殘留的光阻。

5. 將晶片浸泡於氫氟酸 (buffer of oxide etching, BOE) 約 5 s，用去離子水 清洗並以氮氣吹乾。

6. 迅速將晶片放入蒸鍍機的腔體中，抽真空至 10^-7 torr 以下後，開始蒸鍍金屬 電極，第一層為鎳金屬 (膜厚約 70 nm)，第二層鍍上鋁金屬 (膜厚約 100 nm)。

7. 將鍍上金屬的晶片浸泡到 PG remover 中將光阻徹底清除，若清除不夠乾淨，

將溶液加熱到 60 ℃。最後以丙酮和乙醇清洗表面並用氮氣吹乾，即完成內層 電極的製作。

  圖 2- 5 MPC SiNW-FET 之內層電極之光罩設計圖。內層電極設計圖中，有六組 源-汲極電極，其中右邊兩組為一源極對應一汲極的設計 (黃色框)，中間兩組為 七源極與八汲極互相交錯的設計 (寬 25 μm) (藍色框)，左邊兩組為四源極與四 汲極互相交錯的設計 (寬 45 μm) (綠色框)。

熱退火 (thermal annealing) ：

完成內層電極後，將晶片置於退火爐 (ULVAC-RIKO MILA-3000)，抽真空 至 100 torr 以下後，通入 forming gas (10% H2/90% N2)，升溫至 360 ℃，持續 2 min，即完成熱退火。此步驟是為了使鎳金屬電極與矽奈米線形成歐姆接觸。

2.1.4 元件電性量測

完成MPC SiNW-FET 的製作後，我們會先在空氣下量測各別元件的電阻以 及源-汲極電流對偏壓 (Isd-Vsd) 的曲線，確認金屬電極與矽奈米線為歐姆接觸後，

在 0.1x PBS 溶液中，量測元件的源-汲極電流對閘極電壓 (Isd–Vg) 曲線，選出 跨導 (Transconductance) 500 nS 以上的元件來進行實驗。

I

-V

量測系統 (圖 2- 6)：

Isd-Vsd量測系統包含探針台 (probe station) 與數位型多功能三用電表(digital multimeter, Keithley 6487)，圖 2- 7 為量測系統示意圖，其中 Keithley 6487 作為 電壓源並且量測電流，Labview 程式控制量測系統以及紀錄訊號。量測時，偏壓 Vsd 掃描範圍為 200 mV 到 -200 mV。

  圖 2- 6 (A) Isd-Vsd量測系統 (B) 晶片與探針台。

  圖 2- 7 Isd-Vsd量測系統示意圖。

I

-V

量測系統：

在量測 I

2- 8 (A))將所選元件之外層電極與電路板上的電極連接，接著將一感測溶液槽架

  圖 2- 8 (A) 打線機 (B) 感測溶液槽實驗裝置。

Isd-Vg 量測系統示意圖如圖 2- 9 所示，利用鎖相放大器 (Lock-in amplifier, Stanford Research SR830) 擷取訊號，其能鎖定電路中特定的相位與頻率，過濾 其他的雜訊並且得到正確的訊號，白金電極作為閘極浸泡到樣品溶液中，藉由 Labview 程式負責控制資料擷取卡 (DAQ card) 施加閘極電壓並且記錄訊號。量 測時，鎖相放大器的參數設定為 Vsd = 10 mV、modulation frequency = 79 Hz、time constant = 100 ms，閘極電壓 Vg 掃描範圍為 200 mV 到 -200 mV。

  圖 2- 9 Isd-Vg 量測系統示意圖。

2.1.5 感測溶液槽的製備

由於進行生物感測實驗時是在液相環境中，為了避免樣品溶液接觸到未經絕 緣層覆蓋的外層電極部分，我們在晶片上架設一個感測溶液槽來隔離。感測溶液 槽 的 製 作 是 將 polydimethylsiloxane (PDMS, 喬 越 實 業 有 限 公 司 ) 之 A 劑 (Sylgard-184 silicone elastomer) 和 B 劑 (Sylgard-184 silicone elastomer curing agent) 以體積比 10:1 的比例混和均勻後，倒入以培養皿盛裝之母模中，利用真 空幫浦抽氣，去除因攪拌所產生之氣泡，抽氣至氣泡完全消失後，將其放入烘箱 中，以 80 ℃ 烘烤約 15 min (烘烤時間愈長，PDMS 的硬度會愈高)，待冷卻後，

切割成適當大小，即完成感測溶液槽的製作。

感測溶液槽母模的製作是將 200 μl 的 tip 直立在培養皿中所完成，tip 底 部的外徑約為 7 mm。製作完成的感測溶液槽，其底部半徑、長、寬和高各約為 7 mm、11 mm、9 mm、2.5 mm (圖 2- 10 (b))。

  圖 2- 10 (A) PDMS 化學結構式 (B) 感測溶液槽。

2.2 利用超靈敏矽奈米線場效應電晶體偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之多巴胺

2.2.1 矽奈米線表面修飾

我們以兩種化學鍵結分子將 DA-specific aptamer 以共價鍵固定在 SiNW 的 表 面 上 ， 修 飾 過 程 共 有 三 個 步 驟 。 第 一 步 是 在 矽 奈 米 表 面 上 修 飾 3-aminopropyl trimethoxysilane (APTMS, Sigma-Aldrich) 與 propyl trimethoxysilane (PTMS, Sigma-Aldrich) 這兩種化學鍵結分子，APTMS 的兩端具 有不同的官能基，一端為甲氧基 (-OCH3)，另一端為一級胺基 (-NH2)，而 PTMS 的兩端則分別為甲氧基與甲基 (-CH3)，APTMS 和 PTMS 的甲氧基會與矽奈米 線表面的矽醇基 (Si-OH) 反應產生鍵結，形成自組裝單分子膜 (self-assembled monolayers, SAMs)，此時矽奈米線表面有一級胺基，可作為受體與矽奈米線表面 的連結。加入 PTMS 的目的是為了調整矽奈米線表面的 APTMS 密度，以避免 後續修飾到矽奈米線上的受體與受體之間的立體阻礙 (steric hindrance)，彼此可 能會因為交纏在一起，而無法折疊成正常的形狀，進而影響偵測靈敏度。另一方 面，PTMS 填補空隙，可避免矽奈米線表面與待測物或干擾物有非選擇性的交互 作用 (non-specific interaction)。第二步是修飾 3 maleimidobenzoic acid N-hydroxy succinimide ester (MBS, Sigma-Aldrich) 於 ATPMS 上，MBS 與 APTMS 的一級 胺基反應後形成醯胺鍵。最後一步是修飾 DA-specific aptamer，我們所購買的是 5’ 端以雙硫鍵連接的 DNA 二聚體 (disulfide DNA-dimer, 生工有限公司)，因 此先以 dithiothreitol (DTT, J. T. Baker) 切斷雙硫鍵，使 DNA-aptamer 的硫醇基 可與 MBS 的 maleimide group 反應形成鍵結，藉此將 DA-specific aptamer 固 定在矽奈米線表面 (圖 2- 11)。

  圖 2- 11 DA-specific aptamer 固定化之流程圖。

1.修飾 APTMS 與 PTMS

將製作好的 bare SiNW-FET 晶片依序以丙酮-異丙醇-去離子水沖洗並以氮 氣吹乾，將晶片浸泡於含有 0.2 vol % APTMS 與 0.8 vol % PTMS 之 99.5% 乙 醇溶液中，反應 15 min 後，以加熱板 110 ℃ 烘烤 10 min。加熱是為了使 APTMS 和 PTMS 形成良好的自組裝單分子膜。

2. 修飾 MBS

將已修飾 APTMS 與 PTMS 之 SiNW-FET 晶片浸泡於 1 mM MBS 溶液 (溶於 1:9 (v/v) 的 DMSO 和 1x PBS)中 30 min，修飾完成後，以去離子水沖洗 晶片表面，再以氮氣吹乾。

3. 修飾 DA-specific aptamer

配製含有 1 μM DA-specific aptamer 與 16.7 mM DTT 之 1x PBS 溶液，將 已修飾 MBS 之晶片浸泡於此溶液中 1 hr，修飾完成後，以去離子水沖洗晶片 表面，再以氮氣吹乾。

我 們 另 外 購 買 3’ 端 修 飾 有 Fluorescein isothiocyanate (FITC) 的 DA-specific aptamer，簡稱為 FITC-aptamer，利用螢光影像來證明此修飾方法是

否能成功將 DA-specific aptamer 固定在 SiO2/Si 基板上。FITC 是一種螢光基團，

其最大吸收波長為 495 nm，最大放光波長為 520 nm。

2.2.2 多巴胺與其他分子之偵測

此實驗分為兩個部分，第一個部分是以修飾 DA-specific aptamer 之 MPC SiNW-FET 偵測多巴胺 (DA)、抗壞血酸 (AA)、鄰苯二酚 (CT)、苯乙胺 (PEA)、

酪 胺 酸 (TR) 、 腎 上 腺 素 (EP) 以 及 正 腎 上 腺 素 (NE) ， 探 討 這 些 分 子 與 DA-specific aptamer 之間的結合親和力 (binding affinity)。第二個部分是以僅修 飾 PTMS 之 MPC SiNW-FET 偵測上述七種分子，做為控制組實驗。

實驗時，我們將欲偵測的分子以 0.1 倍磷酸鹽緩衝溶液 (0.1x phosphate buffer saline, 0.1x PBS, 含有 13.7 mM NaCl、 270 μM KCl、1 mM Na2HPO4 與 200 μM KH2PO4，pH 7.2) 配製成所要的濃度，吸取所調配之樣品溶液 100 μl 滴 在晶片上，利用 2.1.4 元件電性量測節所述之 Isd-Vg 量測系統進行偵測，掃 描並記錄 Isd-Vg 曲線。鎖相放大器的參數設定為 Vsd = 10 mV、modulation frequency = 79 Hz、time constant = 100 ms，閘極電壓 Vg 掃描範圍為 200 mV 到 -200 mV。實驗完成後，處理數據並利用 Langmuir adsorption isotherm model 求 出解離常數 (dissociation constant, Kd)。

緩衝溶液的選擇：

SiNW-FET 的偵測原理是基於目標分子與受體結合時，目標分子的電荷改變 矽奈米線的表面電位，進而改變矽奈米線中的載子濃度，使偵測的電訊號改變。

一般生物感測實驗會在生理緩衝溶液中進行，而緩衝溶液中含有高濃度的鹽類，

由於靜電吸引力，這些離子會在帶電荷的目標分子周圍形成電雙層 (electrical double layer)，遮蔽目標分子所產生的電場，此現象即為所謂的 Debye screening，

目標分子的電位 V(r) 會隨著距離以指數方式下降，可表示為 V r ^/ ，r 為 目標分子與受體之結合位置 (binding site) 到矽奈米線表面的距離，λ 為 Debye length，其定義如下列公式：

λ ε ε k T 2N e I

為真空的介電常數；ε 為溶液的介電常數；k 為波茲曼常數；T 為絕對溫 度；N 為亞佛加厥常數；e 為基本電荷 (1.6 x10^-19 C)；I 為溶液中電解質的離 子強度，其定義如下列公式：

I 1

2 c z

c 是離子 i 的莫耳濃度， 是離子 i 所帶的電荷數。λ 可經過換算改寫為下列 公式：

λ 1

8π N I 其中 為 Bjerrum length (0.7 nm)。

由上述的公式可知，當溶液的離子強度愈高，λ 會愈短，造成的遮蔽效應 會更加嚴重，導致所偵測到的電訊號變化較小，降低矽奈米線場效應電晶體的偵 測靈敏度，因此我們會根據目標分子與受體之結合位置到矽奈米線表面的距離，

選擇適當的生理緩衝溶液進行實驗，由於 DA-specific aptamer 與 DA 之結合位 置到矽奈米線表面的距離約為 3 nm，我們選擇在 0.1x PBS 溶液 (λ = 2.4 nm) 下進行實驗。

PBS (pH 7.2) (nm)

x1 0.7 150

x0.1 2.4 15

x0.01 7.4 1.5

表 2- 1 不同濃度磷酸鹽緩衝溶液的 Debye length 和離子強度。

樣品溶液準備：

將欲偵測的分子溶解於 0.1x PBS (pH 7.2)，並以稀釋的方式配製不同濃度的 樣品溶液。所配製的多巴胺濃度為 0.1 pM、0.3 pM、1 pM、3 pM、10 pM、30 pM、

100 pM、300 pM、1 nM、3 nM、10 nM、30 n 以及 100 nM；抗壞血酸濃度為 1 μM；鄰苯二酚濃度為 1 μM；苯乙胺濃度為 1 μM；酪胺酸濃度為 1 μM；腎 上腺素濃度為 1 pM、3 pM、10 pM、30 pM、100 pM、300 pM、1 nM、3 nM、

10 nM、30 n 以及 100 nM；正腎上腺素濃度為 0.65 pM、2 pM、6.5 pM、20 pM、

65 pM、200 pM、650 pM 、2 nM、6.5 nM 以及 20 nM。

2.2.3 偵測缺氧刺激下的 PC12 細胞釋放之多巴胺

我們將 PC12 細胞培養在 DA-specific aptamer/SiNW-FET 晶片上，使用 I-t 量測系統即時偵測 PC12 細胞在缺氧環境的刺激下，釋放 DA 所造成的電訊號 變化。此實驗分為兩個部份，第一個部分要證明 DA-specific aptamer /SiNW-FET 可以成功偵測到 PC12 細胞在缺氧刺激下所釋放出的 DA，以不同濃度的缺氧 緩衝溶液 (C reduced buffer) 刺激 PC12 細胞，量測其釋放出的 DA。第二個 部分是要探討在缺氧刺激下 PC12 細胞釋放出 DA 的機制中，細胞內鈣離子濃 度的上升是由細胞外的鈣離子流入細胞內所造成，還是收集儲存在細胞內胞器的 鈣離子，導致細胞內鈣離子濃度上升。實驗時，加入 Cd²⁺ 離子 (1 mM CdI2)將 Ca²⁺ 離子通道阻塞住，使鈣離子無法經由鈣離子通道從細胞外流到到細胞內，

再以缺氧緩衝溶液刺激 PC12 細胞，量測其是否釋放出 DA。

PC12 細胞株培養：

PC12 細胞株來源於大鼠腎上腺髓質 (rat adrenal medulla) 的嗜鉻細胞瘤 (pheochromocytoma)，培養在 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (含有 10% 馬 血清與 5% 胎牛血清)，37℃，含有 10% CO 之大氣中，每兩天更換一次培養 液。要進行細胞實驗的當天，加入不含鈣離子與鎂離子的生理緩衝溶液使細胞懸 浮於培養液中，以離心機使細胞沉降，倒出上清液，加入適量的培養液，調整適 當的細胞密度，將含有 PC12 細胞的培養液加至 DA-specific aptamer/SiNW-FET 晶片上的感測溶液槽中，在 37℃ 下，靜置 2 小時，使細胞沉降在晶片上。進 行電訊號量測實驗前，以 1x PBS 溶液輕輕地置換培養液三次，清除細胞的代謝 物。

缺氧緩衝溶液準備：

以玻璃樣品瓶盛裝 15 ml 0.1x PBS 溶液，將與氮氣管線連接的鋼針浸入